เมทิลีนบลูและ Bartonella: ผลการศึกษาในห้องปฏิบัติการและข้อจำกัดของหลักฐานทางคลินิก

จานเพาะเชื้อกับผู้ป่วยใช้คำเดียวกันว่า “การติดเชื้อ” แต่ไม่ได้หมายถึงสิ่งเดียวกัน ในจานเพาะเชื้อ การติดเชื้อคือจำนวนโคโลนีบนวุ้นเพาะเชื้อ ส่วนในผู้ป่วย มันหมายถึงแบคทีเรียภายในเซลล์และหลอดเลือด ยาที่เคลื่อนผ่านเลือดและเนื้อเยื่อ และระบบภูมิคุ้มกันที่ทำหน้าที่ส่วนหนึ่ง หากสับสนระหว่างสองบริบทนี้ ตัวเลขที่โดดเด่นในห้องปฏิบัติการก็จะเริ่มดูเหมือนเป็นการรักษา แต่หากแยกให้ชัด ตัวเลขเดียวกันนั้นจะเป็นเพียงสิ่งที่มันเป็นจริง ๆ นั่นคือเหตุผลให้ทำการทดลองขั้นต่อไป

การแยกสองบริบทนี้คือหน้าที่ทั้งหมดของบททบทวนเรื่องเมทิลีนบลูและ Bartonella นี้ งานวิจัยในห้องปฏิบัติการสองชิ้นจากกลุ่มวิจัยเดียวกันทดสอบเมทิลีนบลูกับ Bartonella henselae ในสภาวะที่ไม่เจริญเติบโต ทั้งสองรายงานฤทธิ์ที่เด่นชัดในภาชนะแก้วและพลาสติก แต่ไม่มีงานใดทดสอบในคน

เหตุใดนักวิจัยจึงทดสอบระยะคงที่

การทดสอบยาปฏิชีวนะส่วนใหญ่ใช้เซลล์ที่กำลังเจริญเติบโต แบบจำลองนี้จึงมองข้ามกรณีที่ยากกว่า นั่นคือเซลล์ที่หยุดแบ่งตัวและทนต่อยาที่ฆ่าเซลล์ชนิดเดียวกันซึ่งกำลังเจริญเติบโตได้

Bartonella สามารถคงอยู่ในร่างกายได้ รวมถึงภายในเม็ดเลือดแดงและเซลล์เยื่อบุหลอดเลือด กลุ่มวิจัยจึงตั้งคำถามว่ายาที่ได้รับอนุมัติชนิดใดสามารถฆ่า B. henselae หลังเข้าสู่ระยะคงที่ได้ ค่า MIC ที่ต่ำเมื่อทดสอบกับเซลล์ที่กำลังเจริญเติบโตไม่ได้ทำนายความสามารถในการฆ่าเซลล์ระยะคงที่ ไรแฟมพินมีค่า MIC ต่ำมาก แต่ฆ่าเซลล์ระยะคงที่ได้ไม่ดี ขณะที่สารที่มีค่า MIC สูงกว่ากลับฆ่าเซลล์เหล่านี้ได้ดี ผู้อ่านที่ต้องการวิธีทั่วไปในการอ่านงานวิจัยลักษณะนี้สามารถดูได้ในคู่มือการอ่านงานวิจัยเมทิลีนบลู

การคัดกรองครั้งแรก: Li และคณะ, 2019

การคัดกรองระยะคงที่ปี 2019 ในวารสาร Antibiotics ใช้สายพันธุ์เดียวคือ B. henselae JK53 เพาะในอาหารเลี้ยงเชื้อ Schneider ที่มีซีรัมลูกโคในครรภ์ 10 percent ที่อุณหภูมิ 37 C และ CO2 5 percent เชื้อที่เพาะเลี้ยงหนึ่งวันส่วนใหญ่เป็นเซลล์ที่กระจายตัวและกำลังแบ่งตัว ส่วนเชื้อที่เพาะเลี้ยงห้าวัน ซึ่งมีประมาณ 10 ยกกำลัง 8 colony forming units per mL ถูกจัดเป็นระยะคงที่และมีกลุ่มเซลล์รวมตัวกันที่มองเห็นได้

การทดสอบใช้ SYBR Green I ร่วมกับโพรพิเดียมไอโอไดด์ โดยสอบเทียบกับส่วนผสมของเซลล์มีชีวิตและเซลล์ที่ฆ่าด้วยไอโซโพรพานอล เนื่องจากเมทิลีนบลูมีสีเข้ม ผลของสารที่ผ่านการคัดกรองจึงได้รับการยืนยันด้วยกล้องจุลทรรศน์ แล้วจึงยืนยันด้วยการนับโคโลนีบนวุ้นเลือด ซึ่งเป็นเกณฑ์ประเมินที่เข้มงวดกว่า

จากยาที่ได้รับอนุมัติ 1,581 ชนิดที่ความเข้มข้น 50 micromolar เมทิลีนบลูเหลือสัดส่วนเซลล์มีชีวิต 16 percent เมื่อวัดด้วยเครื่องอ่านเพลต และ 25 percent เมื่อประเมินด้วยกล้องจุลทรรศน์ แดปโตมัยซินได้ 21 percent ยากลุ่มอะโซลหลายชนิดได้ 22 ถึง 27 percent เจนตามัยซิน 32 percent อีริโทรมัยซิน 66 percent และซิโปรฟลอกซาซิน 74 percent ไพร์วิเนียมพาโมเอตดูมีฤทธิ์สูงกว่าเมื่อวัดด้วยเครื่องอ่านเพลต แต่ไม่สามารถประเมินด้วยกล้องจุลทรรศน์ได้เนื่องจากตัวสารเองมีการเรืองแสง

เมื่อทดสอบกับ B. henselae ที่กำลังเจริญเติบโต ค่า MIC ของเมทิลีนบลูอยู่ที่ 0.08 ถึง 0.16 micrograms per mL เมื่อทดสอบกับเซลล์ระยะคงที่อายุห้าวันที่ความเข้มข้น 5 micrograms per mL จำนวนโคโลนีลดลงจนตรวจไม่พบหลังสัมผัสสารหนึ่งวัน เช่นเดียวกับแดปโตมัยซินและไพร์วิเนียมพาโมเอตที่ความเข้มข้นที่ทดสอบ การทดลองการฆ่าเชื้อตามเวลาอีกชุดหนึ่งใช้ 10 micrograms per mL ค่าดังกล่าวเป็นระดับการสัมผัสสารในห้องปฏิบัติการ ไม่ใช่ขนาดยา และบทความก็ระบุไว้เช่นนั้น ค่าความเข้มข้นสูงสุดในพลาสมาของมนุษย์ที่ประมาณ 3.9 micrograms per mL ซึ่งบทความอ้างถึง ปรากฏเพียงเพื่อให้บริบทพื้นฐาน บทภาพรวมเภสัชจลนศาสตร์ของเมทิลีนบลูอธิบายว่าเหตุใดจึงไม่สามารถตีความค่าความเข้มข้นในพลาสมาเป็นค่าความเข้มข้นในเนื้อเยื่อได้

บทความระบุข้อจำกัดสองประการไว้อย่างชัดเจน คือไม่มีแบบจำลองไบโอฟิล์มและไม่มีการทดสอบเมทิลีนบลูร่วมกับยาอื่น กลุ่มเซลล์รวมตัวกันอายุห้าวันเป็นกลุ่มเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวระยะคงที่ ไม่ใช่การทดลองไบโอฟิล์มที่ผ่านการตรวจสอบความใช้ได้ ผู้เขียนเรียกร้องให้มีการศึกษาในสัตว์ การศึกษาการใช้ยาร่วมกัน การศึกษาไบโอฟิล์ม และการทดสอบใน Bartonella สปีชีส์อื่น

การใช้ยาร่วมกันและเซลล์จากไบโอฟิล์ม: Zheng และคณะ, 2020

การศึกษาต่อยอดปี 2020 ในวารสาร BMC Microbiology ยังคงใช้สายพันธุ์และอาหารเลี้ยงเชื้อเดิม แต่เปลี่ยนเป็นเชื้อระยะคงที่ที่เพาะเลี้ยงหกวัน และเพิ่มสองสิ่งที่งานแรกไม่มี ได้แก่ การใช้ยาสองชนิดร่วมกันและแบบจำลองเซลล์ที่ได้จากไบโอฟิล์ม

ในการทดสอบยาเดี่ยวทุกชนิดที่ความเข้มข้นเท่ากันคือ 5 micrograms per mL เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เมทิลีนบลูทำให้เหลือ 3.2 คูณ 10 ยกกำลัง 4 colony forming units per mL เทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีประมาณ 2.8 คูณ 10 ยกกำลัง 10 ซิโปรฟลอกซาซิน เจนตามัยซิน และไนโตรฟูแรนโทอินทำให้เหลือโคโลนีน้อยกว่า ณ เวลาเดียวกัน ผลนี้ต่างจากผลปี 2019 ซึ่งระดับความเข้มข้นที่ระบุเท่ากันทำให้ตรวจไม่พบโคโลนีหลังหนึ่งวัน อายุของเชื้อเพาะเลี้ยง ความหนาแน่น และวิธีจัดการแตกต่างกัน จึงได้ผลการฆ่าเชื้อที่ทำซ้ำได้ในเชิงทิศทาง แต่ขนาดของผลไม่เท่ากัน ความแปรผันระหว่างการทดลองนี้เป็นเหตุผลหนึ่งที่การตรวจสอบความปลอดภัยและปฏิกิริยาระหว่างยาตามมาตรฐานแยกความแรงของฤทธิ์ในห้องปฏิบัติการออกจากผลทางคลินิก

การคัดกรองคู่ยาเป็นส่วนที่ถูกอ้างถึงมากที่สุด ส่วนประกอบแต่ละชนิดถูกกำหนดไว้ที่ 5 micrograms per mL ทั้งอะซิโทรมัยซินร่วมกับเมทิลีนบลูและไรแฟมพินร่วมกับเมทิลีนบลูทำให้ตรวจไม่พบโคโลนีระยะคงที่เมื่อครบ 24 ชั่วโมง เช่นเดียวกับคู่ยาที่มีซิโปรฟลอกซาซินทั้งสองคู่ และมีเพียงสี่คู่นี้จาก 25 คู่ที่ทดสอบเท่านั้นที่ได้ผลดังกล่าว ไม่มีการวิเคราะห์การเสริมฤทธิ์อย่างเป็นทางการ ดังนั้นคำที่ถูกต้องคือการใช้ยาร่วมกันที่มีฤทธิ์ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ ไม่ใช่การเสริมฤทธิ์ที่พิสูจน์แล้ว

การทดลองไบโอฟิล์มทดสอบเซลล์ที่เก็บจากไบโอฟิล์มอายุน้อยซึ่งถูกรบกวนให้แตกออก ไม่ใช่การแทรกซึมเข้าไปในไบโอฟิล์มที่เจริญเต็มที่และยังคงสภาพสมบูรณ์ เชื้อถูกเพาะเลี้ยงห้าวัน จากนั้นเจือจางลงในเพลตหลุมอีกห้าวัน ยืนยันด้วยการย้อมคริสตัลไวโอเลต แล้วขูดออกก่อนให้สัมผัสยา ที่ความเข้มข้น 5 micrograms per mL เมทิลีนบลูเพียงชนิดเดียวทำให้จำนวนลดลงเหลือ 2.3 คูณ 10 ยกกำลัง 2 ภายในวันที่ 6 ซึ่งเป็นหนึ่งในผลที่ดีที่สุดของยาเดี่ยว แต่ไม่ใช่ศูนย์ คู่ยาที่มีเมทิลีนบลูทั้งสองคู่ทำให้จำนวนลดลงถึงศูนย์ภายในวันที่ 6 เช่นเดียวกับคู่ยาที่มีซิโปรฟลอกซาซินทั้งสองคู่

ผู้เขียนระบุข้อจำกัดเดียวกับที่ผู้อ่านอย่างรอบคอบจะสังเกตเห็น ได้แก่ การใช้ไบโอฟิล์มอายุน้อยที่ขูดออกแทนไบโอฟิล์มเก่าที่ยังคงสภาพสมบูรณ์ การใช้ความเข้มข้นเดียวที่สะดวกสำหรับยาทุกชนิดแทนระดับสูงสุดที่สมจริงของยาแต่ละชนิด การเลือกทดสอบเฉพาะคู่ยาที่มีอะซิโทรมัยซินหรือไรแฟมพินเป็นหลัก การใช้เพียงสายพันธุ์เดียว ไม่มีสัตว์ทดลอง และไม่มีผู้ป่วย มีการเสนอให้ศึกษาการใช้ยาสามชนิดร่วมกันในภายหลัง แต่ยังไม่ได้รายงานผล

เปรียบเทียบการออกแบบการศึกษา

ตารางนี้สรุปประเด็นหลักของบทความอย่างกระชับ ทุกอย่างทางซ้ายของคอลัมน์สุดท้ายเป็นงานเพาะเลี้ยงเชื้อ ไม่มีสิ่งใดในงานวิจัยทั้งสองชิ้นที่อยู่ในคอลัมน์สุดท้าย

Bartonella ไม่ใช่ Borrelia

งานวิจัยทั้งสองชิ้นกล่าวถึง Borrelia burgdorferi ซึ่งเป็นแบคทีเรียกลุ่มสไปโรขีตที่ก่อโรคไลม์ เพราะการทดสอบด้วยสีย้อมมาจากงานก่อนหน้าที่ศึกษาระยะคงที่ของ Borrelia ในห้องปฏิบัติการเดียวกัน ซึ่งเมทิลีนบลูและแดปโตมัยซินก็ผ่านการคัดกรองว่ามีฤทธิ์เช่นกัน ประวัตินี้เป็นบริบทที่มีประโยชน์และเป็นแหล่งที่มาของความเข้าใจผิดที่พบได้บ่อย

ไม่มีการทดลองใดในงานวิจัย Bartonella ทั้งสองชิ้นที่ทดสอบ Borrelia เทียบกับ Bartonella โดยตรง จุลชีพต่างกัน อาหารเลี้ยงเชื้อต่างกัน ความเข้มข้นต่างกัน และสมมติฐานเรื่องผลของเมทิลีนบลูต่อเยื่อหุ้มเซลล์ใน Bartonella ก็ถูกระบุว่าเป็นข้อสันนิษฐานที่ต้องศึกษาเพิ่มเติม ไม่ควรนำผลไปใช้ข้ามสปีชีส์ และไม่มีงานใดสนับสนุนข้อกล่าวอ้างกว้าง ๆ เกี่ยวกับปรสิต บทเปรียบเทียบเซลล์คงทนของ Borrelia และ Bartonella จึงแยกวรรณกรรมวิจัยทั้งสองกลุ่มออกจากกันด้วยเหตุนี้

เหตุใดผลเพาะเชื้อจึงไม่กลายเป็นแนวทางการรักษา

ความสนใจค้นหาแนวทางการใช้เมทิลีนบลูกับ Bartonella เป็นเรื่องที่เข้าใจได้ งานวิจัยเหล่านี้คือเหตุผลที่ควรมองวลีดังกล่าวเป็นสัญญาณเตือน แทนที่จะเป็นรายการของที่ต้องซื้อ

ประการแรก 5 micrograms per mL ในหลุมเพาะเชื้อไม่ใช่ใบสั่งยา ค่านี้ไม่ได้รวมเรื่องการดูดซึม การกระจายตัว การจับกับโปรตีน การแทรกซึมเข้าสู่เซลล์ หรือความสามารถในการทนต่อยา ผู้เขียนเลือกค่านี้เป็นค่าเฉลี่ยโดยประมาณของระดับสูงสุดของยาปฏิชีวนะ และระบุว่างานในอนาคตควรใช้ยาแต่ละชนิดในระดับที่สมจริงของยานั้น

ประการที่สอง โคโลนีเป็นศูนย์หมายถึงไม่พบโคโลนีภายใต้เงื่อนไขการเพาะบนเพลตเหล่านั้น ไม่ได้หมายถึงเนื้อเยื่อที่ปราศจากเชื้อ เซลล์คงทน แบคทีเรียภายในเซลล์ และข้อจำกัดในการเก็บตัวอย่าง ล้วนอยู่นอกขอบเขตของเพลตวุ้นเพาะเชื้อ

ประการที่สาม คู่ยาที่กำจัดเชื้อในหลุมเพาะเชื้อได้หมดอาจไม่ได้ผลหรือก่ออันตรายในร่างกาย อะซิโทรมัยซินร่วมกับเมทิลีนบลูและไรแฟมพินร่วมกับเมทิลีนบลูเป็นคู่ยาที่ทดสอบในห้องปฏิบัติการ ณ ระดับการสัมผัสสารในห้องปฏิบัติการ หากไม่มีข้อมูลเภสัชจลนศาสตร์ในสัตว์และข้อมูลการศึกษาในมนุษย์แบบมีกลุ่มควบคุม ก็ยังไม่มีขนาดยา ระยะเวลาการใช้ หรืออัตราส่วนประโยชน์ต่อความเสี่ยง ผู้ที่กำลังพิจารณาทางเลือกควรหารือกับแพทย์และทบทวนว่าเมื่อใดการใช้เมทิลีนบลูจำเป็นต้องอยู่ภายใต้การดูแลทางการแพทย์ ก่อนสรุปสิ่งใดจากข้อมูลในจานเพาะเชื้อ

ข้อสรุปในขอบเขตจำกัดที่งานวิจัยเหล่านี้สนับสนุนได้คือ เมทิลีนบลูมีฤทธิ์ต่อ B. henselae JK53 ที่ไม่เจริญเติบโตในการทดลองนอกสิ่งมีชีวิต โดยให้ผลที่ทำซ้ำได้ รวมถึงเมื่อใช้ร่วมกับยาอีกชนิดในห้องปฏิบัติการ และผลที่เด่นที่สุดของการใช้ยาร่วมกันและการทดสอบเซลล์จากไบโอฟิล์มมาจากการศึกษาปี 2020 ส่วนประเด็นอื่นทั้งหมด รวมถึงฤทธิ์ดังกล่าวมีความสำคัญต่อโรคติดเชื้อ Bartonella ในมนุษย์หรือไม่ ยังไม่ได้รับการทดสอบ