สเปกตรัมการดูดกลืนแสงและสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงเชิงโมลของเมทิลีนบลู: ข้อมูลอ้างอิงพร้อมระบุสภาวะ

สเปกตรัมของเมทิลีนบลูดูเรียบง่าย จนกระทั่งคุณพยายามนำตัวเลขจากสเปกตรัมนั้นไปใช้ต่อ ห้องปฏิบัติการหนึ่งรายงานสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงเชิงโมลใกล้ 82,000 อีกแห่งรายงาน 67,000 และแห่งที่สามรายงานมากกว่า 100,000 ทั้งสามค่าอาจอธิบายผลการวัดของตนได้อย่างถูกต้อง แต่ไม่มีค่าใดเป็นค่าคงที่สากลของสีย้อมนี้

ความสับสนเกิดจากการนำสองแนวคิดที่แตกต่างกันมาปะปนกัน ค่าการดูดกลืนแสงเป็นค่าที่วัดจากสารละลายหนึ่งในเซลล์วัดหนึ่ง ส่วนสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงเชิงโมล ซึ่งมักเขียนแทนด้วยเอปไซลอน เป็นพารามิเตอร์ในแบบจำลองของสารละลายนั้น เมื่อเมทิลีนบลูเปลี่ยนสถานะการรวมตัว แบบจำลองก็เปลี่ยน และพารามิเตอร์จึงเปลี่ยนตามไปด้วย แนวปฏิบัติที่มีประโยชน์คือมองค่าสัมประสิทธิ์ทุกค่าเป็นค่าที่ต้องมีข้อมูลกำกับ ได้แก่ ความยาวคลื่น ตัวทำละลาย pH หรือบัฟเฟอร์ อุณหภูมิ ช่วงความเข้มข้น และความยาวทางเดินแสง

แถบโมโนเมอร์ในสารละลายน้ำเจือจาง

ในสารละลายน้ำเจือจาง แถบหลักของแคตไอออนเมทิลีนบลูอยู่ใกล้ 664 ถึง 665 nm โดยค่าที่มักอ้างอิงอยู่ในช่วง 664 ถึง 668 nm ขึ้นอยู่กับเครื่องมือและวิธีสอบเทียบ แถบนี้เหมาะสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณเมื่อสารละลายเจือจางพอที่สีย้อมส่วนใหญ่จะอยู่ในรูปโมโนเมอร์

ค่าจากวรรณกรรมสามค่าแสดงให้เห็นว่าเหตุใดสภาวะจึงสำคัญกว่าตัวเลขที่ยกมาอ้าง นักวิจัยด้านดินเหนียวที่ควบคุมตัวอย่างสารละลายน้ำให้มีความเข้มข้นต่ำกว่าประมาณ 7 micromolar ในเซลล์ขนาด 1 cm รายงานค่าเอปไซลอนประมาณ 82,000 M-1 cm-1 ที่ 665 nm ค่านี้มีข้อมูลรองรับอย่างละเอียดเป็นพิเศษว่าเป็นความชันของการสอบเทียบเชิงประจักษ์สำหรับตัวอย่างสารละลายน้ำที่เจือจางมาก ต่อมา การสอบเทียบจากงานวิจัยต้นฉบับในน้ำปราศจากไอออน ซึ่งใช้ความเข้มข้น 2.34 ถึง 37.52 micromolar และทางเดินแสง 1 cm ให้ค่าประมาณ 67,100 M-1 cm-1 ที่ 665 nm สำหรับสีย้อมทั้งหมด ผลที่ต่ำกว่านี้เป็นสิ่งที่คาดได้ ไม่ใช่ความขัดแย้ง เพราะช่วงครึ่งบนของช่วงความเข้มข้นที่ใช้สอบเทียบมีไดเมอร์อยู่ในปริมาณที่มีนัยสำคัญแล้ว ค่าที่สาม คือประมาณ 73,460 M-1 cm-1 ที่ 664 nm มาจากงานที่ pH 6.86 และ 293 K ซึ่งแยกสเปกตรัมที่สังเกตได้ออกเป็นส่วนของโมโนเมอร์และไดเมอร์ ดังสรุปไว้ใน บทความปริทัศน์เชิงวิพากษ์ล่าสุดเกี่ยวกับโฟโตฟิสิกส์ของเมทิลีนบลู ตัวเลขนี้เป็นองค์ประกอบโมโนเมอร์ที่ได้จากการแยกองค์ประกอบสเปกตรัม ไม่ใช่ความชันโดยตรงของค่าการดูดกลืนแสงเทียบกับความเข้มข้นของสีย้อมทั้งหมด

ข้อสำคัญในทางปฏิบัติคือ เลือกค่าสัมประสิทธิ์ที่มีสภาวะตรงกับตัวอย่างของคุณ หรือทำการสอบเทียบเอง อย่านำค่า 82,000 ไปใช้กับการวิเคราะห์ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 30 micromolar แล้วถือว่าความสัมพันธ์เชิงเส้นยังคงใช้ได้

ไหล่พีกด้านความยาวคลื่นสั้นเป็นผลรวมของหลายองค์ประกอบ

เมื่อความเข้มข้นเพิ่มขึ้น ไหล่พีกใกล้ 600 ถึง 615 nm จะสูงขึ้นเมื่อเทียบกับพีกที่ 664 nm งานวิจัยสมัยใหม่มักระบุว่าส่วนที่มาจากไดเมอร์ชนิด H อยู่ใกล้ 605 ถึง 610 nm การวิเคราะห์สเปกตรัมเมทิลีนบลูในน้ำแบบรวมทั้งชุด แยกค่าสูงสุดของไดเมอร์ได้ที่ 607 nm และค่าสูงสุดของกลุ่มรวมตัวระดับสูงกว่าที่ 600 nm พร้อมองค์ประกอบเรโซแนนซ์ของโมโนเมอร์ที่ 664 และ 650 nm สามารถอ่านฉบับเต็มได้ผ่าน ระเบียนแบบเปิดให้เข้าถึงของ PMID 33251415

ไม่ควรระบุว่าไหล่พีกนั้นเป็นค่าการดูดกลืนแสงของไดเมอร์ล้วน ๆ โครงสร้างไวโบรนิกของโมโนเมอร์ก็มีส่วนในบริเวณเดียวกันด้วย ดังนั้นความสูงที่วัดได้จึงเป็นผลจากการซ้อนทับของหลายองค์ประกอบ การฟิตข้อมูลร่วมกันทั้งชุดในงานหนึ่งพบว่าแบบจำลองโมโนเมอร์ร่วมกับไดเมอร์ไม่สามารถอธิบายข้อมูลได้ตลอดช่วง 1.1 micromolar ถึง 3.4 millimolar แต่เมื่อเพิ่มเตตระเมอร์เข้าไปจึงให้ผลการฟิตดีที่สุด โดยตรวจพบสัญญาณของเตตระเมอร์ได้แล้วที่ความเข้มข้นต่ำกว่า 34 micromolar ค่าสัมประสิทธิ์ขององค์ประกอบที่ได้จากการฟิตมีค่าสูง ได้แก่ ประมาณ 107,800 M-1 cm-1 ที่ 664 nm สำหรับองค์ประกอบหลักของโมโนเมอร์ ประมาณ 101,400 สำหรับไดเมอร์ที่ 607 nm และประมาณ 138,500 สำหรับเตตระเมอร์ที่ 600 nm ในน้ำปราศจากไอออนที่ไม่เติมบัฟเฟอร์ โดยมีโซเดียมคลอไรด์ตั้งแต่ 0 ถึง 0.15 M และอุณหภูมิตั้งแต่ 282 ถึง 333 K ค่าเหล่านี้เป็นส่วนที่แยกได้ด้วยแบบจำลอง จึงต้องไม่นำไปใช้แทนความชันเชิงประจักษ์ตามกฎเบียร์–แลมเบิร์ต

มีการวัดความแรงของการเกิดไดเมอร์เชิงปริมาณโดยตรง งานศึกษาหนึ่งที่ pH 6.86 และ 293 K ได้ค่าคงที่การเกิดไดเมอร์ใกล้ 3,900 M-1 ขนาดของค่านี้อธิบายได้ว่าเหตุใดสารละลายสำหรับใช้งานที่ความเข้มข้น 5 micromolar จึงมีพฤติกรรมเกือบเป็นเชิงเส้น ขณะที่สารละลายตั้งต้นที่ความเข้มข้น 50 micromolar ไม่เป็นเช่นนั้น สิ่งที่ควรตรวจสอบระหว่างพัฒนาวิธีคืออัตราส่วนของค่าการดูดกลืนแสงใกล้ 610 nm ต่อค่าการดูดกลืนแสงใกล้ 665 nm เมื่ออัตราส่วนนี้เพิ่มขึ้นตามความเข้มข้น ค่าเอปไซลอนที่ 664 nm ก็ไม่ได้อธิบายสารชนิดเดียวที่คงเดิมอีกต่อไป

ในช่วงความเข้มข้นที่สารสองชนิดซึ่งเปลี่ยนกลับไปมาระหว่างกันมีบทบาทหลัก สเปกตรัมอาจมีจุดไอโซสเบสติกร่วมกัน ซึ่งในการทดลองกับชุดสารละลายน้ำพบใกล้ 625 nm จุดร่วมที่ชัดเจนและไม่เคลื่อนตำแหน่งสอดคล้องกับการมีสารหลักสองชนิด เมื่อจุดนี้เคลื่อนหรือหายไปขณะความเข้มข้นเพิ่มขึ้น ให้ถือเป็นสัญญาณเตือนว่ามีกลุ่มรวมตัวระดับสูงกว่าหรือการเปลี่ยนสมดุลเข้ามาเกี่ยวข้อง ไม่ใช่ความผิดพลาดของเครื่องมือ

ตัวทำละลาย pH และอุณหภูมิทำให้สเปกตรัมเปลี่ยน

น้ำเอื้อต่อการรวมตัว การเติมไดเมทิลซัลฟอกไซด์ลดการเกิดไดเมอร์ ทำให้ค่าสูงสุดของการดูดกลืนแสงและการเรืองแสงเลื่อนไปยังความยาวคลื่นที่ยาวขึ้น และเพิ่มผลได้ควอนตัมการเรืองแสงประมาณสี่เท่า ตาม งานศึกษาผลของตัวทำละลายต่อเมทิลีนบลูในน้ำและสารผสม DMSO ซึ่งมีระเบียน PMID 30933781 งานนี้อธิบายสเปกตรัมในน้ำด้วยสมดุลโมโนเมอร์–ไดเมอร์ โดยการดูดกลืนแสงของโมโนเมอร์อยู่ใกล้ 650 ถึง 670 nm และของไดเมอร์อยู่ใกล้ 580 ถึง 615 nm และคำนวณค่าคงที่การเกิดไดเมอร์จากสเปกตรัมที่ 293.15 K

แอลกอฮอล์เปลี่ยนทั้งตำแหน่งและความเข้มปรากฏ แต่ไม่ได้ทำให้การรวมตัวหมดไป ในการเปรียบเทียบจากงานวิจัยต้นฉบับหนึ่งที่ความเข้มข้น 31.3 micromolar และอุณหภูมิห้อง ซึ่งรายงานใน งานศึกษาตัวทำละลายของเมทิลีนบลู ค่าสูงสุดด้านความยาวคลื่นยาวอยู่ที่ 665 nm ในน้ำ แต่เป็น 655 nm ในเมทานอล โดยค่าปรากฏของสารละลายทั้งหมดอยู่ใกล้ 37,100 ในน้ำ และ 60,800 ในเมทานอล การตรวจสอบความใช้ได้อีกงานหนึ่งในเอทานอลไร้น้ำที่ 298 K ให้ค่าสูงสุดที่ 655 nm พร้อมค่าเอปไซลอนใกล้ 68,000

การเปลี่ยน pH ในช่วงทั่วไปทำให้สเปกตรัมเปลี่ยนน้อยกว่าที่ขั้นตอนทดลองหลายวิธีคาดไว้ บทความปริทัศน์เชิงวิพากษ์ที่อ้างถึงข้างต้นรายงานว่า ตั้งแต่ประมาณ pH 2 ถึง pH 12 ค่าสูงสุดยังคงอยู่ใกล้ 665 nm โดยความเข้มเปลี่ยนเพียงเล็กน้อยจนถึง pH 11 ชนิดของบัฟเฟอร์และความแรงไอออนิกอาจทำให้ผลเปลี่ยนได้มากพอ ๆ กับค่า pH ที่ระบุไว้ ดังนั้นควรบันทึกบัฟเฟอร์และเกลือที่ใช้จริง ไม่ใช่เพียงค่าที่อ่านจากเครื่องวัด pH กรดแก่หรือด่างแก่เป็นอีกกรณีหนึ่ง เพราะสีย้อมอาจเกิดการเปลี่ยนแปลงทางเคมีแทนการรวมตัวแบบผันกลับได้ อุณหภูมิและเกลือก็เปลี่ยนสมดุลเช่นกัน จึงเป็นเหตุผลที่งานศึกษาในน้ำปี 2020 ตั้งใจปรับทั้งสองปัจจัย

การวัดเพื่อให้ตัวเลขยังใช้ได้อย่างถูกต้อง

งานเชิงปริมาณอาศัยความสัมพันธ์ตามกฎเบียร์–แลมเบิร์ต ซึ่งค่าการดูดกลืนแสงเท่ากับเอปไซลอนคูณความเข้มข้นคูณความยาวทางเดินแสง พร้อมหลักฐานว่าช่วงเชิงเส้นนั้นใช้ได้จริงภายใต้สภาวะของคุณ

ใช้เซลล์ขนาด 1 cm สำหรับงานที่ความเข้มข้นระดับ micromolar ต่ำ ๆ เมื่อค่าเอปไซลอนใกล้ 82,000 ความเข้มข้น 5 micromolar จะให้ค่าการดูดกลืนแสงใกล้ 0.41 และ 10 micromolar ให้ค่าประมาณ 0.82 สำหรับการวัดที่เน้นโมโนเมอร์ในน้ำเปล่า การคงความเข้มข้นไว้ใกล้หรือต่ำกว่าประมาณ 5 ถึง 7 micromolar ปลอดภัยกว่าการสอบเทียบไปถึงช่วงหลายสิบ micromolar สำหรับสารละลายตั้งต้นเข้มข้น ให้ลดความยาวทางเดินแสงแทนการยอมรับค่าการดูดกลืนแสงที่สูงกว่า 1 มาก

ใช้สารละลายแบลงก์ที่มีเมทริกซ์เหมือนกันทุกประการ ได้แก่ น้ำเกรดเดียวกัน สัดส่วนตัวทำละลายร่วมเท่ากัน บัฟเฟอร์และเกลือเหมือนกัน แต่ไม่มีสีย้อม เตรียมสารสำหรับสอบเทียบในเมทริกซ์เดียวกันและที่อุณหภูมิเดียวกัน ระหว่างพัฒนาวิธี ให้สแกนตลอดช่วงแสงที่มองเห็น โดยควรครอบคลุมประมาณ 550 ถึง 750 nm แทนการอ่านเพียงความยาวคลื่นเดียว ติดตามรูปร่างสเปกตรัม ไม่ใช่เพียงความสูง หากการเจือจางเป็นลำดับทำให้รูปร่างสเปกตรัมหลังปรับมาตรฐานเปลี่ยนไป แสดงว่าระบบมีพฤติกรรมทางเคมีที่ขึ้นกับความเข้มข้น ตำแหน่งค่าสูงสุดที่คงที่และอัตราส่วนค่าการดูดกลืนแสงที่ 610 ต่อ 665 nm ที่คงที่เป็นหลักฐานว่าช่วงนั้นยอมรับได้ที่หนักแน่นกว่าค่า R กำลังสองสูงเพียงอย่างเดียว

บันทึกรูปแบบของสารเคมี วัสดุที่จำหน่ายอาจเป็นเมทิลไทโอนิเนียมคลอไรด์ชนิดไร้น้ำ หรือไฮเดรต เช่น ไตรไฮเดรต ดังนั้นมวลโมลาร์ที่ใช้คำนวณสารละลายตั้งต้นต้องตรงกับสารในขวดจริง ขั้นตอนนี้เพียงอย่างเดียวก็อธิบายความไม่ตรงกันบางส่วนของค่าความเข้มข้นเชิงโมลที่ระบุระหว่างห้องปฏิบัติการได้ ความรอบคอบแบบเดียวกันนี้จำเป็นเมื่อใช้ผลในการคำนวณการวิเคราะห์เชิงปริมาณ เมื่อใช้สเปกตรัมประกอบการตรวจสอบความคงตัวของสูตร และเมื่อข้อมูลสิ่งเจือปนทำให้ต้องทบทวนความบริสุทธิ์และข้อกำหนดคุณลักษณะ

สรุปพร้อมระบุสภาวะ

ใช้ตารางนี้เป็นแม่แบบเริ่มต้นสำหรับบันทึกในห้องปฏิบัติการ ไม่ใช่แหล่งของค่าคงที่ที่นำมาใช้แทนกันได้

ดังนั้น ความยาวคลื่นการดูดกลืนแสงของเมทิลีนบลูจึงเป็นคำตอบสั้น ๆ ที่ต้องมีหมายเหตุประกอบยาว รายงานพีกที่คุณวัดได้ พร้อมสารละลายและความเข้มข้นที่ใช้วัด แนวปฏิบัตินี้ช่วยป้องกันไม่ให้ค่าหนึ่งใกล้ 664 nm จากสารละลายน้ำเจือจางถูกนำไปใช้เป็นค่าคงที่สากลอย่างผิด ๆ