Metilen gögi bilen ýönekeý boýamak we Gram boýunça boýamak: her usul nämäni subut edip biler

Talyp E. coli diýlip bellik edilen kulturadan çyrşantgy taýýarlaýar, onuň üstüni bir minutlap metilen gögi bilen örtýär, çaýkaýar we ýagly immersiýa obýektiwi arkaly seredýär. Görüş meýdany gök taýajyklar bilen örtülen. Laboratoriýa hasabatynda: «Gram-negatiw taýajyklar E. coli hökmünde kesgitlenildi» diýlip ýazylan. Gözegçilik dogry. Emma bu preparat şeýle netijä gelmäge esas bermeýär.

Ýalňyşlyk tehniki däl-de, düşünje bilen bagly. Talyp ýönekeý boýagy differensial synag ýaly kabul edipdir. Ýönekeý boýamak bilen Gram boýunça boýamak dürli soraglara jogap berýär, sebäbi olar boýamagyň dürli ýörelgelerine esaslanýar. Biri: nähili şekil bar diýip soraýar. Beýlekisi: synaga sezewar edilende öýjük diwary özüni nähili alyp barýar diýip soraýar. Bu ikisini garyşdyrsaňyz, dogry boýalan preparatdan esassyz hasabat döreýär.

Bu deňeşdirme iki usuly aýratynlykda düşündirýär, her netijäniň nähili tassyklama esas berýändigini görkezýär we talyplaryň iň köp berýän iki soragyna jogap berýär: metilen gögüni Gram boýunça boýamakda ulanyp bolýarmy we E. coli-ni metilen gögi bilen boýamak hakykatda nämäni görkezýär?

Gysga jogap

Metilen gögi bilen ýönekeý boýamak boýag kabul edýän her öýjügi birmeňzeş gök reňke boýaýar. Şonuň üçin ol morfologiýany (taýajyklar, şarlar, spirallar) we ýerleşişi (ýekelikde, jübütler, zynjyrlar) görkezýär, ýöne Gram topary barada hiç zat aýtmaýar. Gram boýunça boýamak ýody, reňksizlendiriş tapgyryny we goşmaça boýagy goşýar. Şeýlelikde, öýjük gabyklarynyň boýagy saklaýşyna esaslanyp, bakteriýalary Gram-pozitiw (gyrmyzy) we Gram-negatiw (gülgüne ýa-da gyzyl) toparlara bölýär. Metilen gögünden soň görünýän gök taýajyklar «taýajyk şekilli öýjükler bar» diýmegi aňladýar. Doly Gram yzygiderliliginden soň görünýän gülgüne taýajyklar «Gram-negatiw taýajyklar bar» diýmegi aňladýar. Ikinji tassyklamanyň esasy has güýçli, sebäbi amal goşmaça synagy öz içine aldy.

Bu makalanyň degişli bolan bir boýagly bakteriýa usullarynyň has giň topary barada mikroskopiki boýag atlasyna serediň.

Ýönekeý boýamak: bir boýag, bir sorag

Metilen gögi esas häsiýetli (kationly) boýagdyr. Onuň reňkli iony položitel zarýad göterýär we öýjükdäki otrisatel zarýadly gurluşlara, şol sanda nuklein kislotalaryna hem-de üstündäki kislota häsiýetli toparlara baglanýar. Şonuň üçin öýjükler açyk fonda gök bolup görünýär. OpenStax bu položitel boýamak ýörelgesini boýamak baradaky bölüminde düşündirýär. Boýag kationynyň özi metilen gögüniň himiýasy baradaky maglumatnamada jikme-jik beýan edilen kiçi, tekiz fenotiazin ionydyr; hlorid garşy iony reňk bermeýär.

Adaty okuw protokoly bilkastlaýyn ýönekeýdir: ýuka çyrşantgy taýýarlaň, howada guradyň, gyzdyryp fiksirläň, üstüni takmynan bir minutlap 1% töweregi metilen gögüniň suwly ergini bilen örtüň, suw bilen ýuwaşlyk bilen çaýkaň, sorujy kagyz bilen guradyň we ýagly immersiýa arkaly barlaň. LibreTexts okuw protokoly hut şu 1% we bir minutlyk görnüşi berýär, şeýle hem käbir laboratoriýalaryň wagty uzaldýandygyny belleýär. Boýagy berkidiji ýok, reňksizlendiriji ýok, ikinji boýag ýok. Esasy zat hem olaryň ýoklugydyr. Diňe bir boýag ulanylyp, ol saýlap aýrylmasa, boýagy baglaýan her öýjük ahyrsoňy birmeňzeş reňkde bolýar.

E. coli üçin garaşylýan görnüş — ýekelikde, jübüt ýa-da kiçi toparlarda ýerleşýän gök taýajyklar (basillalar). Gök reňk boýagdan gelýär. Taýajyk şekili bolsa organizmiň özüne degişlidir. Emma bu ikisiniň bilelikde görünmegi organizmi kesgitlemeýär, sebäbi köp görnüşler taýajyk şekillidir we ýönekeý boýamakda köp taýajyklar gök reňke boýalýar. ATCC mikrobiologiýa kulturasy baradaky gollanmasynda diňe morfologiýa bilen çäklenýändigini açyk belleýär. Dogry hasabatda: «Gök basillalar görüldi» diýilýär. Şekilden we ýerleşişden başga netije üçin goşmaça subutnama gerek.

Gram boýunça boýamak: dört reagent, özüni alyp barşyny barlaýan bir synag

Gram boýunça boýamak differensial boýamakdyr. Ol ähli öýjükleri birmeňzeş yzygiderlilikden geçirýär we haýsy öýjükleriň ilkinji boýagy saklaýandygyny, haýsylarynyň ony ýitirýändigini görkezýär. Amerikanyň Mikrobiologiýa Jemgyýetiniň Gram boýag protokollary adaty dört tapgyrly tertibi kesgitleýär: kristal wiolet (esasy boýag), Gram ýody (boýagy berkidiji), spirt ýa-da aseton-spirt (reňksizlendiriji), soňra safranin (goşmaça boýag).

Adaty okuw modeli bu bölünişi öýjük gabygynyň gurluşy bilen düşündirýär. Gram-pozitiw öýjüklerde galyň peptidoglikan diwary bar; ol spirt bilen ýuwlanda suwsuzlanýar we kristal wiolet bilen ýoduň toplumyny saklaýar. Gram-negatiw öýjüklerde ýuka peptidoglikan gatlagy we lipidlere baý daşky membrana bar. Reňksizlendiriji bu membranany bozýar, şonuň üçin toplum ýuwlup çykýar we öýjükler soňra safranini kabul edýär. NCBI Bookshelf-däki Gram boýagy baradaky syn öýjük diwaryna esaslanýan şu düşündirişi berýär. Hünärmenler doly fiziki-himiki hadysalaryň diňe diwar galyňlygyndan has çylşyrymlydygyny goşýarlar. Emma laboratoriýada netijäni düşündirmek üçin özüni alyp barşa esaslanýan düzgün güýjünde galýar: gyrmyzy reňk boýagyň saklanandygyny, gülgüne reňk bolsa onuň ýitirilip, soň goşmaça boýag bilen boýalandygyny aňladýar.

Düşündiriş panelleri. Usullary deňeşdirmek üçin stilleşdirilen çyzgylar, kamera bilen alnan mikrofotografiýalar däl. Ýörelgäni öwretmek üçin reňkler ýönekeýleşdirildi: ýönekeý boýamakda bir reňk, Gram reňksizlendirişinden soň iki reňk.

Metilen gögüni Gram boýunça boýamakda ulanyp bolýarmy

Bu soragy iki dürli manyda düşünip bolýar we olaryň jogaplary hem dürli bolmaly.

Birinji many: metilen gögüni bir gezek guýmak tutuş Gram yzygiderliliginiň ornuny tutup bilermi? Ýok. Ýod, reňksizlendiriji we goşmaça boýag bolmasa, differensial tapgyr ýokdur, şonuň üçin hiç bir Gram topary barlanmaýar. Diňe metilen gögünden soň gök bolup görünýän meýdan, hatda çüýşe Gram reagentleriniň gapdalynda duran hem bolsa, ýönekeý boýamagyň netijesidir. Ony Gram netijesi hökmünde ýazga geçirmäň.

Ikinji many: metilen gögi 4-nji tapgyrda goşmaça boýag hökmünde safraniniň ornuny tutup bilermi? Wezipesi taýdan ol reňksizlendirilen öýjükleri boýap biler we okuw kitabyndaky gönükme şeýle çalşygyň netijesinde Gram-pozitiw öýjükleriň gyrmyzy, Gram-negatiw öýjükleriň bolsa gök boljakdygyny çaklaýar. Bu pikir ýerliklidir, sebäbi dogry reňksizlendirilen Gram-negatiw öýjükler diýen ýaly reňksiz bolýar we başga bir kationly boýagy kabul eder. Emma bu adaty protokol däl. ASM protokollarynda safranin görkezilýär; käbir görnüşlerinde esas häsiýetli fuksin ýaly ykrar edilen alternatiwalar bar, ýöne metilen gögi olaryň arasynda däl. Munuň amaly kemçiligi hem bar: gök reňki gyrmyzydan tapawutlandyrmak gülgüne reňki gyrmyzydan tapawutlandyrmakdan kyn, aýratyn-da täze öwrenýänler üçin we yşygy gowşan mikroskop lampalarynda. Okuw işleri we ähmiýetli islendik netije üçin protokolyňyzda görkezilen goşmaça boýagy, adatça safranini ulanyň. Metilen gögi bilen goşmaça boýamagy bolsa deň derejeli standart däl-de, görkezme görnüşi hökmünde kabul ediň.

Metilen gögüniň beýleki bir boýagly usullar bilen nähili deňeşýändigi baradaky degişli sorag ýönekeý bakteriýa boýaglarynyň deňeşdirmesinde beýan edilýär.

E. coli-ni metilen gögi bilen boýamak nämäni subut edýär we nämäni subut etmeýär

E. coli Gram-negatiw taýajykdyr, emma bu sözlem birnäçe usuldan alnan maglumatlary birleşdirýär: morfologiýa mikroskopiýadan, Gram reaksiýasy Gram boýagyndan, görnüşiň kesgitlenmegi bolsa kultura hem-de biohimiki ýa-da molekulýar synaglardan gelýär. Metilen gögi bilen boýalan çyrşantgy diňe birinji bölege goşant goşýar. Ol boýalan nusgada taýajyk şekilli öýjükleriň bardygyny we olaryň nähili ýerleşendigini görkezýär. Gram reaksiýasyny kesgitlemeýär, sebäbi reňksizlendiriş synagy geçirilmedi. Görnüşi hem kesgitlemeýär, sebäbi bu çözgüt derejesinde köp görnüşleriň taýajyklary biri-birine meňzeýär.

Hasabatlarda garaşylýan ýalňyşlyk hut şu ýerde ýüze çykýar. Ýazyjy öňden bilýän maglumatlaryny («bu kultura E. coli bolmaly, E. coli bolsa Gram-negatiw») gözegçilik setirine goşýar. Şeýlelikde, preparat hakykatda diňe çaklanan zady tassyklaýan ýaly görünýär. Has takyk hasabat bu gatlaklary aýyrýar: «Metilen gögi bilen ýönekeý boýamak: gök basillalar görüldi; diňe morfologiýa, Gram topary barlanmady». Soňra, eger Gram boýunça boýamak gözegçilik nusgalary bilen dogry geçirilen bolsa: «Gram boýunça boýamak: gülgüne taýajyklar, Gram-negatiw netijä laýyk gelýär». Görnüşiň kesgitlenmegi soňra, diňe reňkden däl-de, kesgitleýiş işleriniň yzygiderliliginden gelýär.

Netijeleri düşündirmek üçin amaly gollanma

Laboratoriýada şu karar düzgünini ulanyň. Ähli öýjükler bir reňkde bolsa we protokolda reňksizlendirijisiz bir boýag ulanylan bolsa, siz ýönekeý boýamak geçirdiňiz. Şekili, ululygyň takmynan bahasyny we ýerleşişi hasabata ýazyň. Şol ýerde duruň. Protokolda belli pozitiw we negatiw gözegçilik nusgalary bilen kristal wiolet, ýod, reňksizlendiriji we goşmaça boýag ulanylan bolsa, siz Gram boýunça boýamak geçirdiňiz. Reňki we morfologiýany bilelikde ýazyň: zynjyr bolup ýerleşen gyrmyzy kokklar, gülgüne taýajyklar we ş.m.

Düşünişmezlikleriň köpüsine üç ýalňyşlyk sebäp bolýar. Birinjisi, gök taýajyklardan artykmaç netije çykaryp, olary E. coli-niň tassyklanmagy hökmünde kabul etmek. Ikinjisi, depderde metilen gögi bilen boýalan preparaty «Gram boýunça boýamak» sözbaşysynyň aşagynda ýazga geçirmek; soňraky okyjylar muny nädogry düşündirerler. Üçünjisi, goşmaça boýaglary oýlanyşyksyz çalşyp, soňra dürli laboratoriýalardaky reňkleri olaryň reňk toplumlary deňmiş ýaly deňeşdirmek. Her ýalňyşlygyň çözgüdi birmeňzeşdir: hakykatda ýerine ýetirilen usulyň adyny ýazyň we diňe şol usulyň barlaýan zadyny tassyklaň.

Ýönekeý boýamak hut az zady tassyklamagy sebäpli öz ornuna eýedir. Ol çalt, ownuk gyşarmalara çydamly we sorag morfologiýa barada bolanda ýeterlikdir: bir zat barmy we onuň şekili nähili? Sorag toparlara bölmek barada bolsa, differensial synagy geçiriň. Gök preparat öýjükleriň nähili görünýändigini aýdýar. Gyrmyzy ýa-da gülgüne preparat olaryň diwarlarynyň özüni nähili alyp barýandygyny aýdýar. Olaryň hiç biri özbaşdak görnüşi kesgitlemeýär.