Сохтани каҷхатти калибровкаи кабуди метиленӣ: намунаҳои холӣ, диапазон ва хаттият

Ду таҳлилгар аз як шишаи маҳлули захиравии кабуди метиленӣ истифода мебаранд ва ҳар кадом каҷхатти калибровка месозад. Аввалӣ хати ростеро ба даст меорад, ки аз нуқтаи ибтидои координатҳо мегузарад, ва намунаҳои консентратсияашон номаълумро бо боварӣ чен мекунад. Дуюмӣ хатеро ба даст меорад, ки дар қисми боло хам мешавад, буриши он бо меҳвари амудӣ ба сифр наздик нест ва натиҷаҳои намунаҳо бо рақиқсозӣ тағйир меёбанд. Ҳамон ранг, ҳамон асбоб, ҳамон дарозии мавҷ. Фарқият дар маҳорат нест. Он дар тарҳрезист: ба намунаи холӣ чӣ дохил карда шуд, кадом консентратсияҳо интихоб шуданд ва оё диапазони санҷидашуда дар ҳудуде монд, ки дар он як модели сода ҳанӯз дуруст аст.

Каҷхатти калибровка робитаи шартӣ байни посухи асбоб ва консентратсия аст, ки танҳо дар шароити сохта шудани он эътибор дорад. Барои кабуди метиленӣ ин робита нуқтаи заифи маълум дорад. Ранг дар об худ ба худ ассотсиатсия мешавад, бинобар ин навъи зарраҳои фурӯбаранда бо консентратсия тағйир меёбад. Каҷхатте, ки ин тағйиротро фаро мегирад, рост нахоҳад буд ва ҳеҷ гуна коркарди оморӣ онро ислоҳ намекунад. Ин мақола нишон медиҳад, ки каҷхаттро чӣ гуна тарҳрезӣ кардан лозим аст, то хат маъно дошта бошад: намунаи холии дурустро интихоб кунед, диапазонро дар ҳудуди мономерӣ нигоҳ доред, такрорҳоро дуруст иҷро кунед ва хамшавиро на ҳамчун садо, балки ҳамчун маълумот тафсир намоед.

Аз намунаи холӣ оғоз кунед, на аз стандартҳо

Намунаи холӣ сифрро муайян мекунад ва барои кабуди метиленӣ он бояд ҳама чизро ғайр аз ранг дар бар гирад. Ҳамон дараҷаи сифати об, ҳамон буфер ва pH, ҳамон намакҳо, ҳамон ҳиссаи ҳамҳалкунанда ва ҳамон ҳарорат. Маҳлулҳои калибровкаро дар ҳамин матритсаи якхела омода кунед. Сабаб кимиёвӣ аст, на расмиятпарастӣ. Намак ва ҳалкунанда мувозинати байни мономер, димер ва агрегатҳои дараҷаи баландтарро тағйир медиҳанд, ки ин спектрро дар дарозии мавҷи ченкунӣ дигар мекунад. Намунаи холие, ки танҳо аз об иборат аст, тағйироти таркиби намудҳои кимиёвиро, ки матритса ба вуҷуд овардааст, ҷуброн карда наметавонад. Дар таҳлили глобалии спектрҳои кабуди метиленӣ дар об, ки тавассути сабти дастрасии озоди он дастрас аст, консентратсияи хлориди натрий аз 0 то 0.15 M маҳз барои он тағйир дода шуд, ки қувваи ионӣ мувозинатро мекӯчонад ва агрегатсия бо зиёд шудани намак меафзояд.

Як натиҷаи амалӣ: ҳеҷ гоҳ калибровкаро дар оби деионизатсияшуда иҷро карда, баъд намунаҳоро дар буфери фосфатӣ ё филтрати оби партов чен накунед. Агар матритсаи бе таҳлилшаванда мавҷуд набошад, иловаи стандарт ба худи намуна аз каҷхатти берунии номувофиқ беҳтар аст. Тавсияҳои марбут ба таъмини дурустии таҳлилҳои обӣ дар муҳокимаи матритса ва халалрасониҳо оварда шудаанд; принсипҳои умумии таҳлили миқдории рангҳо дар шарҳи тарҳрезии таҳлил баррасӣ мешаванд.

Диапазонеро интихоб кунед, ки дар он як навъи зарра бартарӣ дорад

Муайянкунии миқдорӣ дар банди дарозмавҷ наздики 664 nm бар ин фарзия асос меёбад, ки қисми зиёди ранг дар шакли мономер аст. Дар оби одӣ ин фарзия танҳо ҳангоми рақиқ мондани маҳлулҳо, тақрибан дар ҳудуди консентратсияҳои пасти микромолярӣ, дуруст аст. Нишебиҳои таҷрибавии нашршуда ин ҳудудро нишон медиҳанд: калибровкаҳое, ки дар кюветаҳои 1 cm поёнтар аз тақрибан 7 микромоляр нигоҳ дошта мешаванд, нишебии наздик ба 82,000 M-1 cm-1 медиҳанд, дар ҳоле ки калибровкаи то тақрибан 37 микромоляр васеъшуда ба тақрибан 67,100 мефарояд, зеро стандартҳои болоӣ аллакай миқдори назарраси димер доранд. Ҳар коэффитсиенти дар ин ҷо овардашуда дар маълумотномаи спектрии кабуди метиленӣ бо шароити дахлдор нишон дода шудааст; барои муқоисаи рақамҳо он манбаи дуруст аст. Ин мақола онҳоро танҳо барои муайян кардани диапазон истифода мебарад.

Қоидаҳои тарҳрезӣ бевосита аз ин бармеоянд:

1. Стандарти баландтаринро ба қадри кофӣ рақиқ нигоҳ доред, то шакли спектр устувор бошад. Ҳангоми таҳияи усул, барои ҳар сатҳ ба ҷойи хондани як дарозии мавҷ тамоми диапазони намоёнро скан кунед — тақрибан аз 550 то 750 nm. Агар спектрҳои нормализатсияшуда бо консентратсия шаклашонро дигар кунанд, таркиби кимиёвӣ тағйир меёбад ва диапазон аз ҳад васеъ аст.
2. Дар ҳамаи сатҳҳо нисбати абсорбанс наздики 610 nm ба абсорбанс наздики 665 nm-ро пайгирӣ кунед. Нисбате, ки бо консентратсия меафзояд, маънои онро дорад, ки китфи димерӣ калон шуда истодааст ва модели мономерӣ дигар мувофиқ нест. Ин нишонаи ташхисӣ дар дастур оид ба агрегатсия ва таъсири консентратсия муфассалтар шарҳ дода шудааст.
3. Барои кор дар консентратсияҳои пасти микромолярӣ кюветаи 1 cm-ро истифода баред. Бо нишебии наздик ба 82,000, консентратсияи 5 микромоляр абсорбанси наздик ба 0.41 ва 10 микромоляр тақрибан 0.82 медиҳад; ҳар ду барои аксари асбобҳо муносибанд.
4. Барои маҳлулҳои захиравии консентратсияашон баланд, ба ҷойи қабул кардани абсорбанси хеле бештар аз 1, роҳи оптикиро кӯтоҳ кунед. Аммо дар хотир доред: роҳи кӯтоҳ фотометрияро ислоҳ мекунад, на таркиби кимиёвиро. Агрегатсия аз консентратсия вобаста аст, на аз дарозии роҳи оптикӣ, бинобар ин маҳлули захиравии консентратсияаш баланд ҳанӯз ҳам ба муносибати алоҳида бо назардошти таркиби намудҳои кимиёвӣ ниёз дорад, на ба каҷхатти мономерии маҳлули рақиқ.

Мутобиқсозии глобалие, ки асоси қисми зиёди ин тасвир аст, 224 спектрро аз 1.1 микромоляр то 3.4 миллимоляр фаро гирифт ва нишон дод, ки сигнали тетрамер аллакай поёнтар аз 34 микромоляр ошкор мешавад. Ин натиҷа эҳтиёткориро тақозо мекунад: равзанаи хаттӣ аз он чи аз рӯйи эҳсоси аввал интизор мешавад, тангтар аст. Пас онро санҷед, на ин ки дуруст буданашро пешакӣ фарз кунед.

Сатҳҳо, такрорҳо ва тартиб

Каҷхатти дорои се нуқта чизеро исбот намекунад. Дастури валидатсияи ICH Q2(R2) барои арзёбии хаттият ҳадди ақал панҷ консентратсияро талаб мекунад; шаш то ҳашт сатҳи ғайрисифрӣ каҷхатти кории боварибахштар медиҳанд, махсусан дар наздикии қисми боло, ки агрегатсия оғоз мешавад. Сатҳҳоро тавре ҷойгир кунед, ки диапазони пешбинишудаи намунаҳоро фаро гиранд ва дар ҷойҳои эҳтимоли бештари хамшавӣ зичтар бошанд, на ҳамчун қатори геометрие, ки танҳо барои осонӣ интихоб шудааст.

Ҳар сатҳро ду ё се маротиба чен кунед ва маҳлулҳоро мустақилона омода намоед, на ин ки аз як колба се бор хониш гиред. Такрорҳои мустақил хатои омодасозиро ошкор мекунанд; хонишҳои такрорӣ аз як колба танҳо садои асбобро нишон медиҳанд. Таҳқиқоти глобалии соли 2020 ҳар маҳлулро се маротиба чен кард ва ин ҳанӯз интихоби пешфарзи муносиб аст. Тартиби хонишро тасодуфӣ кунед, то дрейф, адсорбсия ба шиша ё тағйири ҳарорат ҳамчун хамшавӣ зоҳир нашавад. Таҳқиқоти кюветаи кварсӣ нишон дод, ки дар давоми 10 дақиқа тақрибан 3 фоизи ранг аз маҳлули 34 микромоляр адсорбсия мешавад. Аз ин рӯ, вақти тамос, кювета, тозакунӣ ва пайдарҳамиро дар тамоми силсилаи ченкуниҳо яксон нигоҳ доред.

Намунаи ҳисобӣ барои шарҳ (на маълумоти ченшуда)

Рақамҳои зер барои нишон додани ҳисобҳо сохта шудаанд. Онҳо ченкуниҳои лабораторӣ нестанд ва набояд ҳамчун маълумоти кабуди метиленӣ иқтибос шаванд. Муҳим тартиби санҷишҳое аст, ки атрофи онҳо анҷом дода мешавад.

Фарз мекунем, ки шаш стандарт дар буфери мувофиқ, бо роҳи оптикии 1 cm, дар 665 nm нисбат ба намунаи холии мувофиқ чен шудаанд:

Мутобиқсозии хати рост барои абсорбанси миёна нисбат ба консентратсия нишебии наздик ба 0.0805 воҳиди абсорбанс ба ҳар микромоляр медиҳад; буриши хат бо меҳвари амудӣ аз сифр танҳо чанд милливоҳиди абсорбанс дур аст. Тақсим кардани нишебӣ ба дарозии роҳи оптикӣ онро ба коэффитсиенти зоҳирии фурӯбарӣ табдил медиҳад: 0.0805 ба ҳар микромоляр тақрибан ба 80,500 M-1 cm-1 баробар аст, ки бо фосилаи мономербартар дар об мувофиқ мебошад. Санҷишҳои муҳим R-квадрат нестанд, ки дар ҳар сурат аъло ба назар мерасад. Муҳим буриши наздик ба сифр, нисбати устувори A610/A665 аз S2 то S5 ва боқимондаҳои бе тамоюл парокандашуда мебошанд. Афзоиши нисбат дар S6 сигнали равшанест, ки ё ин сатҳро хориҷ кардан лозим аст, ё 7 микромолярро ҳамчун ҳадди болоии муваққатӣ барои ин таркиби матритса ва асбоб қайд кардан даркор.

Намунаи номаълуме, ки дар шароити якхела хониши 0.245 медиҳад, бевосита ҳисоб мешавад: тақсими 0.245 ба 0.0805 ба ҳар микромоляр тақрибан 3.0 микромоляр медиҳад, пеш аз татбиқи ҳар гуна коэффитсиенти рақиқсозии намуна. Натиҷаро бо шароиташ гузориш диҳед: дарозии мавҷ, роҳи оптикӣ, матритсаи намунаи холӣ, фосилаи калибровка ва сана.

Варақаи пуршавандаи калибровка

Барои ҳар матритсаи нав ин қолабро ба дафтари лабораторӣ нусха кунед. Як матритса, як варақ, як каҷхатт.

Сатри шакли реагент беҳуда нест. Кабуди метилении тиҷоратӣ метавонад намаки беоб ё гидрате монанди тригидрат бошад ва массаи молярии нодуруст ҳамаи консентратсияҳои номиналиро бе ягон аломати ошкоро ғалат мекунад. Санҷишҳои тозагӣ ва мушаххасоти маводи ибтидоӣ дар дастури сифат ва дараҷа баррасӣ шудаанд.

Бо стандарти санҷишии мустақил тасдиқ кунед

Каҷхатти калибровка набояд худашро баҳогузорӣ кунад. Пас аз мутобиқсозӣ, як стандарти санҷиширо аз маҳлули захиравие омода кунед, ки барои он мавод алоҳида баркашида шудааст; консентратсияро наздики миёнаи фосилаи қабулшуда интихоб кунед ва онро ҳамчун намунаи номаълум чен намоед. Мувофиқат дар ҳудуди чанд фоиз занҷири омодасозиро тасдиқ мекунад; номувофиқатӣ бештар ба маҳлули захиравӣ ё рақиқсозиҳо ишора мекунад, на ба асбоб. Стандарти санҷиширо бо ҳар партияи намунаҳо такрор кунед. Агар натиҷаи он тағйир ёбад, вале каҷхатт бетағйир монад, пеш аз гумонбар кардани намунаҳо маҳлулҳои корӣ ё кюветаро санҷед. Ин одати ягона аксари хатоҳои пинҳониро ошкор мекунад: истифодаи массаи молярии гидрат барои шишаи маводи беоб, микропипеткаи аз калибровка баромада ё буфери бо қувваи ионии нодуруст омодашуда. Фоизи барқарорёбии стандарти санҷиширо дар варақа назди нишебӣ сабт кунед, то хонандаи баъдӣ бинад, ки хат санҷида шудааст, на танҳо кашида.

Тафсири ғайрихаттият ҳамчун воситаи ташхис

Ҳангоми хам шудани каҷхатт, шакли инҳироф сабабро муайян мекунад. Хамшавӣ ба поён дар абсорбанси баланд, бо шакли бетағйири спектр, ба асбоб ишора мекунад: аксаран нури пароканда қиматҳои баланди абсорбансро ба таври ғалат паст нишон медиҳад. Хамшавие, ки бо афзоиши китф дар 610 nm ҳамроҳ аст, ба таркиби кимиёвӣ ишора мекунад: димер ва агрегатҳои дараҷаи баландтар нисбат ба мономер ба тарзи дигар нурро фурӯ мебаранд. Намунаи холие, ки ба сифр намерасад, ё стандартҳое, ки хонишашон бо вақт паст мешавад, ба зарф ишора мекунанд: адсорбсия ба шиша ё кюветаҳо, махсусан агар вақти тамос дар давоми силсила фарқ карда бошад. Хати дурусти аз нуқтаҳо гузарандае, ки ҳанӯз натиҷаҳои нодурусти намунаҳоро медиҳад, ба матритса ишора мекунад: намунаҳо аз маҳлулҳои калибровка фарқ доранд. Пас каҷхаттро дар матритсаи намуна аз нав созед ё ба усули иловаи стандарт гузаред. Дар ҳар ҳолат боқимондаҳоро нисбат ба консентратсия дар график нишон диҳед. Парокандагии тасодуфӣ модели хати ростро дастгирӣ мекунад; шакли табассум ё абрӯчин онро нисбат ба ҳар ҳадди R-квадрат боэътимодтар рад мекунад — нуктае, ки дастури валидатсия ошкоро тасдиқ мекунад.

Кабуди метиленӣ ба ин интизом натиҷаи хуб медиҳад. Банди мономерии он қавӣ аст, хусусиятҳои кимиёвиаш хуб омӯхта шудаанд ва нишонаҳои номувофиқӣ пеш аз вайрон кардани рақамҳо дар спектр зоҳир мешаванд. Каҷхаттро дар диапазони танг созед, намунаи холиро дуруст истифода баред, такрорҳоро мустақилона омода кунед ва бигзор шакли спектрҳо диапазонро муайян кунад. Хати ҳосилшуда кӯтоҳ аст, аммо ҳар нуқтаи он дуруст мебошад.

Ҳисобҳои намунавии ин мақола барои нишон додани усул аз рақамҳои сохта истифода мебаранд. Коэффитсиентҳои истинодии ченшуда бо шароити пурра дар маълумотномаи спектрии пайвандшуда оварда шудаанд ва таҳқиқоти асосии агрегатсия таҳти PMID 33251415 индексатсия шудааст.