EMB agar เทียบกับ MacConkey agar: การเลือกอาหารเลี้ยงเชื้อและการแปลผล

นักศึกษาคนหนึ่งป้ายตัวอย่างน้ำเดียวกันลงบนเพลตสองชนิด เพลตหนึ่งเกิดโคโลนีสีเข้มที่มีเงาวาวสีเขียวแบบโลหะ อีกเพลตหนึ่งเกิดโคโลนีสีชมพูสดพร้อมวงขุ่นรอบโคโลนี ทั้งสองเพลตได้รับเชื้อจากหลอดเดียวกัน บ่มวางเคียงกัน และอ่านผลในเวลาเดียวกัน นักศึกษาจึงถามว่าเพลตไหนถูกต้อง

ทั้งสองเพลตถูกต้อง เพราะให้คำตอบต่อคำถามที่ต่างกัน ความสับสนเกิดจากการมองว่าอาหารเลี้ยงเชื้อทั้งสองชนิดใช้แทนกันได้ในการคัดกรองแบคทีเรียในลำไส้ ทั้งคู่มีจุดประสงค์ร่วมกัน คือคัดเลือกจุลินทรีย์กลุ่ม enteric แกรมลบและแยกผู้ที่หมักแลคโตสออกจากผู้ที่ไม่หมัก แต่ใช้เคมีและหลักการมองเห็นผลที่ต่างกัน เมื่อเข้าใจแนวคิดพื้นฐานทั้งสองแบบ การเลือกเพลตและการอ่านโคโลนีก็จะเป็นขั้นตอนที่ตรงไปตรงมา

คำตอบแบบสั้น

EMB agar ใช้สีย้อมสองชนิด ได้แก่ eosin Y และ methylene blue ซึ่งทำหน้าที่สองอย่างพร้อมกัน คือยับยั้งการเจริญของแกรมบวกและตกตะกอนรอบจุลินทรีย์ที่สร้างกรดอย่างมาก ทำให้เกิดโคโลนีสีเข้ม โดยในกรณีคลาสสิก Escherichia coli จะแสดงเงาวาวสีเขียวแบบโลหะ ส่วน MacConkey agar แยกหน้าที่เหล่านี้ออกจากกัน: bile salts ร่วมกับ crystal violet ยับยั้งแกรมบวก แลคโตสเป็นสารตั้งต้นสำหรับการหมัก และ neutral red แสดงการเกิดกรดเป็นโคโลนีสีชมพูหรือแดง หากต้องการสาธิต E. coli แบบสันนิษฐานเบื้องต้นที่เห็นได้ชัด EMB มีความเหมาะสม หากต้องการแยกผู้หมักแลคโตสออกจากผู้ไม่หมักอย่างง่ายด้วยสีชมพูกับไม่มีสี โดยเฉพาะในกระบวนการทำงานกับอุจจาระหรือปัสสาวะ MacConkey มักอ่านผลง่ายกว่า อย่างไรก็ตาม ไม่มีเพลตชนิดใดที่สามารถระบุชนิดของจุลินทรีย์ได้จากสีเพียงอย่างเดียว

EMB: สีย้อมที่ทั้งคัดเลือกและรายงานผลในคราวเดียว

แนวคิดของ EMB รวมการคัดเลือกและการบ่งชี้ผลไว้ในโมเลกุลชุดเดียวกัน โพรโทคอล eosin methylene blue agar ของ ASM อธิบายว่า EMB เป็นทั้งอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเลือกจำเพาะและแบบจำแนกความแตกต่าง โดยสีย้อมคู่นี้ยับยั้งจุลินทรีย์แกรมบวกจำนวนมาก ขณะที่การหมักแลคโตสทำให้สีย้อมถูกดูดจับและตกตะกอน สูตร Levine มาตรฐานประกอบด้วย peptone, lactose, phosphate, eosin Y, methylene blue และ agar ตามที่ระบุไว้ใน วิธี FDA BAM สำหรับ Levine EMB agar ควรสังเกตว่าสูตร EMB รุ่นเก่าบางสูตรเติม sucrose ร่วมกับ lactose ขณะที่ Levine EMB มี lactose แต่ไม่มี sucrose ดังนั้นควรบันทึกให้ชัดเจนว่าห้องปฏิบัติการของคุณใช้สูตรใด

การอ่านผล EMB คือการอ่านพฤติกรรมของสีย้อม การหมักแลคโตสอย่างรุนแรงสร้างกรดมากพอให้เกิดการตกตะกอนของสีย้อมอย่างมาก ทำให้ E. coli มีจุดกึ่งกลางสีน้ำเงินดำเข้ม และในกรณีคลาสสิกจะเกิดเงาวาวสีเขียวแบบโลหะเมื่อมองด้วยแสงสะท้อน ผู้หมักที่อ่อนกว่า เช่น Enterobacter และ Klebsiella โดยทั่วไปจะเจริญเป็นโคโลนีเมือกสีชมพูถึงม่วงโดยไม่มีเงาวาวดังกล่าว ส่วนผู้ไม่หมัก เช่น Salmonella, Shigella และ Proteus มักเจริญเป็นโคโลนีไม่มีสีหรือโปร่งแสง เพราะไม่สร้างกรดอย่างรวดเร็วมากพอที่จะทำให้สีย้อมตกตะกอน แกรมบวกมักถูกยับยั้ง แต่ระดับการยับยั้งแตกต่างกันตามสายพันธุ์และผลิตภัณฑ์ รายละเอียดเคมีของการเตรียมสีย้อม รวมถึงเหตุผลที่ methylene blue มีพฤติกรรมเป็นสีย้อมแคตไอออนตั้งแต่ต้น เหมาะกับการอธิบายแยกต่างหากเกี่ยวกับสูตรสีย้อม ส่วนบริบททั่วไปด้านกล้องจุลทรรศน์อยู่ใน แอตลาสวิธีการย้อมสี บทความนี้มุ่งเฉพาะการเลือกเพลตและการอ่านผล

ภาพด้านบนเป็นภาพประกอบ แสดงหลักการมองเห็นผลที่ควรคาดหวัง ได้แก่ โคโลนีสีเข้มมีเงาวาว โคโลนีเมือกสีชมพู และโคโลนีสีซีดบน EMB เทียบกับโคโลนีสีชมพูและสีซีดบน MacConkey ใช้ภาพนี้เพื่อเรียนรู้รูปแบบ จากนั้นตรวจสอบการแปลผลทุกครั้งกับภาพถ่ายตัวควบคุมและเอกสารกำกับผลิตภัณฑ์ของอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเดียวกับที่ใช้อยู่บนโต๊ะปฏิบัติการ

MacConkey: แยกหน้าที่ออกจากกัน กฎการมองผลจึงง่ายกว่า

แนวคิดของ MacConkey กำหนดหน้าที่แต่ละอย่างให้กับส่วนประกอบคนละชนิด โพรโทคอล MacConkey agar ของ ASM อธิบายในกรอบเดียวกันว่าเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเลือกจำเพาะและแบบจำแนกความแตกต่าง และ วิธี FDA BAM สำหรับ MacConkey agar ระบุส่วนประกอบที่ทำหน้าที่ ได้แก่ peptones, lactose, bile salts, salt, neutral red, crystal violet และ agar โดย bile salts ร่วมกับ crystal violet ทำหน้าที่คัดเลือกโดยยับยั้งแกรมบวก Lactose เป็นสารตั้งต้นสำหรับการหมัก ส่วน neutral red ทำหน้าที่เป็นตัวรายงาน pH โดยเปลี่ยนเป็นสีชมพูถึงแดงในบริเวณที่เกิดกรด และบางครั้งจะมี bile ตกตะกอนรอบผู้หมักที่รุนแรง

กฎการอ่านผลตั้งใจให้เรียบง่าย: สีชมพูหมายถึงผู้หมักแลคโตส ส่วนไม่มีสีหรือสีซีดหมายถึงผู้ไม่หมัก E. coli มีสีชมพูถึงแดง และมักมีวงตะกอน bile ล้อมรอบ Klebsiella และ Enterobacter มีสีชมพูและมักมีลักษณะเป็นเมือกเนื่องจากแคปซูล Salmonella, Shigella, Proteus และแบคทีเรียแท่งแกรมลบอื่นอีกหลายชนิดมีลักษณะไม่มีสี อีกประโยชน์หนึ่งที่สำคัญในห้องปฏิบัติการเพื่อการสอนคือ bile salts โดยทั่วไปช่วยลดการแผ่กระจายแบบ swarming ของ Proteus ทำให้ได้โคโลนีแยกเดี่ยวบน MacConkey ได้ง่ายกว่าอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่เลือกจำเพาะ อย่างไรก็ตาม การยับยั้งไม่สมบูรณ์เสมอไป และยังมีสูตรปราศจากเกลือสำหรับกรณีที่การควบคุม swarming เป็นเป้าหมายหลัก

เหตุผลระดับโมเลกุลที่ทำให้สีย้อมมีพฤติกรรมเช่นนี้เกี่ยวข้องกับประจุและโครงสร้าง Methylene blue เป็นสีย้อม phenothiazine แบบแคตไอออน ซึ่ง โครงสร้างและสมบัติ อธิบายความชอบในการจับกับพื้นผิวแบคทีเรียที่เป็นกรด และเป็นคุณสมบัติเดียวกันกับที่ทำให้เกิดการตกตะกอนในบริเวณที่เป็นกรดบน EMB

เปรียบเทียบโดยสรุป

ให้อ่านตารางนี้เสมือนขั้นตอนตัดสินใจ เมื่อการทดลองต้องการให้นักศึกษาเห็นระดับความแรงของการหมักที่ไล่เป็นช่วงและมีจุดปลายที่เด่นชัด EMB จะแสดงสิ่งนั้นได้ เมื่อการทดลองต้องการแยกแบบสองกลุ่มอย่างรวดเร็วก่อนยืนยันด้วยการทดสอบทางชีวเคมี MacConkey จะแสดงผลได้ชัดเจนกว่า

ควรใช้อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดใดกับตัวอย่างแบบใด

สำหรับการทดลองกับน้ำที่มุ่งสังเกต fecal coliform หรือ E. coli แบบสันนิษฐานเบื้องต้น EMB มีความน่าสนใจเพราะเงาวาวมีลักษณะเด่นชัด MacConkey ก็รองรับแบคทีเรีย enteric แกรมลบและมีประวัติการใช้กับงานตรวจน้ำเช่นกัน แต่เพลตทั้งสองชนิดไม่สามารถใช้แทนวิธีมาตรฐานตามข้อกำหนดสำหรับการตรวจน้ำ ซึ่งอาจกำหนดให้ใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ เช่น modified mTEC หรือ MI ตามชนิดการทดสอบ ตรวจสอบวิธีที่ห้องปฏิบัติการของคุณต้องปฏิบัติตาม

สำหรับการแยกผู้หมักออกจากผู้ไม่หมักในตัวอย่างลักษณะเดียวกับอุจจาระ โดยทั่วไป MacConkey มีประโยชน์มากกว่าในสองตัวเลือกนี้ งานตรวจอุจจาระเชิงปฏิบัติสำหรับ Salmonella หรือ Shigella มักเพิ่มอาหารเลี้ยงเชื้อ enteric ที่มีความเลือกจำเพาะสูงกว่า เช่น XLD หรือ Hektoen enteric แทนการพึ่ง MacConkey เพียงอย่างเดียว

สำหรับการสอนด้วยตัวอย่างลักษณะเดียวกับปัสสาวะที่จำลองกระบวนการทำงานทางคลินิก ให้ใช้ MacConkey คู่กับ blood agar โดย MacConkey ช่วยคัดแยกแกรมลบในระยะแรก ส่วน blood agar ช่วยให้จุลินทรีย์ที่ MacConkey ยับยั้งสามารถเจริญได้ การใช้คู่นี้เป็นแนวทางมาตรฐานในคำอธิบายทางคลินิกเกี่ยวกับการเตรียมเพาะเชื้อจากปัสสาวะ

สำหรับการสอนแนวคิดล้วน ๆ ให้ใช้ทั้งสองชนิด EMB แสดงให้เห็นว่าความแรงของการหมักมีความสำคัญและโมเลกุลหนึ่งชนิดสามารถทำหน้าที่ได้สองอย่าง MacConkey แสดงแนวคิดการออกแบบแบบโมดูลาร์ โดยแยกตัวคัดเลือก สารตั้งต้น และตัวรายงานออกจากกัน นักศึกษาที่ป้าย E. coli ที่ทราบชนิดแล้ว Klebsiella aerogenes ที่ทราบชนิดแล้ว และ Salmonella ที่ทราบชนิดแล้วไว้เคียงกันบนอาหารเลี้ยงเชื้อทั้งสองแบบ มักจะไม่สับสนระหว่างหลักการทั้งสองอีก

ข้อผิดพลาดในการอ่านผลที่เกิดซ้ำทุกภาคการศึกษา

ข้อผิดพลาดที่พบบ่อยที่สุดคือระบุจุลินทรีย์จากสีเพียงอย่างเดียว สีชมพูบน MacConkey อาจเป็น E. coli, Klebsiella, Enterobacter หรือผู้หมักชนิดอื่น ส่วนไม่มีสีอาจเป็น Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas หรือผู้ไม่หมักชนิดอื่น สีเป็นฟีโนไทป์สำหรับการคัดกรองที่ใช้กำหนดทิศทางการตรวจยืนยันต่อ เช่น Gram stain, oxidase, biochemical panels หรือการระบุชนิดด้วยเครื่องมือ ไม่ใช่ชื่อของสปีชีส์

ข้อผิดพลาดที่สองคือการตีความการไม่มีเงาวาวมากเกินไป โคโลนี E. coli จริงบางโคโลนี โดยเฉพาะโคโลนีที่แยกเดี่ยว อาจมีเงาวาวแบบโลหะเพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลย การไม่มีเงาวาวไม่ได้ตัด E. coli ออก และการมีเงาวาวก็ไม่ได้พิสูจน์ว่าเป็น E. coli ให้ถือว่าเงาวาวเป็นเพียงเบาะแสเชิงสันนิษฐาน

ข้อผิดพลาดที่สามคือการเปรียบเทียบเพลตที่มีอายุต่างกัน ผู้หมักแลคโตสแบบล่าช้าอาจเปลี่ยนเป็นสีชมพูบน MacConkey หลังการบ่มเป็นเวลานาน ซึ่งทำให้เส้นแบ่งที่ชัดเจนระหว่างผู้หมักกับผู้ไม่หมักพร่ามัว อ่านผลตามชั่วโมงที่ห้องปฏิบัติการกำหนด และบันทึกระยะเวลาการบ่มพร้อมกับผล

ข้อผิดพลาดที่สี่คือการอ่านการเจริญแบบผสมว่าเป็นจุลินทรีย์ชนิดเดียว โคโลนีสีชมพูที่อยู่ข้างโคโลนีไม่มีสีแสดงฟีโนไทป์สองแบบ ไม่ใช่ลักษณะกึ่งกลาง คัดเลือกโคโลนีที่แยกออกจากกันอย่างชัดเจนและประเมินแต่ละ morphotype แยกกัน ลักษณะเป็นเมือกก็มีข้อจำกัดคล้ายกัน ทั้ง Klebsiella และ Enterobacter อาจมีลักษณะเป็นเมือกได้ ดังนั้นแคปซูลเพียงอย่างเดียวจึงไม่สามารถยืนยันชื่อได้ จุลินทรีย์ที่เคยสอนในชื่อ Enterobacter aerogenes ปัจจุบันจัดอยู่ในชื่อ Klebsiella aerogenes ซึ่งอธิบายได้ว่าทำไมแผนภูมิเก่ากับฉลากใหม่จึงดูเหมือนขัดแย้งกัน

ตัวควบคุมและกฎสรุป

ใช้ตัวควบคุมจากภาพถ่ายหรือตัวควบคุมสดทุกครั้งที่ทำการทดลอง: E. coli สำหรับปฏิกิริยาของผู้หมักที่รุนแรง Klebsiella aerogenes สำหรับการหมักแบบเป็นเมือกโดยไม่มีเงาวาวแบบคลาสสิก สายพันธุ์ Salmonella สำหรับปฏิกิริยาของผู้ไม่หมักที่ไม่มีสี และ Staphylococcus aureus เพื่อยืนยันการยับยั้งแกรมบวกบนผลิตภัณฑ์ที่คุณใช้อยู่จริง จับคู่หมายเลขสายพันธุ์และเกณฑ์การยอมรับกับเอกสารกำกับของผู้ผลิต เนื่องจากความสามารถในการเลือกจำเพาะเปลี่ยนแปลงตามปริมาณ bile, crystal violet และสีย้อม

จำประโยคเดียวไว้เมื่ออยู่ที่โต๊ะปฏิบัติการ EMB ใช้สีย้อมที่ทั้งคัดเลือกและบอกผล จึงให้สัญญาณ E. coli ที่เด่นชัด แลกกับการอ่านผลที่ต้องสังเกตรายละเอียดมากกว่า MacConkey แยกหน้าที่การคัดเลือกออกจากหน้าที่การบอกผล จึงให้การแยกสีชมพูกับสีซีดที่ตรงไปตรงมา แลกกับรายละเอียดเกี่ยวกับความแรงของการหมักที่น้อยกว่า เลือกอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีแนวคิดตรงกับคำถาม ยืนยันสีด้วยการทดสอบที่เหมาะสม แล้วเพลตทั้งสองชนิดจะไม่ใช่ตัวเลือกที่แข่งขันกัน แต่จะทำงานเสริมกัน