Мақола
Кабуди метилен дар озмоишҳои лаборатории G6PD: моддаи рангкунанда воқеан чӣ кор мекунад
Донишҷӯ пас аз инкубатсия ду найчаи озмоиширо мушоҳида мекунад. Яке ранги интизоршударо гирифтааст. Дигаре — не. Донишҷӯ хулоса мебарорад, ки бемори дуюм норасоии глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа дорад. Ин хулоса метавонад дуруст бошад, аммо чунин андешаронӣ мафҳумеро нодида мегирад, ки асоси кори озмоиш аст. Ҳеҷ чиз дар найча ферментро мустақиман чен намекунад. Дар найча он чизе чен мешавад, ки фермент ҳосил мекунад, ва кабуди метилен ҳамчун миёнарав истифода мешавад.
Вақте ин ченкунии ғайримустақим равшан мешавад, тартиби иҷро, намунаҳои назоратӣ ва рӯйхати тӯлонии натиҷаҳои бардурӯғ дигар худсарона ба назар намерасанд.
Ҷавоби кӯтоҳ
Кабуди метилен дар санҷиши G6PD индикатори оксидшавию барқароршавӣ аст. Ферменти G6PD NADPH ҳосил мекунад ва системаҳои вобаста ба NADPH кабуди метиленро аз шакли кабуд ба шакли лейкои беранг барқарор мекунанд ё онро барои интиқоли электронҳо истифода мебаранд. Фаъолияти муқаррарии фермент барқароршавии самаранокро таъмин мекунад. Фаъолияти нокифоя боиси барқароршавии суст ё нопурра мегардад. Тамоми сигнали озмоиш ҳамин аст.
Ду усули таърихӣ аз як моддаи рангкунанда истифода мебаранд, аммо нуқтаи ниҳоии онҳо фарқ мекунад. Агар онҳоро аз ҳам ҷудо нигоҳ доред, аксари нофаҳмиҳо бартараф мешаванд.
Ду озмоиш, як моддаи рангкунанда, нуқтаҳои ниҳоии гуногун
Аввалӣ озмоиши мустақими барқароршавии кабуди метилен аст, ки онро Сасс ва ҳамкоронаш тавсиф кардаанд ва баъдтар Гиббс арзёбӣ кардааст. Дар ин ҷо нуқтаи ниҳоӣ худи моддаи рангкунанда аст: кабуди метилени оксидшудаи кабуд ба лейкометилен кабуди беранг барқарор мешавад ва суръати ин тағйирот қобилияти ҳосил кардани NADPH-ро инъикос мекунад. Мақолаи аввалияи скринингӣ дар PubMed бо номи Сасс ва ҳамкорон (1966) феҳрист шудааст.
Дуюмӣ озмоиши барқароршавии метгемоглобини Бруэр аст. Аввал нитрити натрий гемоглобинро ба метгемоглобини қаҳваранг оксид мекунад. Сипас кабуди метилен ҳамчун миёнарави интиқоли электронҳо амал мекунад: кабуди метилени барқароршуда эквивалентҳои барқароркунандаро ба метгемоглобин интиқол дода, онро боз ба гемоглобини сурх табдил медиҳад. Аз ин рӯ, нуқтаи ниҳоии намоён қаҳваранг дар муқоиса бо сурх аст, на кабуд дар муқоиса бо беранг. Усули аслӣ дар Бюллетени Созмони ҷаҳонии тандурустӣ (Бруэр ва ҳамкорон, 1960) нашр шудааст.
Озмоиши Бруэрро озмоиши берангшавии моддаи рангкунанда номидан аз ҷиҳати кимиёвӣ дақиқ нест. Моддаи рангкунанда дар давр иштирок мекунад; гемоглобин рангашро дигар мекунад. Схемаи зер ҳар ду роҳро нишон медиҳад.
Реаксияи асосӣ
G6PD қадами аввалини оксидшавии роҳи пентозофосфатиро катализ мекунад:
Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
Эритроситҳои болиғ барои таъмини NADPH ба ин роҳ хеле вобастаанд, чунон ки дар мақолаи баррасии Лутсатто ва ҳамкорон дар Blood (2020) шарҳ дода шудааст. NADPH глутатионро дар ҳолати барқароршуда нигоҳ медорад ва ҳуҷайраро аз осеби оксидшавӣ муҳофизат мекунад. Кабуди метилен ба ин низом ҳамчун қабулкунандаи электронҳо ворид мешавад. Миқдори кофии G6PD миқдори кофии NADPH медиҳад, ки дар навбати худ барқароршавии самаранокро таъмин мекунад. Сатҳи пасти G6PD ин занҷирро дар ҳалқаи аввалаш мешиканад.
Моддаи рангкунандаро нишондиҳандаи сӯзишворӣ тасаввур кунед, на муҳаррик. Он дар бораи таъминоти NADPH хабар медиҳад. Ҳар омили дигаре, ки ин таъминот ё хониши натиҷаро тағйир медиҳад, метавонад нишондиҳандаро бе ягон тағйир дар ген ҷунбонад.
Тартиби иҷрои озмоиши навъи Бруэр
Таркиби реактивҳо дар тӯли даҳсолаҳо тағйир ёфтааст, бинобар ин тавсифи таълимиро набояд бо протоколи клиникӣ як шуморид. Ҳар лаборатория тартиби стандартии кории санҷида ва тасдиқшудаи худро риоя мекунад. Бо дарназардошти ин огоҳӣ, тартиби классикии найчагӣ чунин аст; шакли дорои се найча ва инкубатсияи 3-соата дар ин татбиқи нашршуда ҳуҷҷатгузорӣ шудааст:
- Найчаи бемор: хуни пурра бо глюкоза, нитрити натрий ва кабуди метилен. Нитрит метгемоглобин ҳосил мекунад, глюкоза мубодилаи моддаҳои эритроситҳоро таъмин мекунад ва моддаи рангкунанда интиқоли вобаста ба NADPH-ро имкон медиҳад.
- Намунаи назоратии оксидшуда: хун бо нитрит ва глюкоза, аммо бе кабуди метилен. Он нуқтаи ниҳоии қаҳваранги метгемоглобин, яъне намуди хоси норасоиро нишон медиҳад.
- Намунаи назоратии гемоглобин: хун бо об. Он нуқтаи ниҳоии сурхи гемоглобин, яъне намуди муқаррариро нишон медиҳад.
- Инкубатсия кунед: ҳамаи найчаҳоро дар ҳарорати тақрибан 37 C, одатан барои 3 соат, бо омехтакунии нарм нигоҳ доред.
- Рақиқ кунед: қисми хурди ченшудаи ҳар найчаро ба оби муқаттар илова кунед, то ҳуҷайраҳо лизис шаванд ва муқоисаи рангҳо осон гардад.
- Муқоиса кунед: найчаи беморро бо ду намунаи назоратӣ муқоиса кунед. Бозгашт ба ранги сурх қобилияти назарраси барқароркуниро нишон медиҳад. Боқӣ мондани ранги қаҳваранг аз норасоии шадид дарак медиҳад.
Дар як таркиби таърихӣ тақрибан 1 mL хун бо реактивҳои дорои тақрибан 180 mM нитрити натрий, 280 mM декстроза ва 0.4 mM кабуди метилен истифода мешуд. Ин рақамҳоро ҳамчун намуна аз адабиёт қабул кунед, на ҳамчун мушаххасоти умумӣ.
Хондани натиҷа
| Намуд | Намуди зоҳирӣ дар озмоиши Бруэр | Маъно |
|---|---|---|
| Муқаррарӣ | Ранги найчаи бемор ба намунаи назоратии сурхи гемоглобин наздик мешавад | Қобилияти барқароркунӣ аз ҳадди скрининг болотар аст |
| Норасоӣ | Найчаи бемор қаҳваранг мемонад ва ба намунаи назоратии метгемоглобин наздик аст | Скрининг ба норасоии шадиди G6PD ишора мекунад |
| Мобайнӣ | Ранг байни ду намунаи назоратӣ қарор дорад | Фенотипро муайян накунед; фаъолиятро ба таври миқдорӣ чен кунед |
Скрининги сифатӣ дар сатҳи тақрибан 30 то 40 фоизи фаъолияти муқаррарӣ беҳтарин фарқгузорӣ мекунад, чунон ки дар ин мақолаи баррасии Malaria Journal дар бораи камбудиҳои ошкорсозии G6PD муҳокима шудааст. Аз ин рӯ, натиҷаи муқаррарии скрининг маънои онро дорад, ки озмоиш норасоии шадидро ошкор накард. Он комилан муқаррарӣ будани фаъолиятро тасдиқ намекунад.
Чаро скрининг метавонад ба иштибоҳ барад
Ретикулоситоз пас аз гемолиз сабаби классикии натиҷаи бардурӯғи муқаррарӣ аст. Эритроситҳои ҷавон ва ретикулоситҳо нисбат ба ҳуҷайраҳои кӯҳна G6PD-и бештар доранд. Ҳангоми ҳодисаи шадиди гемолиз ҳуҷайраҳои кӯҳнатарин ва дорои норасоии бештар шояд аллакай нобуд шуда бошанд ва танҳо гурӯҳи ҳуҷайраҳои ҷавоне боқӣ монад, ки фаъолияташон дар санҷиш муқаррарӣ мебарояд. Ҳамин хусусияти биологӣ на танҳо скринингҳои рангӣ, балки озмоишҳои миқдориро низ ба иштибоҳ мебарад.
Хунгузаронии ба наздикӣ анҷомшуда норасоиро пинҳон мекунад, зеро эритроситҳои донор ферменти худро ба намуна ворид мекунанд. Mayo Clinic Laboratories хунгузарониро дар баробари ретикулоситоз ва таъсири халалрасони лейкоситҳо аз сабабҳои натиҷаҳои беэътимоди ферментӣ номбар мекунад.
Занони гетерозиготӣ ҳолати душвортарин мебошанд. Ғайрифаъолшавии тасодуфии хромосомаи X омехтаи эритроситҳои муқаррарӣ ва дорои норасоиро ба вуҷуд меорад ва фаъолияти умумӣ метавонад аз норасоии шадид то сатҳи зоҳиран муқаррарӣ қарор гирад. Скринингҳои сифатӣ аксар вақт фенотипҳои мобайниро ошкор намекунанд. Дар ҳуҷҷатҳои Созмони ҷаҳонии тандурустӣ оид ба санҷиши G6PD ин маҳдудият муфассал муҳокима шудааст.
Муҳлати нигоҳдории намуна, ҳарорати нигоҳдорӣ, субъективӣ будани арзёбии нуқтаи ниҳоии намоён, гематокрит ва сифати реактивҳо ба ин таъсирҳои биологӣ номуайянии таҳлилиро низ илова мекунанд.
Скрининг ташхис нест
Натиҷаи скрининг, ки норасоӣ ё фаъолияти мобайниро нишон медиҳад ё ба ҳолати клиникӣ мувофиқат намекунад, озмоиши миқдории фаъолияти ферменти G6PD-ро талаб мекунад. Созмони ҷаҳонии тандурустӣ спектрофотометрияи миқдориро бо назорати ҳарорат усули истинодӣ мешуморад. Дар ин озмоиш ба гемолизати эритроситҳо глюкоза-6-фосфат ва NADP+ илова мекунанд ва NADPH-и ҳосилшударо аз рӯйи афзоиши ҷаббиши рӯшноӣ дар 340 nm пайгирӣ мекунанд. Суръати тағйирот ба фаъолияти фермент мутаносиб аст ва одатан нисбат ба гемоглобин бо воҳидҳо ба ҳар грамм ифода мешавад. Амалияи кунунии лабораторияҳои клиникӣ дар сабти феҳристи озмоишҳои Mayo барои фаъолияти G6PD ҷамъбаст шудааст.
Барои тафсир фосилаи истинодии аз ҷониби лаборатория санҷида ва тасдиқшуда истифода мешавад, ки аксар вақт нисбат ба фаъолияти муқаррарӣ дар аҳолӣ ифода мегардад; норасоӣ одатан дар атрофи ҳадди 30 фоиз ва фаъолияти мобайнӣ болотар аз он баррасӣ мешавад. Профилҳои ҳадафии маҳсулоти Созмони ҷаҳонии тандурустӣ барои озмоишҳои G6PD (2022) ин чаҳорчӯбаи ташхисиро муайян мекунанд. Агар гемолиз ё хунгузаронии ба наздикӣ анҷомшуда муайянкунии фенотипро беэътимод созад, санҷишро пас аз дубора мувозинат ёфтани таркиби эритроситҳо такрор кунед; санҷиши молекулавӣ метавонад маълумоти иловагӣ диҳад, аммо ченкунии ферментро иваз намекунад.
Ҳудуде, ки бояд нигоҳ дошт
Кабуди метилен дар ин озмоишҳо реактиви лаборатории ex vivo аст. Ин масъала аз бехатарии ба бемор додани кабуди метилен ҷудо аст; масъалаи охирин дар дастур оид ба зиднишондодҳои кабуди метилен баррасӣ мешавад. Биокимиё онҳоро ба ҳам мепайвандад, зеро дору низ ба барқароршавии вобаста ба NADPH такя мекунад, аммо моддаи рангкунанда дар найчаи озмоишӣ бо вояи дору дар ҷараёни хун як чиз нест. Барои фаҳмидани он ки ин модда дар шароити дигар ҳамчун воситаи рангкунӣ чӣ гуна амал мекунад, ба принсипҳои рангкунӣ бо кабуди метилен нигаред; барои шиносоӣ бо гурӯҳи кимиёвии он бошад, ба мавзӯи моддаҳои рангкунандаи оксидшавию барқароршавӣ дар лаборатория муроҷиат кунед.
Скрининг мепурсад, ки оё қобилияти барқароркунӣ солим ба назар мерасад. Санҷиши тасдиқкунанда мепурсад, ки воқеан чӣ қадар фермент мавҷуд аст. Моддаи рангкунанда ба саволи аввал хуб ҷавоб медиҳад, ба шарте ки аз он ҷавоби саволи дуюмро талаб накунанд.