Метилени кабуд барои рангкунии ДНК ва РНК: истифода дар гелҳо ва мембранаҳо

Донишҷӯ электрофорезро дар гели агароза анҷом медиҳад, онро бо метилени кабуд ранг мекунад ва дар ҷое, ки банди равшанро интизор буд, чизе намебинад. Дар ҷойи кории ҳамсоя муҳаққиқи баъдидокторӣ мембранаи Нозернро бо ҳамон шишаи ранги кабуд ранг мекунад ва дар се дақиқа бандҳои возеҳи рибосомавӣ мегирад. Донишҷӯ хулоса мекунад, ки таҷрибаи гел ноком шудааст. Аммо гел ноком нашудааст. Ин ду вазифа гуногун буданд ва як ранг ба онҳо бо ҳассосияти гуногун, заминаи гуногун ва қоидаҳои гуногуни марҳилаҳои минбаъда ҷавоб медиҳад.

Рангкунии ДНК ва РНК бо метилени кабуд аз ҷиҳати химиявӣ умумият доранд, аммо мақсадашон яксон нест. Дар гел ранг нишон медиҳад, ки дар дохили матритсаи ковок чӣ қадар кислотаи нуклеинӣ мавҷуд аст. Дар мембрана он нишон медиҳад, ки интиқол муваффақ буд ё не ва оё ба роҳчаҳо миқдори баробари намуна бор карда шудааст. Вақте ки ин фарқ равшан мешавад, протоколҳо, ҳудудҳои ошкорсозӣ ва маҳдудиятҳои мувофиқат низ фаҳмо мешаванд.

Ҷавоби кӯтоҳ

Метилени кабуд ранги катионии ҳамвор аст, ки ба кислотаҳои нуклеинӣ ғайриковалентӣ ва баргарданда пайваст мешавад. Ин пайвастшавӣ аз маҷмӯи ҷалби электростатикӣ ба фосфат, интеркалятсия байни ҷуфтҳои асосҳо ва пайвастшавӣ ба ҷӯяки хурд иборат аст. Маҳз ҳамин баргардандагӣ муҳим аст. Бандҳоро метавон ранг кард, зери нури намоён сабт намуд ва сипас барои клонсозӣ, гибридизатсия ё санҷиши такрорӣ бо зонд беранг ё тоза кард.

Барои рангкунии ДНК-и дузанҷира дар гели агароза бо метилени кабуд, таркиби стандартии зуд 0.02 фоиз w/v (200 микрограмм дар mL) дар об аст: тақрибан 15 дақиқа рангкунӣ ва тақрибан 15 дақиқа берангкунӣ бо об, бо мушоҳида дар рӯйи дастгоҳи равшанкунандаи нури сафед. Барои мембранаҳо, таркиби классикии Нозерн-блот аз 0.02 то 0.04 фоиз ранг дар атсетати натрий бо pH тақрибан 5.2 иборат аст: чанд дақиқа рангкунӣ пас аз интиқол ва беҳаракатсозӣ, сипас шустан бо об ва берангкунии пурра пеш аз гибридизатсия. Ҳассосият маҳдуд аст: дар шароити хуб аз даҳҳо то садҳо нанограмм барои ҳар банди гел; дастурҳои эҳтиёткорона 0.5 то 1 микрограммро нишон медиҳанд. Ин аз ҳадди ошкорсозии бромиди этидий ва рангҳои SYBR чандин тартиби бузургӣ баландтар аст. Барои мембранаҳо ҳадди ягонаи муфиди ошкорсозии транскрипти алоҳида вуҷуд надорад, зеро ранг асосан РНК-и фаровони рибосомавӣ ва тамоми маводи боршударо нишон медиҳад. Дар ҳеҷ яке аз ин таркибҳо маҳлули иловагии ғизоии фурӯши чаканаро ҳамчун ҷойгузин истифода набаред. Усулҳои санҷидашуда ранги дараҷаи таҳлилӣ, буферҳои таркибашон муайян ва ҳангоми кор бо РНК шароити бе RNase-ро пешбинӣ мекунанд.

Пайвастшавӣ чӣ гуна амал мекунад ва дар куҷо метавонад гумроҳ кунад

Модели муфид аз се қисм иборат аст. Аввал, системаи ҳалқавии мусбатзаряд ба скелети фосфатии манфизаряд ҷалб мешавад. Тадқиқоти спектроскопӣ нишон медиҳанд, ки ҳангоми кам будани намак ин саҳми электростатикӣ бартарӣ дорад, дар ҳоле ки моделсозӣ ва динамикаи молекулавӣ интеркалятсия ва пайвастшавӣ ба ҷӯяки хурдро ҳамчун шаклҳои устувори пайвастшавӣ ба ДНК-и дузанҷира нигоҳ медоранд; ин дар тадқиқоти спектроскопии пайвастшавии метилени кабуд ба ДНК ҷамъбаст шудааст. Дуюм, майли муайян ба GC вуҷуд дорад: моделсозӣ мавқеъҳои CpG ва GpC-ро афзал медонад ва таҷрибаҳо дар кори марбут ба афзалиятҳои интеркалятсияи метилени кабуд пайвастшавии афзалиятнокро ба дуплексҳои бой аз GC гузориш медиҳанд, аммо дуплексҳои AT низ пайваст мешаванд. Рангкунии маъмул ба пайдарпайии муайян хос нест. Сеюм, ДНК-и якзанҷира ва РНК асосан тавассути таъсири электростатикӣ ва рӯйи ҳам қарор гирифтани сохторҳо бо асосҳои дастрас ва минтақаҳои дуплексӣ пайваст мешаванд. Аз ин рӯ, шиддати рангкунӣ вобаста ба дарозӣ, пайдарпайӣ ва сохтори дуюмдараҷа тағйир меёбад.

Аз ин ду натиҷа бармеояд. Азбаски пайвастшавӣ ғайриковалентӣ аст, ранг ҳангоми шустан хориҷ мешавад. Бандҳои полиакриламид зуд камранг мешаванд, агар махсус мустаҳкам карда нашаванд. Маҳз аз сабаби муваққатӣ будани рангкунии маъмул варианти махсуси мустаҳкамкунии доимӣ вуҷуд дорад, ки онро Сото ва Дрейпер барои гелҳои PAGE тавсиф кардаанд. Азбаски ранг фотосенсибилизатор аст, равшанкунии тӯлонӣ ва пуршиддати ДНК-и рангшуда дар ҳузури оксиген метавонад гуанинро оксид кунад ва дар ниҳоят дар занҷирҳо буришҳо ба вуҷуд оварад. Ин механизм дар кори марбут ба оксидшавии гуанин бо ҳассоссозии метилени кабуд муфассал шарҳ дода шудааст. Мушоҳидаи кӯтоҳ зери нури сафед аз осеби маълуми UV дар равандҳои классикии кор бо бромиди этидий пешгирӣ мекунад ва ин барои ҷудокунии препаративӣ бартарии воқеӣ аст. Нури намоён мулоимтар аст, аммо безарар нест. Агар ДНК барои клонсозӣ истифода шавад, вақти равшанкуниро кӯтоҳ нигоҳ доред. Барои маълумоти васеътар дар бораи фотохимияи ин эҳтиёт, ба ду роҳи фотохимияи метилени кабуд нигаред. Барои ҷуфти оксидшавию барқароршавӣ ва ҳолатҳои заряд, ки шарҳ медиҳанд чаро шакли оксидшуда пайваст мешаваду шакли барқароршуда не, ба химияи сохтор ва хосиятҳои метилени кабуд нигаред.

Вазифаи якум: рангкунӣ дар дохили гелҳо

Рангкунии гел ба як савол ҷавоб медиҳад: оё дар ин банд кислотаи нуклеинӣ ба андозаи кофӣ ҳаст, то бо чашм дида шавад? ДНК-и дузанҷира дар агароза ҳолатест, ки беҳтар аз ҳама тавсиф шудааст. Усули аслии рангкунии гел бо метилени кабуд аз Флорес ва ҳамкорон протоколи зуди 0.02-фоизаро дар агарозаи 1-фоиза санҷида, ҷудокунӣ ва клонсозии муваффақро баъд аз он нишон дод. Ҳамин протоколи таъминкунанда дар саҳифаи маҳсулоти метилени кабуди IBI Scientific оварда шудааст, ки таркиби 0.04-фоиза барои мембрана ва варианти зуд барои гелро паҳлуи ҳам нишон медиҳад.

Раванди амалии кор:

1. Электрофорези гелро ба таври маъмул анҷом диҳед. Пас аз электрофорез ранг кунед, на дар ҷараёни он, магар ин ки интиқол ё қобилияти ҷудосозӣ барои усули тағйирдодашуда санҷида шуда бошад.
2. Гелро тақрибан 15 дақиқа ба маҳлули 0.02 фоиз w/v метилени кабуд дар оби муқаттар ғӯтонед ва оҳиста ҷунбонед.
3. Бо чанд маротиба иваз кардани об, дар маҷмӯъ тақрибан 15 дақиқа беранг кунед, то заминаи матритса камранг шуда, бандҳо равшан намоён шаванд.
4. Дар дастгоҳи равшанкунандаи нури сафед фавран акс гиред.

Агароза ва полиакриламид рафтори гуногун доранд. Агароза рангро дар матритса нигоҳ медорад, бинобар ин берангкунӣ марҳилаи суст аст. Гелҳои тунуки полиакриламид зуд ранг мегиранд, аммо рангро низ зуд аз даст медиҳанд. Ин ба бурида гирифтани препаративӣ кумак мекунад, вале барои сабтҳои бойгонӣ номусоид аст. Ҷойи олигонуклеотидҳои синтетикиро дар полиакриламид бо ҳамон таркиби 0.02-фоиза дар 20 то 30 дақиқа, бо шустани такрорӣ бо об, мувофиқи усулҳои муқарраршудаи PAGE аз навъи Current Protocols муайян кардан мумкин аст. Барои олигонуклеотидҳои препаративӣ вариантҳои хеле тунукшудаи тақрибан 0.0002 фоиз дар TBE-и тунукшуда бо давомнокии чанд соат гузориш шудаанд, аммо заминаи далелии онҳо заифтар аст.

Фарқи ДНК ва РНК муҳим аст. ДНК-и дузанҷира қавитарин пайвастшавии сохториро медиҳад. РНК ва ДНК-и якзанҷира ранг мегиранд, аммо заифтар ва камтар пешгӯишаванда. Барои гелҳои агарозаи формалдегидии РНК, аксари озмоишгоҳҳо аз рангкунии кабуд дар дохили гел даст мекашанд ва аввал РНК-ро ба мембрана интиқол дода, сипас дар он ҷо ранг мекунанд. Ин амал сигнали заифи гелро ба сигнали возеҳтари мембрана ва сабти боркунии намунаҳо иваз мекунад.

Вазифаи дуюм: рангкунӣ дар рӯйи мембранаҳо

Рангкунии мембрана ба саволи дигар ҷавоб медиҳад: оё интиқол муваффақ буд ва оё роҳчаҳо қобили муқоисаанд? Истифодаи классикӣ рангкунии баргардандаи Нозерн-блот аз Ҳеррин ва Шмидт аст. Дар таркиби аслӣ 0.04 фоиз ранг дар 50 mM атсетати натрий бо pH 5.0 барои 2 то 3 дақиқа истифода мешуд, сипас мембрана бо об шуста мешуд; пеш аз гибридизатсия рангро бо SDS-и тунукшуда дар SSPE хориҷ кардан мумкин буд.

Варианти муосири маъмул чунин иҷро мешавад:

1. РНК ё ДНК-и денатуратсияшударо ба нейлон ё нитроселлюлоза интиқол диҳед, сипас бо пайвасткунии кӯндаланг тавассути UV ё гармкунӣ беҳаракат созед, то намуна ҳангоми рангкунӣ аз даст наравад.
2. Ихтиёрӣ, вале маъмул: мембранаро тақрибан 15 дақиқа дар кислотаи атсетатии 5-фоиза тар кунед.
3. 5 то 10 дақиқа дар маҳлули аз 0.02 то 0.04 фоиз метилени кабуд дар 0.3 то 0.5 M атсетати натрий бо pH тақрибан 5.2 ранг кунед.
4. Бо об шӯед ва 5 то 15 дақиқа беранг кунед, натиҷаро сабт намоед, сипас пеш аз гибридизатсия ранги боқимондаро хориҷ кунед.

Дар кори Нозерн асосан нейлони мусбатзаряд истифода мешавад. Нитроселлюлоза низ бо ҳамин раванди истифодаи кислотаи атсетатӣ ва атсетат мувофиқ аст. Тасвир барои тасдиқи интиқол, муқоисаи бандҳои 28S ва 18S (ё 23S ва 16S барои РНК-и бактериявӣ), ишора кардани нардбонҳо ва стандартҳо ва нигоҳ доштани сабти тахминии нормализатсия аз рӯйи РНК-и умумӣ истифода мешавад. Усулҳои нашршудаи Нозерн барои санҷиши боркунии намуна бандҳои рангшудаи рибосомавиро миқдоран арзёбӣ мекунанд, аз ҷумла таҳқиқоти илми маҳсулоти ширӣ, ки бандҳои рибосомавии бо метилени кабуд рангшударо барои нормализатсия истифода бурдааст. Мембранаҳои Саузернро низ ҳамин тавр намоён кардан мумкин аст, аммо истифодаи ранг ҳамчун санҷиши боркунӣ ва интиқоли Нозерн хеле бештар собит шудааст. ДНК барои Саузерн пеш аз интиқол денатуратсия мешавад, бинобар ин нишондиҳандаҳои ҳассосияти гел ба он татбиқ намешаванд.

Ҳудудҳои ошкорсозӣ ва замина: дар куҷо ранги кабуд ақиб мемонад

Муқоисаи зер қасдан тахминӣ аст. Натиҷаи рангкунӣ ба фоизи гел, паҳнои банд, оптика ва риояи тартиби берангкунӣ вобаста аст. Ҳар рақамро ҳамчун тартиби бузургӣ қабул кунед, на ҳамчун мушаххасоти кафолатнок.

Назорати замина муайян мекунад, ки сигнали маҳдуд қобили истифода аст ё не. Ранги озод ранги хеле пуршиддат дорад, бинобар ин контраст аз хориҷ кардани ранги пайвастнашуда бе канда гирифтани ранги пайвастшуда ҳосил мешавад. Маҳлули ғализтари ранг кам ҳассосиятро зиёд мекунад. Он асосан вақти берангкуниро дароз мекунад. Як силсилаи тунуккуниро бо ҳамон гел, мембрана ва камера санҷед ва танҳо диапазонеро истифода баред, ки дар он зичии интегралӣ ба миқдори воридшуда мутаносиб мемонад. Метилени кабуд барои нормализатсияи ниммиқдории боркунии намуна мувофиқ аст. Он санҷиши миқдорӣ бо диапазони васеи динамикӣ нест, зеро ғунҷоиши мембрана, самаранокии интиқол, сершавӣ ва берангкунӣ аз як роҳча ба роҳчаи дигар фарқ мекунанд.

Маҳдудиятҳои мувофиқат: пас аз рангкунӣ чӣ қобили истифода мемонад

Клонсозӣ пас аз рангкунии кабуд нишон дода шудааст. Флорес ва ҳамкорон бандҳои рангшудаи агарозаро бурида гирифтанд, ДНК-ро ҷудо карданд, онро лигатсия намуданд ва трансформатсия гузарониданд. Онҳо нисбат ба истифодаи бромиди этидий бо UV натиҷаи беҳтари клонсозиро гузориш доданд. Сабаби эҳтимолӣ осеби камтари рӯшноӣ аст, на фоидаи худи ранг. Таъсири нури сафедро кӯтоҳ нигоҳ доред ва ДНК-и ҷудошударо бо усули маъмулӣ барои тозакунии ДНК аз гел тоза кунед.

Барои PCR ва муайян кардани пайдарпайӣ далелҳо камтаранд. Ранги боқимонда ба кислотаҳои нуклеинӣ пайваст мешавад, бинобар ин пеш аз марҳилаҳои ферментӣ беранг ва тоза кунед. Интизор меравад, ки ДНК-и дуруст тозашуда аз гели кабуд кор кунад, аммо таҳаммулпазирӣ ба воридшавии мустақими боқимондаи ранг барои полимеразаҳо ва химияҳои гуногуни муайян кардани пайдарпайӣ ба таври кофӣ миқдоран арзёбӣ нашудааст. Инро худ аз худ қабул накунед.

Гибридизатсияи блот ҳангоми риояи қатъии тартиб мувофиқ аст: интиқол, беҳаракатсозӣ, рангкунӣ, сабт, берангкунӣ, гибридизатсия. Ин тартиби Ҳеррин ва Шмидт аст. Рангкунӣ пеш аз интиқол ё гузаронидани гибридизатсия бе берангкунӣ усули дигар мебошад ва санҷиши алоҳидаи худро талаб мекунад. Пас аз хориҷ кардани ранг, хориҷсозии стандартии зонд ва санҷиши такрорӣ бо зонд ба таври маъмул идома меёбанд. Барои рангкунӣ дар сатҳи ҳуҷайра бо ҳамин оилаи рангҳо ва шарҳи он ки чаро мантиқи мазокҳои мустаҳкамшуда ба усулҳои ҳуҷайраҳои зинда татбиқ намешавад, ба атласи рангкунии микроскопӣ нигаред.

Бурида гирифтани бандҳо барои агарозаи препаративӣ ва олигонуклеотидҳои PAGE, ки ҷойи онҳо бо ранги кабуд муайян шудааст, мувофиқ аст, ба шарте ки варианти мустаҳкамкунии доимӣ истифода нашавад. Электроэлюсия пас аз берангкунӣ барои моддаи баргарданда пайвастшаванда аз ҷиҳати химиявӣ қобили қабул аст, аммо маълумоти назоратшудаи баромад, ки махсус ба метилени кабуд дахл доранд, каманд. Пас аз элюсия намакҳоро хориҷ кунед ё намунаҳоро таҳшин намоед.

Нокомиҳое, ки такрор мешаванд

Бандҳои камранги гел одатан маънои онро доранд, ки масса барои рангкунии колориметрӣ хеле кам аст, махсусан барои ҳадафҳои кӯтоҳи якзанҷира ё РНК. Намунаи бештар бор кунед, ранги нав истифода баред, пеш аз баланд кардани консентратсия вақти рангкуниро дароз кунед ва берангкуниро барвақттар қатъ намоед. Гели яклухт кабуд бе контраст одатан аз рангкунии аз ҳад зиёд ё кам иваз кардани об шаҳодат медиҳад. Камранг шудани бандҳои PAGE химияи интизоршаванда аст, на нокомии рангкунӣ. Зуд акс гиред. Заминаи нобаробари мембрана ба қатҳо, ҳубобҳо, изи ангушт, ҷунбиши нобаробар ё интиқоли доғ-доғ ишора мекунад. Бе назорати гибридизатсия инро ҳамчун боркунии нобаробар тафсир накунед. Намунаи заифу паҳншудаи бандҳои рибосомавӣ метавонад аз таҷзия бошад, аммо интиқоли нопурра, кам будани РНК-и умумӣ (роҳчаҳои маъмулӣ аз чанд то даҳҳо микрограмм доранд) ё берангкунии аз ҳад зиёд низ сабаб шуда метавонанд. Ранг РНК-и фаровони рибосомавиро нишон медиҳад. Он транскрипти мушаххасро нишон намедиҳад. Ин вазифаи зонд аст.

Бехатарӣ ва корбарӣ бе иддаоҳои муболиғаомез

Кор бо метилени кабуд нисбат ба бромиди этидий содатар аст, аммо он безарар нест. Варақаи амалкунандаи маълумоти бехатарии MilliporeSigma рангро ба гурӯҳи заҳролудии шадид ҳангоми фурӯбарӣ, Категорияи 4, дохил мекунад: ҳангоми фурӯбарӣ зараровар аст ва бояд тибқи SDS-и метилени кабуди Sigma-Aldrich тавассути роҳи тасдиқшудаи партовҳо нобуд карда шавад. Бромиди этидий огоҳиҳои ҷиддитар дар бораи генотоксикӣ дорад, аз ҷумла таъсири гумонбар ба ҳуҷайраҳои ҷинсӣ дар SDS-и бромиди этидии Sigma-Aldrich. Гелҳо ва маҳлулҳои он одатан ҳамчун партовҳои химиявии хатарнок алоҳида ҷамъоварӣ мешаванд, чунон ки дар дастури Thermo Fisher оид ба рангҳои кислотаҳои нуклеинӣ қайд шудааст. Барои ҳар ду SDS ва қоидаҳои муассисаро риоя кунед. Ранги хушкро дар зарфи маҳкам ва дар ҳолати хушк нигоҳ доред, маҳлули кории рангро танҳо дар ҳадде такроран истифода баред, ки протокол иҷозат медиҳад, мембранаҳои рангшударо хушк байни варақҳои коғази филтр нигоҳ доред ва гелҳоро пеш аз он ки бандҳо аз сабаби диффузия паҳн шаванд, акс гиред.

Қоидаи кӯтоҳи мизи озмоиширо дар хотир доред. Гелҳо намоён буданро ҳангоми боркунии зиёди намуна зери нури сафед месанҷанд. Мембранаҳо интиқол ва боркуниро пеш аз он месанҷанд, ки зонд кори ҳассосро анҷом диҳад. Як ранг ҳар ду вазифаро бо ҳассосияти маҳдуд, пайвастшавии баргарданда ва тартиби қатъии амалиёт иҷро мекунад.