Андозагирии таъсири кабуди метилен ба митохондрияҳо: оксиген, ATP ва потенсиали мембрана

Фарз кунед, ки озмоишгоҳ ба митохондрияҳои нафаскашиашон халалдор кабуди метилен илова мекунад ва афзоиши истеъмоли оксигенро мушоҳида менамояд. Табиист, ки мехоҳад нависад: рангкунанда фаъолияти митохондрияҳоро барқарор кард. Аммо ин ҷумла метавонад нодуруст бошад. Ҷараёни оксиген, синтези ATP ва потенсиали мембрана се мафҳуми ҷудогонаанд. Онҳо ба як органелла тааллуқ доранд, ҳамон тавре ки нусхабардории эҳтиётӣ, ҳамоҳангсозӣ ва дастрасии муштарак ба як ҷузвдони абрӣ тааллуқ доранд: ба ҳам вобастаанд, вале қоидаҳои гуногун доранд. Агар яке бо дигаре омехта шавад, тафсир нодуруст мешавад, ҳатто вақте ки ҳар як андозагирӣ аз ҷиҳати техникӣ дуруст аст.

Кабуди метилен эҳтимоли чунин иштибоҳро зиёд мекунад, зеро худ дар низоме иштирок мекунад, ки онро чен мекунад. Он дар даврзании оксиду барқароршавӣ иштирок намуда, дар қисми болоии роҳ электронҳоро қабул мекунад ва дар қисми поёнии он медиҳад; катиони липофилист, ки дар митохондрияҳои дорои энергияи мембранавӣ ҷамъ мешавад; инчунин пайвастагии кабуди пуррангест, ки нурро дар ҳамон диапазонҳои зондҳои маъмул фурӯ мебарад ва мебарорад. Як нишондиҳанда наметавонад ҳамаи инро фаро гирад. Усули боэътимоде, ки дар таҳқиқоти митохондриявии Будапешт нишон дода шудааст, ин чен кардани ҷараёни оксиген, суръати синтези ATP, потенсиали мембрана ва хориҷшавии пероксиди гидроген якҷоя бо назоратҳои хоси рангкунанда дар ҳар қадам мебошад.

Респирометрия ҷараёни оксигенро чен мекунад, на ҳосили энергияро

Респирометрияи дорои қобилияти баланди тафриқа, хоҳ бо Oroboros Oxygraph бошад, хоҳ бо таҳлилгари ҷараёни берунҳуҷайравии Seahorse, танҳо як чизро нишон медиҳад: оксиген бо кадом суръат барқарор мешавад. Он нишон намедиҳад, ки ба ҳар электрон чанд протон интиқол дода шудааст, чӣ қадар градиент нигоҳ дошта шудааст ё оё ATP-синтаза аз он истифода кардааст.

Истилоҳот муҳиманд. Дар митохондрияҳои ҷудокардашуда субстрат бе ADP нафаскашии вобаста ба ихроҷи протонҳоро медиҳад, субстрат бо ADP дар сатҳи серкунанда иқтидори фосфорилонии оксидшавиро медиҳад ва титркунии ҷудокунандаи пайвастшавии энергетикӣ иқтидори ҳадди аксари интиқоли электронҳоро медиҳад. Дар ҳуҷайраҳои солим нишондиҳандаҳои ҳамарзиши Seahorse инҳоянд: нафаскашии базалӣ, нафаскашии ба ATP вобаста ва ба олигомитсин ҳассос, ихроҷи протонҳо, нафаскашии ҳадди аксаре, ки бо FCCP муайян мешавад, ва истеъмоли ғайримитохондриявии оксиген, ки ба ротенон ва антимитсин тобовар аст. Номидани натиҷаҳои Seahorse ҳамчун State 3 ва State 4 ба онҳо дақиқие нисбат медиҳад, ки чунин препарати таҷрибавӣ онро таъмин намекунад, чунон ки чаҳорчӯбаи Agilent Mito Stress Test равшан мекунад.

Кабуди метилен робитаи зоҳиран фаҳмои байни оксигени бештар ва энергияи бештарро мешиканад. Мувофиқи таҳқиқоти митохондрияҳои ҷудокардашудаи мағзи сар, дар митохондрияҳои ҷудокардашудаи мағзи сари хукчаи баҳрӣ рангкунанда дар консентратсияи аз 100 nM то 1 uM истеъмоли оксигенро дар ҳолати оромӣ бо субстратҳои глутамат ва малат, сукцинат ва алфа-глитсерофосфат зиёд кард. Афзоиш бо алфа-глитсерофосфат тақрибан 64 фоиз буд, вале нафаскашии бо ADP ангезонидашуда дар митохондрияҳои солим амалан бетағйир монд. Азбаски нафаскашии вобаста ба ихроҷи протонҳо зиёд шуд, вале ҷараёни бо ADP ангезонидашуда бетағйир монд, таносуби ҳисобшудаи назорати нафаскашӣ кам мешавад. Ин коҳиш маънои онро надорад, ки рангкунанда митохондрияҳоро осеб додааст. Ин маънои онро дорад, ки рангкунанда ба нафаскашии муқаррарӣ як давраи оксиду барқароршавии истеъмолкунандаи оксигенро илова кардааст. Таҳлили истеъмоли оксиген бо кабуди метилен, ки танҳо афзоишро гузориш медиҳад, раванди воқеии химиявиро чен кардааст, вале дар бораи нигоҳдории энергия чизе нагуфтааст.

Таҷрибаҳои барқарорсозӣ ҳамин фарқро дар миқёси калонтар нишон медиҳанд. Ҳангоми бастани Комплекси I ҷараёни оксиген тақрибан се маротиба барқарор шуд, дар ҳоле ки синтези ATP танҳо тақрибан 1.5 маротиба барқарор шуд. Ба электрод оксигени бештар расид. Қисми камтари он барои ҳосил кардани ATP сарф шуд. Ҳар гуна иддаои беҳтар шудани фосфорилонии оксидшавӣ бояд ҷониби ATP-и ҳисобро низ дар бар гирад; беҳтар аст, ки он ҳамчун таносуби ATP ба оксиген бо зикри тарзи ифодаи махраҷ пешниҳод шавад.

Таҳлилҳои ATP суръати синтезро чен мекунанд; миқдори ATP ҷойгузини он шуда наметавонад

Таҳлили ATP ба саволи дигар ҷавоб медиҳад: дар як воҳиди вақт чӣ қадар ATP ҳосил мешавад. Нишондиҳандаи кинетикӣ, хоҳ люминессенсияи люсиферазаи оташак бошад, ки дар тӯли чанд дақиқа пайгирӣ мешавад, хоҳ таҳлили ферментии пайвасти гексокиназа ва глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа бошад, ки дар 340 nm хонда мешавад, суръатро медиҳад. Андозагирии якдафъаинаи ATP-и умумӣ дар нуқтаи ниҳоӣ миқдорро медиҳад. Ин миқдор фарқи байни синтез ва истеъмолро инъикос мекунад ва худ аз худ дар бораи фосфорилонии оксидшавӣ маълумоти кам медиҳад.

Гурӯҳи Будапешт усули ферментии пайвастро бо пахш кардани фаъолияти аденилаткиназа истифода бурд ва муайян кард, ки кабуди метилен дар консентратсияи аз 1 то 2 uM истеҳсоли ATP-ро дар митохондрияҳои бо ротенон ва антимитсин коркардшуда каме, вале ба таври назаррас зиёд кардааст. Ин барқароршавии воқеӣ аст, аммо қисман. Таҳқиқоти заҳролудии TEGDMA дар модели дигар ба натиҷаи ҳаммонанд расид: 5 mM мономери дандонпизишкии TEGDMA нафаскашии ба Комплекси I вобастаро аз тақрибан 286 то 28 воҳиди ҷараён коҳиш дод ва 2 uM рангкунанда онро то тақрибан 86 барқарор кард.

Барои пайвастагии рангаи иштироккунанда дар оксиду барқароршавӣ ду назорат ҳатмист. Аввал, таҷрибаро бо олигомитсин гузаронед, то муайян шавад, ки чӣ қисми синтези ченшудаи ATP ба ATP-синтаза вобаста аст. Дуюм, дар шароити бе ҳуҷайра санҷиши барқарорёбии иловаи маълумро бо ATP-и миқдораш маълум, маҷмӯи пурраи реагентҳо ва маҳз ҳамон консентратсияҳои рангкунандае, ки истифода шудаанд, гузаронед: ҳадди ақал 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM ва 2 uM. Рангкунанда метавонад нури хориҷшударо фурӯ барад, ферменти нишондиҳандаро боздорад ё химияи оксиду барқароршавии реагентҳоро тағйир диҳад. Дастури умумии таҳлили люсифераза маҳз барои чунин навъи дахолат санҷишҳои муқоисавии биохимиявиро тавсия медиҳад. Гумон накунед, ки 1 uM аз артефактҳо озод аст, танҳо барои он ки хомӯшшавии флуорессенсия одатан дар консентратсияҳои баландтар қавитар мешавад.

Зондҳои потенсиали мембрана тақсимшавии рангкунандаро чен мекунанд, на ҷараёнро

Сафранин O, TMRM ва TMRE, родамин 123 ва JC-1 ҳама катионҳое мебошанд, ки аз мембрана мегузаранд. Онҳо мувофиқи мувозинати электрохимиявӣ дар матритсаи манфӣ заряднок ҷамъ мешаванд. Аз ин рӯ, флуорессенсияи умумӣ потенсиалро ғайримустақим, тавассути ҷойгиршавии зонд нишон медиҳад. Ҳеҷ яке аз онҳо ATP ё ҷараёни электронҳоро чен намекунад.

Ҳар зонд барои навъи муайяни препарати таҷрибавӣ муносибтар аст. Сафранин O барои митохондрияҳои ҷудокардашуда ва ҳуҷайраҳои гузаронокшуда мувофиқ аст; он одатан дар тақрибан 2 uM, бо ангезиш дар наздикии 495 nm ва хориҷшавии нур дар наздикии 585 nm истифода мешавад. Он дар реҷаи хомӯшшавии флуорессенсия кор мекунад, ки дар он ҷаббида шудани зонд флуорессенсияи умумиро тағйир медиҳад. TMRM ва TMRE барои ҳуҷайраҳои солим бо боркунии пасти наномолярӣ дар реҷаи бе хомӯшшавӣ мувофиқанд: деполяризатсия рангкунандаро озод мекунад ва флуорессенсияи митохондриявӣ кам мешавад. Ҳангоми боркунии баланд самти сигнал метавонад аз сабаби худхомӯшшавӣ баръакс шавад. JC-1 таносуби қулайи сабз ба сурхро медиҳад, вале ба боркунӣ ва массаи митохондриявӣ вобаста аст. Аз ин рӯ, барои кори миқдорӣ он нисбат ба TMRM-и бодиққат назоратшуда заифтар аст. Ин бартарӣ ва маҳдудиятҳо дар шарҳи васеъ истифодашавандаи зондҳои потенсиали мембранаи митохондрияҳо ҷамъбаст шудаанд.

Кабуди метилен маҳз дар консентратсияҳои корӣ дахолати оптикӣ ба вуҷуд меорад. Тасмаҳои фурӯбарии он дар наздикии 600 то 665 nm бо нури сурхи хориҷшавандаи зондҳо ҳампӯшӣ доранд. Аз ин рӯ, таъсири филтри дохилӣ, хомӯшшавии флуорессенсия ва фурӯбарии нури ангезиш ҳама эҳтимолҳои воқеӣ мебошанд. Рангкунанда инчунин катиони дуюми липофилист, ки тақсимшавии худаш бо потенсиали ченшаванда тағйир меёбад. Роҳи муҳофизат истифодаи ченкуниҳои такрорӣ бо усулҳои мустақил ва назоратҳои холӣ аст: танҳо зонд, танҳо рангкунанда, зонд бо ҳар консентратсияи рангкунанда, деполяризатсияи пурра бо FCCP ҳамчун нуқтаи сифрӣ ва, беҳтараш, зонди дуюме, ки аз ҷиҳати оптикӣ фарқ мекунад. Таҳқиқоти гузаштан аз роҳи алтернативӣ ба ҷои Комплекси III чунин намуна гузошт: баъд аз боздорӣ бо антимитсин ва миксотиазол барқароршавии потенсиали мембрана ҳам бо сафранин O ва ҳам бо TMRM такроран чен карда шуд ва натиҷаи сифатии якхела ба даст омад. Як нишондиҳандаи оптикӣ ишора аст. Ду нишондиҳандаи мустақил далеланд.

Се навъи препарат, се саволи гуногун

Митохондрияҳои ҷудокардашуда, ҳуҷайраҳои гузаронокшуда ва ҳуҷайраҳои солим сатҳҳои ивазшавандаи ҳассосияти як таҳлил нестанд. Онҳо мафҳумҳои гуногун бо принсипҳои гуногуни амалӣ мебошанд.

Митохондрияҳои ҷудокардашуда занҷири интиқоли электронҳо, мембранаи дохилӣ ва дастгоҳи матритсаро нигоҳ медоранд, вале мембранаи плазмавӣ, ситозол ва сохтори шабакаро аз байн мебаранд. Ҳадаф маҳз ҳамин ҷудокунист: субстратҳо, ADP, боздорандаҳо ва консентратсияҳои рангкунанда дақиқ муайян мешаванд, то роҳро муайян кардан мумкин бошад. Камбудии он аз даст рафтани таъминоти табиии субстратҳо, сигналдиҳӣ ва талабот аст.

Ҳуҷайраҳои гузаронокшуда митохондрияҳоро дар қисми зиёди сохтори ҳуҷайравии онҳо нигоҳ медоранд, вале ба субстратҳои беруна ва ADP имкон медиҳанд, ки аз мембранаи плазмавии кушодашуда гузаранд. Онҳо воситаи муносиб барои муайян кардани нуқси роҳи истифодаи субстрат дар муҳити ҳуҷайравӣ мебошанд. Гузароноккунии аз ҳад зиёд мембранаи беруниро осеб медиҳад ва танзими ситозолӣ ҳангоми шустан аз даст меравад.

Ҳуҷайраҳои солим ҳама чизро нигоҳ медоранд: монеаи мембранаи плазмавӣ, моддаҳои барқароркунандаи ситозолӣ, интиқоли субстратҳои дохилӣ, шабакаи митохондриявӣ ва талабот ба ATP. Онҳо ба физиология наздиктарин ва аз ҷудо кардани механизм дуртаринанд, зеро ҷаббида шудан, барқароршавии химиявӣ ва дар қисмҳои ҳуҷайра нигоҳ дошта шудани рангкунанда ҳама ба таъсири воқеии он ба митохондрияҳо шакл медиҳанд.

Таҳқиқоти TEGDMA ҳар се сатҳро ҳадафмандона истифода бурд: митохондрияҳои ҷудокардашудаи мағзи сар барои барқарорсозии оксидшавӣ ва потенсиал бо рангкунанда; ҳуҷайраҳои бунёдии гузаронокшудаи пулпаи дандон асосан барои муайян кардани он ки нуқс дар оксидшавии субстратҳои ба Комплекси I вобаста ҷойгир аст; ва ҳуҷайраҳои бунёдии солим барои муайян кардани таъсири холиси физиологии 2 uM рангкунанда ба истеъмоли коҳишёфтаи оксиген. Барои хонандагоне, ки нишондиҳандаҳои митохондриявиро байни препаратҳои гуногун муқоиса мекунанд, мақолаи ҳамроҳ дар бораи он ки кабуди метилен чӣ гуна электронҳоро тавассути занҷири нафаскашӣ мегузаронад, заминаи роҳҳоро шарҳ медиҳад; дастури хондани таҳқиқоти нафаскашӣ бо кабуди метилен бошад, мантиқи миқдор ва боздорандаҳоро баррасӣ мекунад.

Назоратҳое, ки рангкунандаи аз ҷиҳати оксиду барқароршавӣ фаъол талаб мекунад

Моддае, ки даврзании оксиду барқароршавӣ мекунад, нисбат ба боздорандаи маъмул рӯйхати дарозтари назоратҳоро талаб мекунад, зеро химияи худи рангкунанда метавонад ба равандҳои биологӣ монанд шавад.

Барои респирометрия камераеро танҳо бо буфер барои санҷиши тағйирёбии заминавӣ, камераеро бо буфер ва рангкунанда бе маводи биологӣ, рангкунандаро бо ҳар гуна моддаи барқароркунандаи берунҳуҷайравии дар таҳлил мавҷудбуда ва дар охир ротенон бо антимитсинро барои муайян кардани истеъмоли ғайримитохондриявии оксиген дар ҳуҷайраҳои солим истифода баред. Дар назар дошта бошед, ки рангкунандаи барқароршуда бо интиқоли электронҳо ба оксиген дубора оксид мешавад ва пероксиди гидроген ҳосил мекунад. Аз ин рӯ, назорати холии танҳо рангкунанда бе донори электрон истеъмоли оксигенро дар муҳити бе ҳуҷайра, ки баъди дастрас шудани NADH ё NADPH пайдо мешавад, камтар аз воқеият нишон медиҳад.

Барои пероксиди гидроген Amplex UltraRed-и калибршуда бо пероксидазаи решаи хренро аз рангкунандаҳои ғайриинтихобии DCFDA авлотар донед, натиҷаро бо каталаза санҷед ва вобастагиро ба рӯшноидиҳӣ озмоед, зеро рангкунанда фотосенсибилизатор аст. Таҳқиқоти митохондрияҳои мағзи сар нишон дод, ки аллакай дар 100 nM рангкунанда сарбории пероксид зиёда аз чор маротиба зиёд шуд ва хориҷсозии он суст гардид. Пероксид бевосита аз рангкунандаи барқароршуда, бе марҳилаи мобайнии супероксид ҳосил мешуд. Ҷузъиёти интихоби зонд ва назоратҳои рӯшноӣ дар мақолаи ҳамроҳ оид ба андозагирии шаклҳои фаъоли оксиген дар таҷрибаҳо бо рангкунандаҳо баррасӣ мешаванд. Саволи васеътар дар бораи он ки пероксид кай ҳамчун сигнал ва кай ҳамчун сарборӣ амал мекунад, дар баробари тавозуни оксиду барқароршавии ҳуҷайра ва иддаоҳои антиоксидантӣ шарҳ дода шудааст.

Барои иддаоҳо дар бораи роҳҳо ҳар ду ҷойи боздории Комплекси III-ро санҷед: антимитсин A дар ҷойи Qi ва миксотиазол дар ҷойи Qo; инчунин санҷиши ниҳоии Комплекси IV-ро бо сианид гузаронед. Таҳқиқоти пешинаи мағзи сари муш гузориш дода буд, ки рангкунанда нафаскашии бо ротенон басташударо барқарор мекунад, вале нафаскашии бо антимитсин басташударо не. Таҳқиқоти баъдии се намуд бошад, барқароршавии қисманро бо ҳар ду боздоранда ва далелҳои барқароршавии бевоситаи ситохром c пайдо кард. Гузаштан аз роҳи алтернативиро бо маълумоти навтар мувофиқ ҳисобед, на масъалаи ҳалшуда, зеро консентратсияи рангкунанда, ҷойи таъсири боздоранда, ҳолати субстрат ва тақсимшавии рангкунанда ҳама роҳи мушоҳидашавандаро тағйир медиҳанд.

Ҷадвали интихоби таҳлил

Аз ин ҷадвал истифода баред, то андозагириро мувофиқи савол интихоб кунед, на баръакс.

Барои иддаои ҳадди ақали боварибахш ҳамон консентратсияҳои рангкунанда — 100 nM, 300 nM, 1 uM ва 2 uM — бояд дар ченкунии ҷараёни оксиген дар шароити ихроҷи протонҳо, ADP, олигомитсин ва ҷудокунандаи пайвастшавии энергетикӣ, суръати синтези ATP, потенсиали мембрана беҳтараш бо ду зонд ва хориҷшавии калибршудаи пероксид бо каталаза ва назоратҳои бе ҳуҷайра истифода шаванд. Маҷмӯи ба ҳам вобастаро гузориш диҳед: ҷараёни оксиген, суръати ATP, ATP ба оксиген, потенсиал ва пероксид. Ҳар яке аз ин рақамҳо дар алоҳидагӣ танҳо андозагириест, ки ҳанӯз маънои худро меҷӯяд.