การใช้ออกซิเจนมากขึ้นหมายถึง ATP มากขึ้นหรือไม่? บทเรียนจากการศึกษาเมทิลีนบลู

ไมโทคอนเดรียที่แยกออกมาอยู่ในห้องทดลองที่มีเชื้อเพลิงแต่ไม่มี ADP มันใช้ออกซิเจนอย่างช้า ๆ เมื่อเติม ADP การใช้ออกซิเจนก็เพิ่มขึ้นหลายเท่า รอจน ADP หมด การใช้ออกซิเจนก็ลดลงกลับมา เชื้อเพลิงไม่เคยเปลี่ยน สิ่งที่เปลี่ยนมีเพียงความต้องการ ATP

ลำดับเหตุการณ์สั้น ๆ นี้สะท้อนความแตกต่างทั้งหมดที่บทความนี้ต้องการอธิบาย การใช้ออกซิเจนวัดว่าอิเล็กตรอนไหลผ่านสายโซ่การหายใจไปยังออกซิเจนเร็วเพียงใด ส่วนการผลิต ATP วัดว่าพลังงานจากการไหลนั้นถูกเก็บไว้ในรูปที่ใช้งานได้มากเพียงใด ทั้งสองกระบวนการมีขั้นตอนกลางร่วมกัน คือความชันของโปรตอนข้ามเยื่อหุ้มชั้นในของไมโทคอนเดรีย และสิ่งใดก็ตามที่เปลี่ยนความแน่นแฟ้นของการควบคู่ระหว่างความชันนี้กับการสังเคราะห์ ATP ก็อาจทำให้ผลลัพธ์ทั้งสองเปลี่ยนไปคนละทิศทางได้ เมทิลีนบลูเป็นตัวอย่างที่ช่วยอธิบายเรื่องนี้ได้ดี เพราะมีหลักฐานว่ามันทำได้ทั้งสองแบบ คือเพิ่มการใช้ออกซิเจนพร้อมกับ ATP ในตัวอย่างทดลองบางแบบ และเพิ่มการใช้ออกซิเจนขณะที่ ATP คงเดิมหรือลดลงในตัวอย่างทดลองแบบอื่น

ผู้อ่านที่ต้องการเห็นภาพรวมของการส่งต่ออิเล็กตรอนก่อน สามารถเริ่มจากเรื่องที่ว่าเมทิลีนบลูลำเลียงอิเล็กตรอนผ่านสายโซ่การหายใจอย่างไร ส่วนผู้อ่านที่ต้องการทำความเข้าใจคำศัพท์จากการทดลองเกี่ยวกับออกซิเจนในยุคแรก สามารถอ่านเรื่องที่ว่าการวัดการหายใจครั้งแรก ๆ แสดงอะไรให้เห็นจริง ๆ

การหายใจ ATP และความชันที่เชื่อมทั้งสองเข้าด้วยกัน

อิเล็กตรอนจาก NADH และ FADH2 เข้าสู่สายโซ่ที่คอมเพล็กซ์ I และ II ผ่านคอมเพล็กซ์ III ไปยังไซโตโครม c แล้วผ่านคอมเพล็กซ์ IV ไปยังออกซิเจน พลังงานที่ปล่อยออกมาที่คอมเพล็กซ์ I, III และ IV ใช้สูบโปรตอนจากเมทริกซ์ออกไปยังช่องว่างระหว่างเยื่อหุ้ม การแยกประจุและความเป็นกรดนี้ก่อให้เกิดแรงขับเคลื่อนโปรตอน และองค์ประกอบทางไฟฟ้าของแรงนี้ ซึ่งก็คือศักย์เยื่อหุ้ม มักเป็นองค์ประกอบหลัก

เอนไซม์ ATP synthase ยอมให้โปรตอนไหลกลับเข้าสู่เมทริกซ์ และใช้พลังงานที่ปล่อยออกมาเพื่อรวม ADP กับฟอสเฟตให้เป็น ATP ดังนั้นลำดับกระบวนการจึงเป็น:

การใช้ออกซิเจน ตามด้วยการสูบโปรตอน ตามด้วยการเกิดความชัน แล้วจึงสังเคราะห์ ATP

ประเด็นสำคัญคือโปรตอนสามารถกลับเข้ามาทางอื่นได้ด้วย การกลับเข้ามาโดยไม่ผ่าน ATP synthase ถือเป็นการรั่วของโปรตอน การรั่วบังคับให้สายโซ่ต้องสูบโปรตอนชุดเดิมออกไปอีกเพื่อรักษาศักย์เยื่อหุ้มให้คงที่ จึงใช้ออกซิเจนมากขึ้นโดยไม่ได้สร้าง ATP เพิ่มขึ้น หากการรั่วมากพอ จะเกิดการแยกการควบคู่: การใช้ออกซิเจนเพิ่มขึ้น ขณะที่ ATP คงเดิมหรือลดลง และพลังงานที่สูญเสียไปถูกปล่อยออกมาเป็นความร้อน

สถานะ 3 สถานะ 4 และอัตราส่วนการควบคุมการหายใจ

คำศัพท์ดั้งเดิมที่ใช้อธิบายเรื่องนี้มาจากการศึกษาไมโทคอนเดรียที่แยกออกมา สถานะ 3 คือการหายใจเมื่อมีทั้งสารตั้งต้นและ ADP: ATP synthase ใช้ความชันจนลดลง ศักย์เยื่อหุ้มลดลง สายโซ่เร่งการทำงานเพื่อสร้างความชันกลับขึ้นมา และการใช้ออกซิเจนสูงเพราะกำลังมีการสร้าง ATP สถานะ 4 คือการหายใจหลังจาก ADP หมด: ATP synthase หยุดทำงาน ความชันเพิ่มขึ้น ศักย์เยื่อหุ้มที่สูงต้านการสูบโปรตอนเพิ่มเติม และการใช้ออกซิเจนลดลงเหลือเท่าที่จำเป็นเพื่อชดเชยการรั่ว

อัตราส่วนการควบคุมการหายใจ ซึ่งคำนวณจากสถานะ 3 หารด้วยสถานะ 4 จึงบ่งบอกว่าตัวอย่างทดลองมีการควบคู่แน่นแฟ้นเพียงใด อัตราส่วนสูงหมายความว่า ADP ควบคุมการหายใจได้มาก หากอัตราส่วนลดลงพร้อมกับการหายใจในสถานะ 4 ที่เพิ่มขึ้น แสดงว่าการรั่วกำลังมีบทบาทมากขึ้น มุมมองนี้ช่วยให้เข้าใจผลการทดลองเมทิลีนบลูด้านล่างได้

มีภาพจำหนึ่งที่ควรเก็บไว้: ศักย์เยื่อหุ้มสูงทำให้สายโซ่ทำงานช้าลง การสลายศักย์นี้ทำให้สายโซ่ทำงานเร็วขึ้น สายโซ่ตอบสนองต่อความยากในการสูบโปรตอน ไม่ได้ตอบสนองโดยตรงว่ากำลังมีการสร้าง ATP หรือไม่

เมื่อผลลัพธ์ทั้งสองเปลี่ยนแปลงไปด้วยกัน

ตัวอย่างการควบคู่ที่ชัดเจนที่สุดมาจากไมโทคอนเดรียสมองหนูตะเภาที่แยกออกมาและมีคอมเพล็กซ์ในสายโซ่การหายใจถูกยับยั้ง ที่ความเข้มข้นเมทิลีนบลู 100 nanomolar ถึง 1 micromolar การใช้ออกซิเจนขณะพักเพิ่มขึ้นเมื่อใช้กลูตาเมตร่วมกับมาเลต ซักซิเนต หรือกลีเซอโรฟอสเฟตเป็นเชื้อเพลิง ขณะที่การหายใจที่กระตุ้นด้วย ADP ไม่เปลี่ยนแปลง ในไมโทคอนเดรียที่ได้รับสารพิษซึ่งยับยั้งคอมเพล็กซ์ I หรือคอมเพล็กซ์ III สีย้อมนี้เพิ่มการผลิต ATP เล็กน้อย ฟื้นศักย์เยื่อหุ้ม และเพิ่มการรับแคลเซียมเข้า เส้นทางที่เสนอไว้เป็นทางลัด: สีย้อมรับอิเล็กตรอนจากตำแหน่งก่อนจุดที่ถูกยับยั้ง แล้วส่งต่อให้ไซโตโครม c โดยข้ามคอมเพล็กซ์ที่เสียหาย

กรณีที่สองซึ่งผลลัพธ์เปลี่ยนแปลงไปด้วยกันใช้แหล่งสร้าง ATP ที่ต่างออกไปโดยสิ้นเชิง ในไมโทคอนเดรียสมองที่แยกออกมาและมี ATP synthase ถูกยับยั้ง เมทิลีนบลูยังคงกระตุ้นการหายใจเมื่อใช้สารตั้งต้นทุกชนิดที่ทดสอบ แต่การสังเคราะห์ ATP เพิ่มขึ้นเฉพาะเมื่อใช้แอลฟาคีโตกลูตาเรตและกลูตาเมต ซึ่งเป็นสารตั้งต้นสองชนิดที่สร้างซักซินิล CoA เมื่อโอลิโกไมซินยับยั้ง ATP synthase ไว้ ATP ที่เพิ่มขึ้นจึงมาจากการฟอสโฟรีเลชันระดับสารตั้งต้นโดยเอนไซม์ซักซินิล CoA ไลเกสในวัฏจักรกรดซิตริก ไม่ใช่จากออกซิเดทีฟฟอสโฟรีเลชัน สีย้อมยังฟื้นศักย์เยื่อหุ้มเมื่อคอมเพล็กซ์ I และ ATP synthase ถูกยับยั้งพร้อมกันด้วย ในกรณีนี้ การใช้ออกซิเจนและ ATP เปลี่ยนแปลงไปด้วยกัน แต่เฉพาะเมื่อสารตั้งต้นเอื้อให้ใช้เส้นทางสร้าง ATP อีกเส้นทางหนึ่งได้ เมื่อใช้ซักซิเนตหรือมาเลต การหายใจเพิ่มขึ้นโดยไม่มี ATP เพิ่ม สีย้อมเดียวกัน ห้องทดลองเดียวกัน แต่เชื้อเพลิงต่างกัน คำตอบก็ต่างกัน

เมื่อผลลัพธ์ทั้งสองแยกจากกัน

กรณีที่ผลลัพธ์แยกจากกันก็มีงานตีพิมพ์รองรับและให้บทเรียนได้ไม่ต่างกัน ในการศึกษาไมโทคอนเดรียตับหนูแรทที่แยกออกมาเมื่อปี 1997 เมทิลีนบลูเร่งการหายใจในสถานะ 4 ของไมโทคอนเดรียที่ใช้ซักซิเนตและมีการควบคู่แน่นแฟ้น ทำให้อัตราส่วนการควบคุมการหายใจลดลง ผลนี้เห็นได้ตั้งแต่ 0.5 micromolar และเด่นชัดที่ 5 micromolar ซึ่งเป็นความเข้มข้นใกล้เคียงกับระดับในพลาสมาหลังฉีดเข้าหลอดเลือดดำแบบโบลัส 100 milligram ที่ 5 micromolar ไมโทคอนเดรียยังบวมด้วย แต่ความบกพร่องของการควบคู่ปรากฏก่อนที่ความเข้มข้นต่ำกว่า จึงสนับสนุนว่าการรั่วเกิดก่อนความเสียหายเชิงโครงสร้าง ไม่ได้เกิดจากความเสียหายนั้น ในไมโทคอนเดรียที่แยกการควบคู่แล้ว สีย้อมกระตุ้นการหายใจในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้นและมีจุดอิ่มตัว การใช้ออกซิเจนเพิ่มขึ้นในตัวอย่างทดลองทั้งสองแบบ แต่การสังเคราะห์ ATP ต่อออกซิเจนที่ใช้ไม่ได้เพิ่มขึ้น นี่คือตัวอย่างตามตำราของการแยกการควบคู่ร่วมกับการลำเลียงอิเล็กตรอน ซึ่งเกิดจากโมเลกุลเดียวกัน

ความแตกต่างที่เด่นชัดที่สุดมาจากจอตา ในหนูเมาส์ที่ขาด AIF และเซลล์รับแสงที่ได้รับโรเทโนน เมทิลีนบลูคงความหนาของจอตา ตัวบ่งชี้ของเซลล์รับแสง และโครงสร้างไมโทคอนเดรียไว้ อีกทั้งลดอัตราส่วน NADH ต่อ NAD และลดการทำงานของวิถีตอบสนองต่อความเครียด รวมถึงการตอบสนองต่อโปรตีนที่พับตัวไม่สมบูรณ์และไมโทฟาจี โดยทำเช่นนี้ได้โดยไม่แก้ภาวะ ATP ต่ำ การปกป้องโดยไม่ฟื้นการผลิตพลังงานหมายความว่าประโยชน์นั้นเกิดผ่านสมดุลรีดอกซ์และความสมบูรณ์ของไมโทคอนเดรีย ไม่ใช่ผ่าน ATP ที่เพิ่มขึ้น ผู้ที่ตีความว่าการอยู่รอดของเนื้อเยื่อเท่ากับการฟื้นการผลิตพลังงานจะอ่านผลการทดลองนี้ผิดไปโดยสิ้นเชิง

งานวิจัยไมโทคอนเดรียสมองเพิ่มข้อมูลด้านต้นทุนให้ภาพเดียวกันนี้ ความเข้มข้นต่ำระดับเดียวกับที่ช่วยให้กระบวนการพลังงานชีวภาพดีขึ้น ยังเพิ่มการสร้างไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ในทุกสภาวะที่ทดสอบและชะลอการกำจัดมันด้วย โดยวัดด้วยการทดสอบ Amplex ที่สอบเทียบแล้ว ไม่ใช่สีย้อมที่ไม่จำเพาะ ATP ที่มากขึ้นมาพร้อมกับสารออกซิแดนต์ที่มากขึ้น

รายการตรวจสอบสำหรับอ่านผลอย่างเป็นระบบ

คำถามสี่ข้อช่วยแยกผลที่มีการควบคู่ออกจากผลที่แยกการควบคู่

ข้อแรก วัดผลลัพธ์ใดจริง ๆ การใช้ออกซิเจนเพียงอย่างเดียวไม่สามารถบอกปริมาณ ATP ได้ การสังเคราะห์ ATP ศักย์เยื่อหุ้ม และอัตราส่วนการควบคุมการหายใจ ต่างเพิ่มข้อมูลคนละส่วนที่อิเล็กโทรดวัดออกซิเจนมองไม่เห็น คู่มืออ่านข้อกล่าวอ้างจากงานวิจัยเมทิลีนบลูอธิบายหลักการพิจารณาผลลัพธ์ที่วัดนี้อย่างละเอียด

ข้อสอง ใช้สารตั้งต้นใดเลี้ยงไมโทคอนเดรีย ผลจากซักซินิล CoA แสดงให้เห็นว่าการเลือกเชื้อเพลิงอาจเป็นตัวตัดสินว่าการหายใจที่เพิ่มขึ้นจะเปลี่ยนเป็น ATP ที่เพิ่มขึ้นได้หรือไม่

ข้อสาม ใช้ความเข้มข้นเท่าใด เมทิลีนบลูระดับ nanomolar ถึงระดับ micromolar ต่ำในไมโทคอนเดรียสมองให้ผลดีด้านพลังงานชีวภาพเล็กน้อย แต่มีต้นทุนเป็นสารออกซิแดนต์ ส่วนระดับครึ่ง micromolar ขึ้นไปในไมโทคอนเดรียตับทำให้การควบคู่เสื่อมลง และที่ 5 micromolar ยังเกิดการบวมด้วย ความเข้มข้นเป็นส่วนหนึ่งของกลไก ไม่ใช่เพียงรายละเอียดประกอบ

ข้อสี่ ผลนั้นมาจากแบบจำลองใด ไมโทคอนเดรียที่แยกออกมาเผยให้เห็นเส้นทางการทำงาน แต่เซลล์และเนื้อเยื่อที่ยังสมบูรณ์มีปัจจัยเพิ่มเติม ได้แก่ การขนส่ง การรีดิวซ์ไปเป็นรูปไร้สี และเส้นทางอื่นที่แข่งขันกันรับอิเล็กตรอน งานเกี่ยวกับการกำหนดปริมาณในห้องปฏิบัติการ รวมถึงเรื่องที่ว่าความเข้มข้นและขั้นตอนการทดลองกำหนดผลของเมทิลีนบลูอย่างไร เป็นสะพานเชื่อมระหว่างตัวเลขในห้องทดลองกับข้อกล่าวอ้างใด ๆ เกี่ยวกับมนุษย์

การใช้ออกซิเจนบอกการไหลของอิเล็กตรอน ATP บอกว่าพลังงานจากการไหลนั้นถูกเก็บไว้มากเพียงใด เมทิลีนบลูเปลี่ยนสิ่งใดสิ่งหนึ่งได้ และการทดลองข้างต้นแสดงผลทั้งสี่รูปแบบ ได้แก่ ทั้งสองเพิ่มขึ้น การหายใจเพิ่มขึ้นโดยให้ ATP เพิ่มเฉพาะเมื่อสารตั้งต้นเอื้อ การหายใจเพิ่มขึ้นขณะที่การควบคู่ลดลง และเนื้อเยื่อยังคงสภาพขณะที่ ATP คงเดิม ตัวเลขจากอิเล็กโทรดวัดออกซิเจนเป็นจุดเริ่มต้นของการตีความ ไม่ใช่จุดสิ้นสุด