Makala
Metilen gögi we azot oksidi: NOS, cGMP we damarlarda signal geçirilişi
Sorag ýönekeý ýaly eşidilýär: metilen gögi azot oksidini päsgellendirýärmi? Laboratoriýada bu sorag dört aýratyn soraga bölünýär we olaryň hersi başga synag arkaly barlanýar. Olary garyşdyrmak metilen gögi we azot oksidi barada ýazylanlaryň ynamly, ýöne düşnüksiz görünmeginiň esasy sebäbidir.
Azot oksidiniň signalyny dört halkaly zynjyr hökmünde göz öňüne getiriň. Azot oksidi sintazasyny öndürmek üçin geniň transkripsiýasy bolup geçýär. Ferment arginini azot oksidine öwürýär. Gaz başga bir zat bilen reaksiýa girmezden öň öz nyşanasyna diffuziýa arkaly ýetýär. Ereýän guanilat siklaza ony duýýar we siklik GMP öndürýär. Metilen gögüniň her halkadaky täsirleri barada çap edilen maglumatlar bar, ýöne subutnamalar dürli tejribe ulgamlaryndan, dürli konsentrasiýalardan we dürli izoformalardan gelip çykýar. Bir halkadaky netije başga bir halkadaky täsiri subut etmeýär.
Esasy zynjyryň ýönekeý düşündirişi
Gan damarynyň diwarynda adaty yzygiderlilik şeýle geçýär. Bir gyjyndyryjy endotelial öýjüge täsir edýär. eNOS ýa-da NOS3 diýlip atlandyrylýan endotelial azot oksidi sintazasy az mukdarda azot oksidini gysga wagtlyk öndürýär. Gaz goňşy ýylmanak myşsa öýjügine diffuziýa arkaly geçýär, ereýän guanilat siklazanyň reduksiýalaşan demirli gemine baglanýar we GTP-niň siklik GMP-ä öwrülmegini çaltlandyrýar. Siklik GMP G protein kinazasyny işjeňleşdirýär, kalsiýiň öýjükdäki dolandyrylyşy üýtgeýär we myşsa gowşaýar.
Aýratyn saklamaga mynasyp ikinji bir zynjyr hem bar. Ýokanç wagtynda ýa-da sitokinleriň täsirinde öýjükler başga bir fermentiň — induksiýa edilýän azot oksidi sintazasynyň, ýagny iNOS-yň — transkripsiýasyny amala aşyrýarlar. Oňa NOS2 hem diýilýär. Ol eNOS-dan has uly we has uzak dowam edýän azot oksidi akymlaryny döredýär. Üçünji izoforma bolan neýronal NOS ýa-da nNOS bolsa başga bir şertler toplumyna degişlidir. Makalada izoforma görkezilmän azot oksidi sintazasy diýilse, saklanyň we haýsysynyň ölçenendigini barlaň. Metilen gögüniň elektronlary nähili geçirýändigi baradaky umumy syn hem redoks nyşanalary barada şol bir pikiri öňe sürýär: geçiriji özbaşdak hiç zat etmeýär, netijäni bolsa onuň her ujundaky hyzmatdaş kesgitleýär.
Ölçenen siklik GMP hem fermentiň göni synagy däl-de, birnäçe prosesiň jemleýji görkezijisidir. Onuň derejesi siklaza arkaly sintezden fosfodiesterazalar, aýratyn-da damaryň ýylmanak myşsasyndaky PDE5 arkaly dargamagyň aýrylmagyny görkezýär. Şonuň üçin siklik GMP-niň peselmegi signaly duýýan ulgama az signalyň ýetendigini aňladýar. Munuň özi haýsy halkanyň işlemedigini görkezmeýär.
1-nji halka: iNOS fermenti az öndürilýär
Bakterial lipopolisaharid, interferon gamma ýa-da olaryň ikisi bilen gyjyndyrylan syçan makrofaglarynda metilen gögi iNOS proteininiň garaşylýan ýokarlanmagynyň öňüni aldy we makrofaglardaky transkripsiýa synaglarynda iNOS-yň habarçy RNK-syny güýçli basyp ýatyrdy. Bu ýerde maglumat berýän zat üýtgemedik hadysalardyr. I kappa B alpha ingibitorynyň dargamagy, NF kappa B we STAT1 faktorlarynyň fosforlanmagy hem-de şol faktorlaryň ýadro geçmegi esasan öňküligine galdy. Peselen zat olaryň DNK baglanmagydy; muny iNOS promotorynda olaryň eýeleýän ýerleriniň azalandygyny görkezýän hromatin immunopresipitasiýasy tassyklady.
Bu bar bolan fermentiň işiniň dessine böwetlenmegi däl-de, fermentiň mukdary kesgitlenmezden öňki tapgyrda geniň sazlanyşyna täsirdir. Ol alawlama signal geçirilişine degişlidir; bu ýerde protein peýda bolmazdan öň transkripsiýa faktorlary promotora baglanmalydyr. Bu netije dynç ýagdaýyndaky damarda hemişelik işjeň bolan eNOS barada göni hiç zat aýtmaýar we hut şeýle beýan edilmelidir.
2-nji halka: bar bolan NOS fermenti has haýal işleýär
Alakalarda geçirilen bir barlag başga bir derejäni barlady. Huşy ýerinde bolan erkek alakalara lipopolisaharid damar içine berildi, üç sagatdan soň bolsa damar içine ýa duzly ergin, ýa-da her kg üçin 3 mg metilen gögi berildi. Gipotalamusyň medial bazal böleginde azot oksidi sintazasynyň işjeňligi belgilenilen argininiň sitrulline öwrülmegi arkaly gipotalamusdaky NOS işjeňligi barlagynda ölçenildi. Diňe stres bilen duzly erginiň bilelikdäki täsiri kalsiýe bagly bolmadyk belli bir işjeňligi döretdi, lipopolisaharid bolsa ony gözegçilik derejesinden takmynan on esse ýokarlandyrdy. Metilen gögi induksiýa edilen iki bölegi hem aradan aýyrdy. Şol dokumada, şol mukdarda we şol wagt nokadynda kalsiýe bagly hemişelik işjeňlik üýtgemedi.
Bu netijäni edil ýazylyşy ýaly okaň: şol şertlerde ölçenen iNOS görnüşli işjeňlik basyp ýatyryldy. Bu gen ekspressiýasynyň ölçegi däl we iNOS-a eNOS-dan ýa-da nNOS-dan hemişe saýlap täsir edilýändiginiň subutnamasy hem däl. Arassalanan ferment bilen geçirilen işler bu babatda seresap bolmagyň zerurdygyny has aýdyň görkezýär. Arassalanan azot oksidi sintazasynyň göni synaglarynda metilen gögi 30 micromolar konsentrasiýada sitrulliniň emele gelmegini doly böwetledi. Arassalanan NOS bilen guanilat siklazanyň deňeşdirilişinde habar berlişi ýaly, ýarym päsgellendiriji konsentrasiýa superoksid dismutaza ýok wagty takmynan 5.3 micromolar, ol bar wagty bolsa 9.2 micromolar boldy. Arassalanan nNOS bilen geçirilen aýratyn barlag ferment bilen baglanyşykly gemiň oksidlenmeginiň gatnaşýandygyny görkezdi. Amaly sapak şudur: aýratynlandyrylan ulgamlarda NOS-yň göni päsgellendirilmegi hakykatdan hem bar, ýöne gipotalamusdaky netijäni giňeldip, metilen gögi ähli ýerde hemişelik işjeň NOS görnüşleriniň hemmesine täsir etmeýär diýen umumy netijä gelmek bolmaz.
3-nji halka: azot oksidi ýetmänkä ýitýär
Siklik GMP-niň peselmegini fermentiň işiniň böwetlenmeginden başga bir zadyň hem düşündirip biljekdigini iň aýdyň görkezýän tejribe ösdürilip ýetişdirilen towşan öýken arteriýasynyň ýylmanak myşsa öýjüklerinden gelýär. Tejribede azot oksidiniň donorlary göni goşulyp, endogen NOS tapgyry tutuşlygyna aýlanyp geçildi. Soňra damaryň ýylmanak myşsasynda superoksid barlagynda metilen gögüniň şonda-da siklik GMP jogabyny basyp ýatyrýandygy ýa-da ýatyrmaýandygy barlandy.
Üç donor 1-den 100 micromolar aralygynda barlandy: S nitrozo L sistein, natriý nitroprussidi we MPANO diýlip atlandyrylýan durnukly deaminirlenen analog. Olaryň hemmesi siklik GMP-ni takmynan 1.5 esseden 12 essä çenli ýokarlandyrdy. 10 micromolar konsentrasiýadaky metilen gögi ilkinji ikisiniň jogabyny 51-den 100 göterime çenli päsgellendirdi, MPANO jogabyny bolsa üýtgetmedi. Eger metilen gögi diňe siklazanyň katalitik merkezini böwetleýän bolsa, donorlara şeýle saýlap täsir etmegini düşündirmek kyn bolardy, sebäbi üçüsi hem soňraky şol bir ferment arkaly täsir edýär.
Soňra üç gözegçilik synagy mehanizmiň superoksid bilen baglydygyny anyklady. Birinjiden, ksantin bilen ksantin oksidazanyň kömegi arkaly öýjükden daşary superoksid öndürmek şol bir görnüşli netijäni gaýtalady: CYSNO we nitroprussid böwetlendi, MPANO bolsa täsirsiz galdy. Ikinjiden, metilen gögi ýylmanak myşsa öýjüklerinde mukdara we wagta bagly superoksid önümçiligini döretdi; bu sitohrom c-niň reduksiýasy arkaly ölçenildi. Üçünjiden, superoksid dismutaza päsgellendirilmegiň doly öňüni aldy, katalaza bolsa almady. Bu şol tejribe ulgamynda göni täsir edýän görnüşiň wodorod peroksidi däl-de, superoksid bolandygyny görkezýär.
Tejribäniň bilelikde ösdürilip ýetişdirilen öýjükler bilen geçirilen görnüşini hem beýan etmek ýerliklidir, sebäbi ol täsiriň nirede bolup geçýändigini görkezýär. Ýapyjy aýnajyklardaky endotelial öýjükler ýylmanak myşsa öýjükleri bilen gysga wagtlap bilelikde ösdürilip ýetişdirildi. Netijede, bazal şertlerde bölünip çykýan endotelial faktor ýylmanak myşsadaky siklik GMP-ni üç-sekiz esse ýokarlandyrdy. Iki öýjük toparynyň haýsysyna öňünden metilen gögi bilen täsir edilse-de, şol signal peseldi; superoksid dismutaza bolsa endotelial öýjüklere öňünden täsir edilmeginiň netijesini bölekleýin aradan aýyrdy. Başgaça aýdylanda, metilen gögüniň signaly duýýan ýylmanak myşsa öýjüginiň içinde täsir etmegi hökman däl. Ol habarçy maddany geçiş ýolunda aýyrmak arkaly signaly peseldip biler. Metilen gögi boýunça barlaglary okamak boýunça gollanma muny umumy düzgün hökmünde kabul edýär: molekulýar nyşanany atlandyrmazdan öň täsiriň haýsy bölüme edilendigini aýdyň.
Muny NOS-yň päsgellendirilmegi diýip atlandyrmak nädogry bolardy. Donorlaryň işlemegi üçin sintaza tapgyry gerek däldi, ýöne signal şonda-da peseldi.
4-nji halka: signaly duýýan ulgamyň özi gowşak jogap berýär
Ereýän guanilat siklaza göni täsirler bar, ýöne konsentrasiýalar möhümdir. Ýokarda görkezilen arassalanan fermentleriň deňeşdirilişinde azot oksidi bilen gyjyndyrylan siklazany ýarym päsgellendirmek üçin takmynan 60 micromolar metilen gögi gerek boldy. NOS-yň ýarym päsgellendirilmegi bolsa takmynan 5-den 9 micromolar aralygynda ýüze çykdy; hatda 1 millimolar hem doly böwetlemä ýetirmedi. Bu takmynan alty-on bir esse tapawutdyr. Şonuň üçin pes micromolar konsentrasiýada geçirilen öýjük synagynda siklik GMP-niň azalmagyny diňe onuň san görkezijisine esaslanyp, siklazanyň saýlanyp päsgellendirilmegi diýip atlandyrmak bolmaz.
Soňraky redoks barlagy ikinji bir seresaplyk sebäbini goşdy: metilen gögi azot oksidi bilen işjeňleşdirilen siklazany gem demriniň howada ýönekeý oksidlenmeginden tapawutly mehanizm arkaly işjeňsizleşdirdi. Diýmek, signaly duýýan ulgamyň işi bozulyp biler, ýöne himiki mehanizm entek doly anyklanmady. Konsentrasiýalaryň arasyndaky tapawut bolsa pes micromolar konsentrasiýalaryň täsirinde ilki superoksidiň we NOS-yň täsirlerini aradan aýyrmagyň zerurdygyny görkezýär. Fosfodiesteraza gözegçiligi hem şu ýerde möhümdir. Dargama ölçenmedik ýa-da böwetlenmedik bolsa, siklik GMP-niň az toplanmagy sinteziň azalmagyna, dargamagyň çaltlaşmagyna ýa-da ikisine-de laýyk gelip biler.
Näme üçin muny gan basyşy baradaky ýeke-täk pikire jemläp bolmaýar
Her halka başga bir ulgamda anyklandy. Makrofaglardaky transkripsiýa gipotalamusdaky ferment işjeňligi däldir. Lipopolisaharidden soňky gipotalamus işjeňligi dynç ýagdaýyndaky endotelial tonus däldir. Bilelikde ösdürilip ýetişdirilen öýjüklerde bazal şertlerde bölünip çykýan endotelial faktor agonist bilen gyjyndyrylan damar giňelmesi däldir. 10 micromolar metilen gögüniň täsirindäki ösdürilip ýetişdirilen öýken arteriýa öýjükleri adamyň gan aýlanyş ulgamy däldir. Bularyň hemmesini metilen gögi azot oksidini böwetlemek arkaly gan basyşyny ýokarlandyrýar diýen ýaly bir pikire jemlemek gözegçilik synaglarynyň gorap saklamak üçin döredilen tapawutlaryny hut özüni ýitirýär.
Üç barlag düşündirişiň takyklygyny saklaýar. Birinjiden, izoformany atlandyryň: dynç ýagdaýyndaky damar tonusy üçin eNOS, induksiýa edilen alawlama akymy üçin iNOS, neýronal we käbir arassalanan ferment şertleri üçin nNOS. Ikinjiden, azot oksidiniň signalynyň nähili berilýändigini aýdyň: endogen sintez, bazal endotelial bölünip çykma ýa-da CYSNO, nitroprussid ýa-da MPANO ýaly belli bir donor arkaly. Sebäbi durnukly donor metilen gögüniň täsirine garşy durdy, durnuksyz donorlar bolsa durmady. Üçünjiden, konsentrasiýany we täsiriň nähili aradan aýrylandygyny aýdyň: superoksid dismutaza arkaly täsiriň aradan aýrylmagy superoksidiň gatnaşýandygyny görkezýär; katalazanyň täsir etmezligi şol tejribe ulgamynda wodorod peroksidiniň roluna garşy delil berýär; ksantin oksidaza arkaly täsiriň gaýtalanmagy şol mehanizmiň ýeterlikdigini görkezýär; arassalanan ferment synaglary bolsa katalize göni täsirleri geçiş ýolundaky ýitgilerden aýyrýar.
Gysgaça jemleme şudur. Metilen gögüne siklazany saýlap böwetleýji hökmünde däl-de, azot oksidinden siklik GMP-ä çenli signal geçirilişine birnäçe nokatda täsir edýän madda hökmünde garamak has dogrudyr. Tejribe ulgamyna we konsentrasiýa baglylykda, ol iNOS-yň transkripsiýa faktorlarynyň baglanmagyny azaldyp, NOS fermentlerini göni päsgellendirip, superoksid öndürmek arkaly azot oksidiniň elýeterliligini peseldip we azot oksidi bilen işjeňleşdirilen siklazanyň işini bozup biler. Damar barlaglarynda siklik GMP signal geçirilişiniň orny we öýjük synaglarynda ulanylýan azot oksidi donorlarynyň deňeşdirilişi şol şahalaryň hersiniň birini has jikme-jik beýan edýär. Redoks täsirlerini ferment täsirlerinden aýyrmak üçin ulanylýan usullar bolsa bu ugurdaky edebiýatlarda näme üçin superoksid dismutaza, katalaza we durnukly donor bilen gözegçilik synagynyň şeýle ýygy duş gelýändigini düşündirýär.
Metilen gögünden soň siklik GMP-niň pes bolmagy zynjyryň üzülendigini görkezýär. Haýsy halkanyň üzülendigini diňe gözegçilik synaglary aýdýar.