Озмоишҳои хамиртуруш бо кабуди метилен: ҳисоб кардани ҳуҷайраҳои зинда ва чен кардани вақти нафаскашӣ

Дар рӯйи мизи озмоишгоҳ ду найча истодааст. Ҳар ду кабуданд. Дар яке ҳуҷайраҳои кабуд дар зери микроскоп маънои хамиртуруши мурдаро доранд. Дар дигаре аз кабуд ба беранг табдил ёфтани маҳлули найча маънои онро дорад, ки хамиртуруш зинда аст ва нафас мекашад. Ҳамон як ранг, аммо тафсирҳои муқобил. Агар ин ду озмоишро омехта кунед, ҳамаи хулосаҳо баръакс мешаванд.

Тамоми мақола ба ҳамин фарқият бахшида шудааст. Кабуди метилен ранги оксиду барқароршавӣ аст: дар ҳолати оксидшуда кабуд ва дар ҳолати барқароршуда лейкометилени кабуди беранг аст. Ҳисоби қобилияти ҳаётӣ аз ин хусусияти кимиёвӣ дар мушоҳидаи кӯтоҳи микроскопӣ истифода мебарад. Озмоиши нафаскашӣ аз он дар реаксияи тамоми маҳлул, ки вақти он чен карда мешавад, истифода мебарад. Ҳар яке протоколи худ, намунаҳои назоратии худ ва муносибати интиқодии худро талаб мекунад.

Ҳисоби қобилияти ҳаётӣ: рангкунии кӯтоҳ ва арзёбии фаврӣ

Протоколи маъмул дар пивопазӣ аз ҳама бештар стандартизатсия шудааст. Кабуди метиленро бо консентратсияи 0.01% w/v дар маҳлули 2% цитрати натрий омода кунед, онро бо суспензияи хамиртуруш ба таносуби 1:1 омехта намоед ва омехтаро пас аз фосилаи кӯтоҳи муайян мушоҳида кунед. Фосилаҳои дар манбаъҳо нашршуда аз 1 то 2 дақиқа дар дастури Институти илми пивопазӣ то тақрибан 5 дақиқа дар протоколҳои таҳқиқотӣ фарқ мекунанд; усули микробиологии шароби OIV мушоҳидаро дар давоми 10 дақиқа талаб мекунад. Консентратсияи ранг дар омехтаи ҳисоб тақрибан ба 0.005% мерасад. Камераи такмилёфтаи Neubauer-ро пур кунед ва бо бузургкунии тақрибан 400x ҳуҷайраҳои кабуди тираро ғайризинда ва ҳуҷайраҳои рангнагирифтаро зинда ҳисоб кунед. Дар усули OIV ҳуҷайраҳои кабуди равшан зинда ҳисоб мешаванд, ки ин аллакай ба мушкили субъективии дар поён баррасишаванда ишора мекунад.

Консентратсияи ҳуҷайраҳо аз геометрияи камера муайян мешавад. Ҳангоми ҳисоб кардани тамоми мураббаи марказии 1 mm, шумораи ҳуҷайраҳо дар як mL ба N зарби коэффисиенти тунуккунӣ зарби 10^4 баробар аст; N шумораи ҳуҷайраҳои дар ин масоҳат ҳисобшуда мебошад, чунон ки дар усулҳои ASBC барои хамиртуруш оварда шудааст. Ҳисоби қобилияти ҳаётӣ соддатар аст: шумораи ҳуҷайраҳои рангнагирифта тақсим ба шумораи умумии ҳуҷайраҳо, зарби 100. Барои арзёбии қобилияти ҳаётӣ мувофиқи таҳқиқоти муқоисавии FEMS дар пивопазӣ ва таҷрибаи OIV тақрибан 400 ҳуҷайраро ҳисоб кунед. Як қоидаи марзиро пайваста риоя кунед, масалан, ҳуҷайраҳои рӯйи хатҳои поёнӣ ва чапи шабакаро дохил ва ҳуҷайраҳои рӯйи хатҳои болоӣ ва ростро хориҷ кунед.

Пеш аз оғози ҳисоб барои муғчаҳо қоида муайян кардан лозим аст. Тибқи қоидаи маъмул, муғча вақте ҳуҷайраи алоҳида ҳисоб мешавад, ки андозааш тақрибан ба нисфи андозаи ҳуҷайраи модарӣ расад; агар хурдтар бошад, бо ҳуҷайраи модарӣ якҷоя ҳисоб мешавад. Ҳар қоидаеро интихоб кунед, онро дар ҳамаи мураббаъҳо татбиқ намуда, дар варақаи ҳисоб нависед, то шахси навбатӣ ҳам онро такрор кунад.

Варақаи ҳисоб (инро чоп кунед)

Ин варақа маводи аслии барои ҳамин мақола таҳияшуда аст. Онро ба дафтар кӯчонед ё барои ҳар намуна як нусха чоп кунед.

Қобилияти ҳаётӣ (%) = 100 x рангнагирифта / (рангнагирифта + кабуди тира). Шумораи умумии ҳуҷайраҳо дар як mL = N x коэффисиенти тунуккунӣ x 10^4, ки N аз масоҳати муайяншудаи камера гирифта мешавад. Фосилаи рангкуниро дар паҳлуи натиҷа қайд кунед, зеро нишондиҳандаи қобилияти ҳаётӣ бе вақти ченкуниаш такроршаванда нест.

Чаро нишондиҳандаҳои қобилияти ҳаётӣ тағйир меёбанд

Вақт аввалин омили халалрасон аст ва аз ду самт таъсир мекунад. Ҳуҷайраҳои аз ҷиҳати мубодилаи моддаҳо фаъол рангро барқарор мекунанд, бинобар ин арзёбии барвақт метавонад ҳуҷайраҳои зиндаро пеш аз анҷоми барқароркунии ранг мушоҳида карда, онҳоро иштибоҳан мурда тасниф кунад. Аммо таъсири тӯлонии ранг худ заҳрнок аст ва ҳуҷайраҳои воқеан осебдидаи кабудро ба вуҷуд меорад, ки боиси рангкунии бардурӯғи марг мегардад. Аз ин рӯ, як протоколи таълимии озмоишгоҳӣ арзёбиро дар давоми 5 дақиқа талаб мекунад, чунон ки дар протоколи таълимии хамиртуруши Wisconsin қайд шудааст. Хулосаи боэҳтиёт ин аст, ки арзёбӣ бо кабуди метилен аз вақт вобаста аст; пас як фосилаи кӯтоҳро муайян кунед ва онро барои ҳар намунаи силсила яксон нигоҳ доред.

Намунаҳои дорои қобилияти ҳаётии паст манбаи дуюми ғарази ченкунӣ мебошанд. Усули стандартизатсияшуда ҳушдор медиҳад, ки кабуди метилен дар сатҳи поёнтар аз тақрибан 80% метавонад қобилияти ҳаётии воқеиро аз ҳад зиёд нишон диҳад, зеро ҳуҷайраҳое, ки ҳанӯз рангро барқарор мекунанд, ҳатман қобилияти афзоишро нигоҳ намедоранд. Адабиёти пивопазӣ низ ҳамин беэътимодиро ҳангоми хеле коҳиш ёфтани қобилияти ҳаётӣ тавсиф мекунад. Кабуди метиленро ҳамчун воситаи арзёбии зуд ва тахминӣ истифода баред ва қарорҳои муҳими марбут ба қобилияти ҳаётии паст, масалан истифодаи дубораи фарҳанги хамиртуруш, бо ҳисоб дар муҳити сахти ғизоӣ ё рангкунии иловагӣ тасдиқ кунед.

Таъсири матритсаи намуна дар ҷойи сеюм меистад. Усули OIV дар наздикии pH 4.6 гузаронида мешавад ва ҳушдор медиҳад, ки намунаҳои дорои pH паст ва буфернокии қавӣ ба рафтори дурусти ранг халал мерасонанд. Ҳамзамон он истифодаи озмоишро ҳангоми миқдори шакар аз 100 g/L зиёд тавсия намедиҳад, зеро дар ин шароит ҳуҷайраҳо кабуди равшан шуда, ба тафсири нодуруст мебаранд. Муқоисаи таҷрибавии pH-и рангкунӣ дар доираи санҷидашуда тағйироти назарраси ҳассосиятро ошкор кард, ки бо таҳқиқоти усули кабуди метилен вобаста ба pH мувофиқ аст. Зарраҳои бегона мушкили алоҳидаанд: зарраҳои ранггирифта дар омехтаҳои ифлоси ғалладона ба ҳуҷайраҳои мурда монанд мешаванд ва фарқияти натиҷаҳои операторҳоро зиёд мекунанд.

Ин тағйирпазирӣ на танҳо аз мушоҳидаҳои ҷудогона, балки бо рақамҳо нишон дода шудааст. Дар озмоиши шашмоҳаи пивопазӣ, ки дар муқоисаи хамиртуруши FEMS гузориш шудааст, ченкуниҳои такрорӣ бо кабуди метилен ба ҳисоби миёна инҳирофи стандартии 6.1% доштанд, дар муқоиса бо 0.2% барои ситометрияи ҷараёнӣ бо оксонол; натиҷаҳои ду оператор барои як намуна то 13 банди фоизӣ фарқ мекарданд. Муқоисаи миқдории усулҳои қобилияти ҳаётӣ дар соли 2023 нишон дод, ки микроскопияи флуоресцентӣ ва ситометрияи ҷараёнӣ хеле дақиқтаранд, вале самаранокии усул аз намуд ва матритсаи намуна вобаста аст. Тавсифи классикии усул аз ҷониби Painting ва Kirsop (PMID 24430080) ҳамчун манбаи асосии истинод боқӣ мемонад ва шарҳи васеътари озмоишҳои қобилияти ҳаётӣ ва фаъолияти физиологии хамиртуруш (PMID 25154541) кабуди метиленро дар қатори санҷишҳои иловагӣ, на санҷишҳои қатъӣ, ҷой медиҳад. Кабуди трипан дар ин ҷо худ аз худ беҳбудӣ нест: он аз даст рафтани якпорчагии мембранаро нишон медиҳад, дар ҳоле ки кабуди метилен ҷаббидашавии ранг ва фаъолияти барқароркуниро нишон медиҳад. Аз ин рӯ, ҳуҷайраҳои зери фишор бо ин ду ранг метавонанд гуногун тасниф шаванд.

Озмоиши нафаскашӣ: вақти нопадидшавии ранги кабудро чен кунед

Дар озмоиши дуюм умуман аз микроскоп истифода намешавад. Хамиртуруш, глюкоза ва кабуди метилени тунукшуда ба найчаи пӯшида гузошта мешаванд ва бо соат муайян мекунанд, ки ранги кабуд дар чанд вақт нопадид мешавад. Ҳангоми мубодилаи моддаҳо ҳуҷайраҳо эквивалентҳои барқароркунанда ҳосил мекунанд, ки ранги кабудро ба шакли берангаш табдил медиҳанд, дар ҳоле ки оксигени ҳалшуда онро боз оксид мекунад. Вақте ки ҳуҷайраҳо миқдори оксигенро кам мекунанд, барқароршавӣ бартарӣ мегирад ва маҳлули найча беранг мешавад. Аз ин рӯ, нуқтаи ниҳоӣ тавозуни нафаскашӣ, консентратсияи ранг ва дастрасии оксигенро инъикос мекунад. Онро бояд ҳамчун вақти барқароршавӣ ё берангшавии кабуди метилен гузориш дод, на ҳамчун суръати мустақими истеъмоли оксигени молекулавӣ.

Барои ба фосилаи қулай рост омадани вақт, нисбат ба озмоиши қобилияти ҳаётӣ ранги хеле тунукшуда истифода баред. Дастури машғулиятҳои амалии ҳатмии AQA A level инро хуб стандартизатсия мекунад: 1 g глюкоза ба ҳар 100 mL оби то тақрибан 30 C гармшуда, 5 g хамиртуруши хушк, ки бевосита пеш аз истифода илова мешавад, ва маҳлули кории ранг бо консентратсияи тақрибан 0.001%, ки бо тунук кардани 0.1 mL маҳлули захиравии 1% то 100 mL омода мегардад. 2 mL суспензияи хамиртурушу глюкозаро бо 2 mL маҳлули кории ранг омехта кунед, ҳарорати онро ба ҳарорати озмоиш расонед, як бор дар давоми 10 сония такон диҳед, вақтсанҷро оғоз кунед ва дигар такон надиҳед. Такон додан оксигенро дубора ворид карда, ранги кабудро бармегардонад; ин бузургтарин артефакти тартиби озмоиш аст. AQA қайд мекунад, ки омехта одатан бояд дар ҳарорати 35 C дар давоми тақрибан 5 дақиқа беранг шавад; вақтҳои миёнаи озмоишӣ 275 s дар 20 C, 128 s дар 35 C ва 145 s дар 45 C буданд. Инҳо мисолҳои як тартиби мушаххасанд, на меъёрҳои умумӣ. Робитаи миқдории байни суръати барқароршавӣ ва хамиртуруши аз ҷиҳати мубодилаи моддаҳо фаъол дар шароити назоратшаванда бо таҳқиқоти махсуси барқароршавӣ тасдиқ мешавад, аз ҷумла кори бо PMID 25773544 сабтшуда ва таҳқиқоти механизм дар маҷаллаи Yeast (2014).

Намоиши тағйирот бо мурури вақт (маводи аслӣ)

Ҷадвали зер намунаи аслии барои ҳамин мақола таҳияшуда аст, ки ба тартиби AQA-и дар боло тавсифшуда асос меёбад: 2 mL омехтаи хамиртурушу глюкоза ва 2 mL маҳлули кории ранг бо консентратсияи тақрибан 0.001%, як маротиба такон додан дар давоми 10 сония ва баъд инкубатсия бе ҳаракат. Сабтҳо хонишҳои намунавӣ дар шакле мебошанд, ки гурӯҳи донишҷӯён бояд истифода барад; индекси суръат ҳамчун 1 тақсим ба вақти берангшавӣ бо сония муайян шудааст. Озмоишро бо ҳамин найчаҳо гузаронед ва ин сабтҳоро бо қиматҳои ченшуда иваз кунед.

Барои найчаҳои A, B ва C индекси суръатро вобаста ба ҳарорат дар график тасвир кунед. Хати каҷ аввал боло меравад, сипас ҳамвор мешавад ё поён мефарояд; ин шакли интизоршавандаи раванди ферментӣ аст, на хати рост. Найчаҳои D, E ва F нуқтаҳои маълумоти ин хати каҷ нестанд. Онҳо намунаҳои назоратие мебошанд, ки тафсири хати каҷро имконпазир мекунанд.

Намунаҳои назоратие, ки ҳар озмоишро маънодор мекунанд

Ҳар озмоиши нафаскашӣ ба се намунаи ҳамроҳ ниёз дорад. Хамиртуруши ҷӯшонидашуда ё кушташуда бо глюкоза ва ранг бояд кабуд монад ва нишон диҳад, ки барқароршавии зуд аз мубодилаи моддаҳои зинда вобаста аст. Хамиртуруши зинда бо ранг, вале бе глюкозаи иловашуда, намунаи назоратии субстрат аст; бо вуҷуди ин, берангшавии сустро интизор шавед, зеро хамиртуруш захираҳои дохилиашро истифода мебарад. Глюкоза бо ранг, вале бе хамиртуруш, намунаи холии кимиёвӣ аст. Он муҳим мебошад, зеро глюкоза дар муҳити ишқорӣ метавонад кабуди метиленро бе ҳузури ягон ҳуҷайра барқарор кунад.

Ҳисоби қобилияти ҳаётӣ ба навъи дигари назорат ниёз дорад: доимии тартиби кор. Ҳамон маҳлули захиравии ранг, ҳамон таносуби омехта, ҳамон фосилаи рангкунӣ, ҳамон масоҳати камера, ҳамон қоидаҳои муғча ва марз; агар имкон бошад, ҳисоб бе огоҳӣ аз шахсияти намуна анҷом дода шавад. Вақте ки натиҷаҳои ду оператор даҳ банди фоизӣ фарқ мекунанд, варақаи ҳисоб одатан сабабро ошкор мекунад: вақти гуногун, ҳадди гуногуни кабудӣ ё қоидаҳои гуногуни муғча. Усулҳои омодасозӣ ва мушоҳидаи ҳуҷайраҳои ранггирифта бо усулҳои рангкунии одии бактерияҳо алоқаманданд, дар ҳоле ки шарҳи васеътари он чи ин ранг дар намунаҳои гуногун нишон медиҳад, дар атласи рангкунии микроскопӣ ҷой дорад. Барои асосҳои физикии арзёбии миқдории ҳар гуна шиддати ранги кабуд, маълумотномаи ҷаббиш бо нишондоди шароит мефаҳмонад, ки чаро ҳар коэффисиент бояд ҳамроҳи шароити ҳалкунанда, pH ва консентратсияи худ оварда шавад.

Озмоишро мувофиқи савол интихоб кунед. Ҳоло чанд ҳуҷайра зинда аст — ин саволи ҳисоб аст, ки бо микроскоп ва варақаи ҳисоб ҷавоб дода мешавад. Ин фарҳанг то чӣ андоза фаъол нафас мекашад — ин саволи кинетикӣ аст, ки бо сониясанҷ ва найчаҳои назоратшаванда ҷавоб дода мешавад. Кабуди метилен барои ҳар ду хизмат мекунад, вале ҳеҷ гоҳ дар як найча ва дар як вақт не.