Makala
Täze metilen gögi we retikulositleri boýamak: aýratyn boýag we janly öýjük usuly
Bir talyp retikulositleri sanamaga taýýarlanýar, metilen gögüni sargyt edýär, ony gan bilen garyşdyrýar we tas hiç zat görmeýär. Onuň kursdaşy bolsa ýüzünde täze metilen gögi diýlip ýazylan çüýşäni ulanýar we gyzyl gan öýjükleriniň bir böleginiň içinde aýdyň gök sapajyklary görýär. Birinji talyp ikinji çüýşedäki boýagyň has täze ýa-da has konsentrirlenen bolandygyny çaklaýar. Emma bu ikisiniň hiç biri-de dogry däl. Ol çüýşede başga molekula bar.
Bu ugurdaky bulaşyklyklaryň köpüsiniň düýbünde hut şu düşünje ýalňyşlygy ýatyr. Ady täze metilen gögüniň metilen gögüniň kämilleşdirilen tapgyrydygyny aňladýan ýaly görünýär. Himiýa bolsa başga zady görkezýär. Täze metilen gögi N — öz Colour Index belgisi, öz orun çalyşma gurluşy we gematologiýada öz standartlaşdyrylan wezipesi bolan aýratyn fenotiazin boýagydyr. Bu tapawut aýdyň bolandan soň, usulyň galan bölegine düşünmek aňsatlaşýar: boýalýan mahaly öýjükleriň näme üçin janly bolmalydygy, nämäniň retikulosit hökmünde hasaplanýandygy, Heinz bedenjikleriniň bu ýerde nähili orun tutýandygy we brilliant krezil gögüniň haçan ulanylýandygy.
Gysga jogap
Gematologiýa reagenti bolan täze metilen gögi N, adatça, täze metilen gögüniň PubChem ýazgysynda Basic Blue 24 hökmünde kesgitlenýär: C.I. 52030, CAS 1934-16-3, formulasy C18H22ClN3S. Adaty metilen gögi bolsa öz PubChem ýazgysynda metiltioniniý hlorid, Basic Blue 9 hökmünde görkezilýär: C.I. 52015, CAS 61-73-4, formulasy C16H18ClN3S. Gurluş taýdan täze metilen gögünde halkada iki metil topary we etilamino gapdal zynjyrlary bar, metilen gögünde bolsa dimetilamino toparlary ýerleşýär. Bu tapawut boýalyş häsiýetini üýtgedýär. Gematologiýa kitaplarynda adaty metilen gögi retikulositleri boýamak üçin deňeşdirilende gowşak boýag, täze metilen gögi bolsa has goýy we birmeňzeş boýaýan boýag hökmünde häsiýetlendirilýär; bu deňeşdirme ScienceDirect-iň täze metilen gögi baradaky mowzugynda jemlenýär.
Hawa, täze metilen gögi suprawital boýagdyr. NCBI-niň suprawital boýamagyň ýörelgelerine synynda kesgitlenişi ýaly, suprawital boýamak janly öýjükleri bedenden aýrylandan soň, ýöne fiksasiýadan öň boýamagy aňladýar. Täze metilen gögi-de, brilliant krezil gögi-de şu topara girýär, CLSI-niň retikulosit standarty bolsa täze metilen gögüni gönüden-göni suprawital boýag hökmünde öz içine alýar. Talyplar käwagt muny fiksirlenen çalgylaryň Romanowsky usuly bilen boýalmagy bilen bir hatarda goýýarlar. Emma bu düşünje bu ýerde işlemeýär. Ilki fiksasiýa edilse, usul işlemeýär.
Meňzeş boýag atlaryny öwrenýän okyjylar üçin metil gögi bilen metilen gögüniň tapawudy anion triarilmetan boýagy bilen kation fenotiazin maşgalasynyň arasynda ýüze çykýan başga we has uly bulaşyklygy düşündirýär. Laboratoriýada boýamagyň umumy syny suprawital işi fiksirlenen çalgy usullarynyň arasynda ýerleşdirýär, gan öýjükleriniň morfologiýasy baradaky gollanma bolsa retikulositlere baha bermegiň öýjükleri has giňişleýin tapawutlandyrmakdaky ornuny görkezýär.
| Reagent | Himiki häsiýeti | C.I. / CAS | Retikulositler bilen işlemekdäki wezipesi |
|---|---|---|---|
| Täze metilen gögi N | Etilamino toparly, halkasynda iki metil topary bolan fenotiazin | C.I. 52030 (Basic Blue 24); hlorid görnüşi üçin CAS 1934-16-3 | El bilen ýerine ýetirilýän standartlaşdyrylan suprawital boýag, deňeşdirmek üçin ileri tutulýan usul |
| Adaty metilen gögi | Bis(dimetilamino) fenotiazin (metiltioniniý hlorid) | C.I. 52015 (Basic Blue 9); CAS 61-73-4 | Retikulositleri gowşak boýaýar, onuň ornuny tutup bilmeýär |
| Brilliant krezil gögi | Oksazin boýagy, düzümi üpjün edijä görä üýtgeýär | C.I. 51010; duz görnüşine baglylykda CAS 81029-05-2 ýa-da 10127-36-3 | Ulanylmaga kabul ederlikli suprawital boýag, has az birmeňzeş boýaýar, sazlaşdyrylan deňeşdirme usuly däl |
Katalog bilen bagly bir duýduryş: täze metilen gögüniň sink hlorid bilen goşa duzunyň aýratyn görnüşi CAS 6586-05-6 belgisi bilen bar. Şonuň üçin usullar bölüminde diňe umumy ady däl, eýsem duz görnüşi we üpjün ediji hem görkezilmelidir.
Suprawital boýamak hakykatda näme edýär
Retikulosit — ýadrosyny ýitiren, ýöne ribosomal RNK-nyň galyndylaryny saklaýan ýaş gyzyl gan öýjügidir. Boýalmadyk çyg preparatda şol RNK görünmeýär. Suprawital boýag janly öýjüge girip, RNK-ny gök däneler we sapajyklar görnüşinde çökdürýär ýa-da jemleýär; ýag immersiýasynda görünýän tor-sapajykly material şudur. Diýmek, bu tor reňk berilmegine garaşýan öňünden emele gelen süňňi däl-de, boýamagyň önümidir. Şonuň üçin protokolyň üýtgeýän şertleri — boýagyň konsentrasiýasy, bufer, gan bilen boýagyň gatnaşygy, temperatura we wagt — boýagyň ady ýaly möhümdir.
Munuň amaly netijesi işleriň berk yzygiderliligidir: ilki gan lagtalanmasyna garşy serişde goşulan gany boýag bilen garyşdyryň, inkubasiýa ediň, soň çalgy taýýarlap, ony fiksirlemän we goşmaça kontrast boýag ulanman gözden geçiriň. Boýamazdan öň fiksasiýa etmek ýa-da solgun sapajyklary örtýän goşmaça kontrast boýag ulanmak sanamagyň esaslanýan maglumatyny ýok edýär.
Täze metilen gögi bilen retikulositleri boýamagyň iş protokoly
Ýeke-täk ähliumumy düzüm ýok, şonuň üçin ulanylan düzümi görkeziň. Resminamalaşdyrylan üç görnüş bu dürlüligi görkezýär.
Klassiki Brecher görnüşli usulda kaliý oksalatly takmynan 0.5 göterim täze metilen gögi ulanylýar; ol gowy garyşdyrylan EDTA gany bilen deň göwrümlerde garyşdyrylyp, otag temperaturasynda takmynan 10–15 minut inkubasiýa edilýär. Ýuwaşlyk bilen gaýtadan garyşdyrylandan soň, inçe pahnagörnüşli çalgylar taýýarlanýar, howada guradylýar we fiksirlenmän 100x ýag immersion obýektiwinde gözden geçirilýär. NCBI-niň retikulositleri sanamak usuly bu iş yzygiderliligini we onda ulanylýan sanama çarçuwasyny beýan edýär.
Dacie we Lewis görnüşinde sitratly duz erginindäki 1.0 göterim täze metilen gögi ulanylýar; ol ganyň 2–4 göwrümi bilen garyşdyrylýar we çalgy taýýarlamazdan öň 37 C temperaturada 15–20 minut saklanýar. CLSI H44 usulyny sazlaşdyrmagyň ýakynda geçirilen bir amaly ýerine ýetirilişinde pH 7.4 bolan fosfat buferli duz ergininde has pes konsentrasiýaly, 0.1 göterim ergin ulanyldy; inkubasiýa 20 C temperaturada 10 minut dowam etdi we fiksasiýa geçirilmedi. Bu barada 2026-njy ýyldaky NMB sazlaşdyrma barlagynda habar berilýär.
Sanamagyň düzgünleri ähli görnüşlerde birmeňzeşdir. Öýjügiň içinde azyndan iki aýry gök boýalan däne ýa-da sapajyk bölegi bar bolsa, ony retikulosit hökmünde hasaplaň; bu düzgün ýeke-täk boýag çökündisini hasaba goşmaýar. Adaty işde azyndan 1,000 gyzyl gan öýjügini sanaň we retikulositleri göterim görnüşinde görkeziň. Göterim pes bolanda, statistika has köp öýjügi sanamagy talap edýär. CLSI H44 usulyýetine syn De Gruyter-däki CLSI H44 synynda retikulositler takmynan 1 göterim bolanda, sanama üýtgeýjiligini 5 göterime ýetirmek üçin takmynan 4,400 öýjügi sanamagyň gerekdigini belleýär. Miller okulýar diski köp sanly öýjügi sanamagy amaly taýdan ýeňilleşdirýär. Boýagy süzüň ýa-da täzeden taýýarlaň, sebäbi çökündi däneli goşundylara meňzeýär.
Şol bir preparatda Heinz bedenjikleri
Şol bir suprawital çalgy Heinz bedenjiklerini hem görkezip biler; olar galyndy RNK däl-de, oksidlenen we denaturirlenen gemoglobiniň toplumlarydyr. Täze metilen gögi bilen taýýarlanan preparatlarda olar köplenç ýeke we membrananyň golaýynda ýerleşýän tegelek bedenjikler hökmünde görünýär hem-de tor-sapajykly materialdan has açyk gök reňke boýalýar. Olar fiksasiýadan we goşmaça kontrast boýagdan soň ýaramaz saklanýar, şonuň üçin fiksirlenmedik çalgyny gözden geçiriň. Ýakynda ulanylan bir protokolda 20 mikrolitr EDTA gany 20 mikrolitr 1 göterim täze metilen gögi bilen garyşdyrylyp, 15 minut inkubasiýa edildi we 250 eritrositiň arasynda Heinz bedenjikleri bolan öýjükleriň sany kesgitlenildi. Bu usul ony beýan edýän PMC barlagynda görkezilýär.
Iki tapawut nädogry düşündirişleriň öňüni alýar. Birinjiden, ScienceDirect-iň Heinz bedenjikleri baradaky mowzugynda bellenilişi ýaly, metil melewşe we kristal melewşe Heinz bedenjiklerini täze metilen gögünden has güýçli boýaýar. Täze metilen gögi retikulositler bilen Heinz bedenjiklerine bilelikde baha berlende amatly saýlawdyr, ýöne diňe Heinz bedenjiklerini boýamak üçin iň güýçli boýag däldir. Ikinjiden, alfa-talassemiýanyň göterijiligindäki HbH goşundylary suprawital boýamadan soň öýjügiň hemme ýerinde köp sanly ownuk nokatlary emele getirýär, klassiki Heinz bedenjikleri bolsa has az, has uly bolýar we köplenç membrana bilen baglanyşyklydyr. Üçünji meňzeş görünýän zat boýag çökündisidir: ol öýjükleriň fokus tekizliginiň daşynda ýerleşýär we görüş meýdanlarynyň arasynda üýtgeýär.
Brilliant krezil gögi bilen täze metilen gögüniň deňeşdirilmegi
Iki boýag hem retikulositler üçin suprawital boýagdyr, ýöne standartlaşdyrmak olaryň birini ileri tutýar. Gematologiýada standartlaşdyrmak boýunça halkara geňeş bilen bilelikde işlenip düzülen we CLSI H44 standart sahypasynda görkezilen CLSI H44-A2 retikulosit usuly EDTA ganynyň täze metilen gögi bilen boýalmagyny el bilen ýerine ýetirilýän deňeşdirme usuly hökmünde kesgitleýär. Klassiki gematologiýa okuwlary hem görünüş barada şol pikirdedir: täze metilen gögi sapajyklary has goýy we birmeňzeş boýaýar, brilliant krezil gögünde bolsa tapgyrlaryň we nusgalaryň arasynda has köp üýtgeýjilik bolýar.
Bu ornunyň çäklendirmesi hem bellenmelidir. ICSH-niň analizatorlara baha bermek boýunça gollanmasy täze metilen gögi bilen el arkaly geçirilýän mikroskopiýany etalon deňeşdirme çemeleşmesi hökmünde kabul edýär, ýöne ony subýektiw we deňeşdirilende takyklygy pes diýip häsiýetlendirýär; mümkin bolan ýerlerde akym sitometriýasyna esaslanýan etalon usullar ileri tutulýar. 2022-nji ýylda 100 nusganyň deňeşdirilmeginde, ulanylan analizator bilen deňeşdirilende brilliant krezil gögüniň täze metilen gögünden has az ulgamlaýyn gyşarmany görkezendigi anyklandy. Bu barada boýamak usullaryny deňeşdirýän PMC barlagynda habar berilýär. Talyplar üçin esaslandyrylan jemleme şudur: täze metilen gögüni standartlaşdyrylan el bilen ýerine ýetirilýän deňeşdirme usuly hökmünde ulanyň, ýerli brilliant krezil gögi usulynyň islendik görnüşini şoňa ýa-da awtomatlaşdyrylan usula garşy barlaň we iki ýagdaýda-da el bilen geçirilýän mikroskopiýadan netijeleriň has giň ýaýramagyna garaşyň. Öňki standartlaşdyrma edebiýatynda söwda boýag tapgyrlarynyň üýtgeýändigi sebäpli arassalanan Azure B hem himiki taýdan has arassa alternatiwa hökmünde teklip edilýärdi; bu Marshall-yň Azure B baradaky barlagynda görkezilýär we usullar baradaky çekişmelerde reagentiň arassalyk derejesiniň näme üçin henizem agzalýandygyny düşündirýär.
Adaty ýalňyşlyklardan gaça durmak
Şowsuz preparatlaryň köpüsine dört ýalňyşlyk sebäp bolýar. Täze metilen gögi N ýerine adaty metilen gögüni sargyt etmek usulyň ýerine ýetirilişi sebäpli däl-de, himiki aýratynlyk sebäpli gowşak boýalyşa getirýär. Gözden geçirmezden öň fiksasiýa etmek ýa-da goşmaça kontrast boýag ulanmak suprawital signaly aýyrýar. Boýag çökündisini däne hökmünde sanamak netijäni ýokarlandyrýar; iki däne düzgüni we süzülen boýag munuň öňüni alýar. Retikulositleriň göterimi pes bolanda örän az öýjügi sanamak takyk görünýän, ýöne ynam çäkleri giň bolan sany berýär. Her ýalňyşlygyň alamaty birmeňzeşdir: mikroskopçy reagent tapgyrynyň kesgitlän netijesi üçin mikroskopy günäkärleýär.