Metilen gögi we autofagiýa: AMPK, mTOR we neýron synaglary

Öýjük synagyny geçirip, metilen gögi goşýandygyňyzy we blotda LC3-II diýilýän belok zolagynyň garalýandygyny görýändigiňizi göz öňüne getiriň. Birleşmäniň «autofagiýany güýçlendirýändigini» yglan edip, dowam etmek özüne çekiji bolup biler. Ýöne beýle düşündiriş bermäge entek ir. LC3-II zolagynyň has garalmagy öýjügiň arassalaýyş wezikalaryny has köp döredýändigini ýa-da ýok etmek tapgyrynyň böwetlenmegi sebäpli wezikalaryň üýşýändigini aňladyp biler. Bu iki düşündiriş biri-birine ters ugurlary görkezýär we metilen gögüniň neýronlara täsiri baradaky edebiýatda subutnamalaryň iki görnüşiniň hem mysallary bar. Bu makala her bir seljerme boýunça hakykatda nämeleriň ölçelendigini düşündirýär.

Bu ýerde öwrenilýän görnüş bolan makroautofagiýa öýjügiň köp mukdardaky materialy gaýtadan işlemek ulgamydyr. Fagofor diýilýän membrana haltajygy könelen beloklaryň we organellalaryň daşyny gurşap ösýär, ýapylyp autofagosoma öwrülýär, lizosoma bilen birleşýär we içindäki ýük dargadylyp, gaýtadan ulanmak üçin boşadylýar. Neýronlar bu yzygiderli işe baglydyr, sebäbi olar bölünmeýär we bölünmek arkaly zeper ýeten bölekleriň öýjükdäki paýyny azaldyp bilmeýär. Gaýtadan işlemek saklananda galyndylar toplanýar. Ol kadaly işleýän wagty öýjük stres şertlerinde gurluş materiallaryny gaýtadan alýar.

Gippokamp öýjüklerinde geçirilen bir synag nämäni görkezdi

Induksiýa baradaky esasy barlagda syçanyň HT22 gippokamp öýjükleri 24 sagatlap serumsyz saklanyp, strese sezewar edildi. Bu şert ösüş faktorlaryny we trofiki signallary aýyrýar hem-de apoptozy-da, autofagiýany-da başladýar. Barlagçylar habar berdiler: metilen gögi öýjükleriň ölmegini doza bagly görnüşde azaltdy we bu gorag makroautofagiýanyň alamatlary bilen bile ýüze çykdy.

Markerleriň üýtgeýşi anykdy. Metilen gögüniň konsentrasiýasy takmynan 20 nM-den başlap, ýaýraň LC3B reňklenmesi ýadronyň daşyndaky nokatjyklar görnüşinde täzeden paýlandy; LC3-I we LC3-II-niň iň güýçli jogaby bolsa 1 μM töwereginde görüldi. LC3B-I hem, LC3B-II hem doza we wagta baglylykda ýokarlandy. Iň möhümi, topar diňe üýtgemeýän bir pursady görkezýän LC3 bloty bilen çäklenmedi. Olar lizosomal arassalaýşy böwetleýän 10 μM hlorohin goşdular we metilen gögi bilen işlenen öýjüklerde LC3-II-niň has ýokary derejesini hem-de p62-niň durnuklaşandygyny tapdylar. Bu ýagdaý diňe üýşmegi däl-de, lizosoma bagly dolanyşygy goldaýar. Şeýle hem olar hlorohiniň apoptoza garşy täsiri bölekleýin yzyna öwürýändigini görkezdiler; bu bolsa şu modelde goragy autofagiýa we lizosoma ýoly bilen baglanyşdyrýar.

Signal geçiriş baradaky netije iň köp nädogry beýan edilýän bölekdir. Fosforlaşdyrylan AMPK we onuň aşaky basgançakdaky nyşany bolan fosforlaşdyrylan ACC arkaly bahalandyrylan AMPK signal geçirişi 12 we 24 sagatda doza baglylykda ýokarlandy. Soňky 4 sagadyň dowamynda 20 μM konsentrasiýada ulanylan AMPK inhibitory Compound C hem ACC fosforlaşmasyny, hem LC3 işjeňleşmesini azaltdy. Muňa garamazdan, fosforlaşdyrylan mTOR-da ýüze çykaryp boljak derejede basylma görülmedi. Diýmek, strese sezewar edilen gippokamp öýjüklerinde netije, görnüşine görä, mTOR-dan garaşsyz ýol arkaly AMPK bilen baglanyşykly induksiýa boldy. Şol bir ýagdaý diri syçanlarda hem görüldi: metilen gögi bilen täsir etmek beýni gabığında we gippokampda makroautofagiýa markerlerini induksiýa etdi.

Induksiýa doly amala aşan akym däldir

Bu ýerde düşünjeleriň arasyndaky tapawut aýratyn möhümdir. Induksiýa ýokarky basgançakdaky mehanizmleriň has köp autofagosoma öndürýändigini aňladýar. Akym bolsa ýüküň tutuş ýoly geçmegidir: gurşalyp alynmak, ýetişmek, lizosoma bilen birleşmek, dargamak we gaýtadan işlenmek. Akym synagy ýoluň galan bölegini tassyklaýança, LC3-II-niň her bir ýokarlanmagy diňe induksiýa baradaky tassyklama bolup galýar.

Adaty akym synagy LC3-II-ni bafilomisin A1 ýa-da hlorohin ýaly serişdeler bilen gysga wagtlyk lizosomal böwetleme bolan we bolmadyk şertlerde ölçeýär. Eger täsir hakykatdan hem önümçiligi çaltlandyrýan bolsa, dargamany böwetlemek LC3-II-ni has-da ýokarlandyrmalydyr. Tandem mCherry-GFP-LC3 reporter ulgamy başga bir nukdaýnazary goşýar: gurluşlar lizosoma bilen birleşmezden öň sary şöhle saçýar, kislotaly gurşaw GFP signalyny öçürenden soň bolsa diňe gyzyl görünýär. Şonuň üçin diňe gyzyl nokatjyklaryň köpelmegi kislotaly autolizosomalara geçişi goldaýar. p62 belogynyň azalmagy ýüküň dolanyşygyny goşmaça tassyklap biler, ýöne p62 transkripsiýasynyň özi hem strese jogap berýär we mRNA derejesinde barlanmalydyr.

Aşakdaky barlag sanawy bu edebiýatda ulanylan her bir seljermäniň nämäni ölçeýändigini we onuň ýeke özi nämäni subut edip bilmeýändigini görkezýär. Okyjylar ony geljekdäki islendik makroautofagiýa tassyklamasyna, şol sanda bu markerlere daýanýan agyz beklemek we uzak ömürlilik baradaky delillere hem ulanyp bilerler.

Tablisanyň öňüni alýan bir sözleýiş ýalňyşlygyna üns beriň. Fosforlaşdyrylan ACC ferment işjeňligi basylan görnüşdir. Onuň ýokarlanmagy ACC işjeňleşmesini däl-de, AMPK-niň täsiriniň netijesini görkezýär.

«Makroautofagiýanyň basylmagy neýrogoragy ýok etdi» diýen jümle hem şol bir takyklygy talap edýär. HT22 modelinde bu autofagiýa we lizosoma ýoluna päsgel bermegiň serumsyz şertlerde metilen gögüniň öýjükleriň diri galmagyna berýän artykmaçlygyny aradan aýrandygyny aňladýar. Bu şol tejribe gapjagazynda autofagiýanyň zerurdygyny ýa-da goşant goşýandygyny goldaýar. Ýöne ol autofagiýanyň birleşmäniň ýeke-täk gorag mehanizmidigini görkezmeýär, hlorohiniň diňe autofagiýa arkaly täsir edýändigini subut etmeýär we sebäpli baglanyşyk baradaky tassyklamany berkitmek üçin ATG5, ATG7 ýa-da ULK1-de genetiki üýtgetmeler gerek bolardy.

Şol bir ulgama eltýän iki ýol

Ýönekeýleşdirilen çyzgy peýdalydyr. Energiýa stresi AMPK-ni ýokarlandyrýar, AMPK ULK1 toplumyny işjeňleşdirýär we autofagiýa başlanýar. Ösüş faktorlary we ýokumly maddalar mTORC1-i ýokarlandyrýar, mTORC1 ULK1-i basýar we autofagiýa başlanman galýar. ULK1-den soňky basgançaklarda Beclin-1 we VPS34 toplumy fagoforyň emele gelişini başladýar, LC3-I lipidleşip LC3-II-ä öwrülýär, autofagosoma ýapylýar, lizosoma bilen birleşýär we p62-niň dolanyşygy bilen birlikde ýük dargadylýar.

Çyzgy metilen gögi baradaky her bir netijäni şu kartada ýerleşdirýär: gippokampdaky netije AMPK şahasynyň ýanynda, öňbaşçy öýjüklerdäki netije bolsa mTOR şahasynyň ýanynda görkezilýär.

Bu düşündiriş Xie-niň ikinji barlagy bilen görünýän gapma-garşylygy aradan aýyrýar. Köpelýän alakanyň nerw öňbaşçy öýjüklerinde aýratyn bir synag 5 μM metilen gögüniň köpelmegi basandygyny we dynçlyk ýagdaýyna geçişi güýçlendirendigini görkezdi. Ki67-pozitiw öýjükleriň sany 1 we 3-nji günlerde azaldy, emma neýron ugruna gönükdirilen differensiasiýa saklanyp galdy. Ol ýerde mehanizm mTOR signal geçirişiniň basylmagy arkaly amala aşdy: umumy mTOR we fosforlaşdyrylan mTOR azaldy, şol bir wagtda p70S6K we 4EBP1 ekspressiýasy peseldi, E1, B1, D1 we D2 siklinleriniň derejesi hem aşak sazlandy. Esasy fenotip öňbaşçy öýjükleriň dynçlyk ýagdaýy boldy. Awtorlar muny strese sezewar edilen gippokamp öýjükleriniň halas edilmegi bilen däl-de, öýjük garramagynyň gijikmegi bilen baglanyşdyrdylar.

Iki makalanyň arasynda gapma-garşylyk ýok. AMPK we mTOR üýtgemeýän açarlar däl-de, şertlere baglylykda signallary birleşdirýän ulgamlardyr. Strese sezewar edilen neýrona meňzeş öýjük mTOR-yň ölçenip boljak basylmasy bolmazdan AMPK-ni işe goşup biler, mitogenler tarapyndan herekete getirilýän öňbaşçy öýjük bolsa şol bir birleşmä mTOR-a bagly ösüş mehanizmlerini haýallatmak arkaly jogap berip biler. Haýsy şahanyň agdyklyk etjekdigini öýjügiň görnüşi, stres şertleri, konsentrasiýa we wagt nokady kesgitleýär. Şonuň üçin metilen gögüniň mitohondrial energiýa we redoks täsirleri hem şol bir çäkde seredilmelidir: neýrogorag mehanizmlerine bagyşlanan syn makalasynyň düşündirişine görä, birleşme alternatiw elektron daşaýjy hökmünde hereket edýär, antioksidant we apoptoza garşy signal ýollaryny işe goşýar, MAO we NOS-y basýar hem-de biogenez we autofagiýa arkaly mitohondriýalaryň täzelenmegi bilen baglanyşýar. Autofagiýa köp ugurly täsirler toplumynyň bir şahasydyr, tutuş düşündirişiň özi däl.

Synaglar nämäni görkezmeýär

Serumdan mahrum etmek tejribe gapjagazynda trofiki we metabolik stresi modelleşdirýär. Bu tutuş organizmiň agyz beklemeginiň modeli däldir: esasy iýmit gurşawynda glýukoza, aminokislotalar we duzlar galýar, iýmitleniş hereketi bolsa ýok. Öýjük medeniýetindäki 20 nM-den 5 μM çenli konsentrasiýalary hasaplamalar arkaly adam dozalaryna öwrüp bolmaýar, sebäbi siňiş, beloklar bilen baglanyşma, redoks ýagdaýy, metabolizm, dokumalarda toplanma we täsir wagtynyň hemmesi tapawutlanýar.

Metilen gögüniň näsaglarda autofagik akymy induksiýa edýändigini görkezmek üçin niýetlenen hiç bir adam synagy geçirilmedi. Mehanistik subutnamalar henizem öýjük, ex vivo we haýwan barlaglary bilen çäklenýär, syn makalalary bolsa klinika geçirmek baradaky subutnamalary entek deslapky diýip häsiýetlendirýär. Şonuň üçin bu barlaglar metilen gögüniň agyz beklemegiň täsirlerini gaýtalaýandygyny, autofagiýa arkaly adamyň ömrüni uzaldýandygyny ýa-da adamyň beýnisinde autofagik akymy doly amala aşyrýandygyny görkezmeýär. Agyz beklemegi öýkünmek we uzak ömürlilik baradaky tassyklamalara özbaşdak kliniki subutnamalar gerek; adamlarda metilen gögüniň başga maksatlar üçin geçirilen synaglary diňe baglanyşyk sebäpli autofagiýa synaglaryna öwrülmeýär. Ýokumly maddalaryň ýetmezçilik stresi we uzak ömürlilik modelleri baradaky barlaglar şu çäk göz öňünde tutulyp okalmalydyr.

Indiki okajak makalaňyzda barlag sanawyny yzygiderlilikde ulanyň. Ilki haýsy şahanyň üýtgändigini soraň: AMPK-mi, mTOR-my ýa-da hiç biri-de dälmi. Soň LC3 netijesiniň akym synagy bilen bile berlendigini ýa-da ýeke özbaşdak durýandygyny soraň. Ondan soň ýoly böwetlemegiň peýdany aradan aýrandygyny we munuň haýsy usul bilen edilendigini barlaň. Üç soraga-da jogap berýän barlag güýçli mehanistik tassyklama üçin esas döredýär. Diňe birinjisine jogap berýän barlag bolsa rugsat beriji signaly görkezýär, ýoluň galan bölegi henizem kartalaşdyrylmadyk bolup galýar.