Ченкунии шаклҳои фаъоли оксиген дар озмоишҳои кабуди метиленӣ

Ду озмоишгоҳ таҷрибаеро мегузаронанд, ки ҳар кадом онро озмоиши таъсири антиоксидантии кабуди метиленӣ меномад. Яке хабар медиҳад, ки ранг шаклҳои фаъоли оксигенро кам мекунад. Дигаре хабар медиҳад, ки онҳоро ҳосил мекунад. Ҳар ду каҷхатҳои возеҳи вобастагии таъсир аз миқдорро нишон медиҳанд. Ҳар ду ростқавланд. Сабаби фарқ на қаллобӣ асту на бесалоҳиятӣ. Сабаб он аст, ки ин ду гурӯҳ дар шароити рӯшноии гуногун чизҳои гуногунро бо зондҳое чен карданд, ки ба саволҳои гуногун ҷавоб медиҳанд, вале баъд ҳар ду ҷавобро бо як истилоҳ тавсиф карданд: ROS.

Чен кардани кабуди метиленӣ маҳз аз он сабаб душвор аст, ки ин молекула дар равандҳои кимиёвие иштирок мекунад, ки бояд онҳоро мушоҳида намояд. Дар торикӣ он электронҳоро байни донорҳо ва аксепторҳо интиқол медиҳад ва ба шакли ибтидоии худ бармегардад, то давраро боз такрор кунад. Дар рӯшноӣ он ба фотосенсибилизатор табдил ёфта, ба ҳолати барангехтаи триплетӣ мерасад. Аз ин ҳолат метавонад энергияро ба оксиген диҳад ва оксигени синглетӣ ҳосил кунад ё электронҳоро интиқол дода, радикалҳо ва пероксиди гидроген ба вуҷуд оварад. Ҳар зонде, ки ба ин система ворид мешавад, метавонад аз таъсири худи ранг оксид ё барқарор шавад, беранг гардад ё сигнали он аз ҷиҳати оптикӣ пӯшонида шавад. Аз ин рӯ, саволи аввал дар ҳар ченкунии ROS ҳеҷ гоҳ ин нест, ки адад чанд аст. Савол ин аст, ки таҳлил воқеан чиро ошкор мекунад ва ранг ба таҳлил чӣ таъсир мерасонад.

Amplex Red: таҳлили калибровкашудаи пероксиди гидроген

Омезиши кабуди метиленӣ ва Amplex Red, агар дуруст ба роҳ монда шавад, аз ҷиҳати илмӣ асосноктарин ҷуфт дар ин адабиёт аст. Механизми кимиёвӣ махсус аст: пероксидазаи хрен пероксиди гидрогенро истифода бурда, субстрати Amplex-ро ба маҳсулоти флуоресцентӣ — резоруфин — бо таносуби стехиометрии тақрибан як ба як оксид мекунад. Пероксиди намуна дар детектор ба флуоресенсия табдил меёбад. Ҳеҷ узви дигари гурӯҳи маъмули ROS ин реаксияро мустақиман ба роҳ намеандозад.

Бартарии ҳалкунанда калибровка аст. Мутахассиси бодиққат стандартҳои пероксидро бо консентратсияҳои маълум дар ҳамон буфер, бо ҳамон консентратсияҳои пероксидаза ва субстрат, ҳамон вақти инкубатсия ва ҳамон танзимоти оптикӣ месанҷад ва сипас намунаҳоро аз рӯйи он каҷхат арзёбӣ мекунад. Дар таҳқиқоти митохондрияҳои ҷудошудаи мағзи сар, ки асоси ин усул аст, муаллифон маҳз ҳамин корро карданд: дар охири ҳар озмоиш миқдорҳои маълуми пероксидро илова намуданд ва натиҷаҳоро на бо воҳидҳои шартии флуоресенсия, балки ҳамчун суръат бо пикомол дар як дақиқа ба ҳар миллиграмми сафеда гузориш доданд. Маҳз ҳамин амал дурахшро ба ченкунӣ табдил медиҳад.

Се ҷузъиёти он таҳқиқот сазовори пайравӣ мебошанд. Аввал, муаллифон сигналро бо каталаза, ки пероксидро таҷзия мекунад, санҷиданд. Афзоиши флуоресенсияе, ки кабуди метиленӣ ба вуҷуд оварда буд, пас аз илова кардани каталаза қатъ шуд. Ин тасдиқ кард, ки сигнал аз пероксид аст, на аз артефакти оптикӣ. Дуюм, онҳо таъсири рӯшноиро мустақиман санҷиданд: шуои барангезишро бо парда маҳдуд карданд, то намунаҳо як ҳаштяки миқдори муқаррарии рӯшноиро гиранд, ва сигнал ҳамагӣ нӯҳ фоиз кам шуд. Зиёда аз навад фоизи пероксиди гузоришшуда аз рӯшноии ченкунӣ вобаста набуд. Сеюм, онҳо бартарафшавии пероксидро бо электрод алоҳида чен карданд ва муайян намуданд, ки ранг ҳам ҳосилшавии онро зиёд мекунад ва ҳам бартарафшавиашро суст менамояд. Зонде, ки танҳо флуоресенсияи холисро нишон медиҳад, ин ду таъсирро бо ҳам омехта мекард.

Ин таҳлил ҳамоно роҳҳои ба хато рафтан дорад ва кабуди метиленӣ чандтои онҳоро ба вуҷуд меорад. Ранг дар ҳамон минтақаи сурхи спектр, ки резоруфин нур мебарорад, ба таври васеъ нурро фурӯ мебарад. Аз ин рӯ, дар консентратсияҳои баланди ранг намуна метавонад тавассути таъсири филтри дохилӣ сигнали худро пӯшонад. Бинобар ин, консентратсияи ранг дар стандартҳо бояд бо консентратсияи он дар намунаҳо яксон бошад. Amplex Red инчунин метавонад худ аз худ фотооксид шавад, ва маҳсулоти он — резоруфин — метавонад ба давраҳои фоторедоксӣ ворид гардад, ки супероксид ва пероксид ҳосил мекунанд. Ин махсусан муҳим аст, вақте ки дар таҷриба фотосенсибилизатор низ рӯшноӣ мегирад. Роҳи амалии ислоҳ ин аст, ки аввал намунаҳои кабуди метиленӣ шуоъ дода шаванд ва баъд қисмҳои ҷудошудаи онҳо бо реагентҳои Amplex дар торикӣ таҳлил гарданд, на ин ки ранг ва зонд якҷоя рӯшноӣ гиранд. Ниҳоят, супероксиддисмутаза сигнали Amplex-ро танҳо кам намекунад: табдил додани супероксид ба пероксид метавонад онро зиёд кунад. Агар дар санҷиши назоратӣ бо SOD флуоресенсия зиёд шавад, ин маънои нокомии санҷишро надорад. Ин нишон медиҳад, ки супероксид дар марҳилаи қаблии раванд иштирок мекунад.

DCFDA: нишондиҳандаи ғайримахсуси оксидшавӣ

Омезиши кабуди метиленӣ ва DCFDA манбаи қисми зиёди нофаҳмиҳост. DCFH-DA пешмоддаест, ки ба ҳуҷайра ворид мешавад. Эстеразаҳои дохили ҳуҷайра гурӯҳҳои ацетати онро ҷудо карда, DCFH-и ғайрифлуоресцентиро боқӣ мегузоранд, ва оксидшавии DCFH DCF-и флуоресцентӣ ҳосил мекунад. Рӯйхати моддаҳое, ки онро оксид мекунанд, дароз аст: радикалҳои гидроксилӣ, маҳсулоти мобайнии пероксидаза ва гем, диоксиди нитроген, кислотаи гипохлоритӣ ва радикалҳои аз пероксинитрит ҳосилшуда. Танҳо пероксиди гидроген онро мустақиман бо суръати барои таҳлил муносиб оксид намекунад; флуоресенсияи вобаста ба пероксид одатан иштироки оҳан, сафедаҳои гемдор ё равандҳои кимиёвии пероксидазаро талаб мекунад.

Танқиде, ки бояд дар ҳар бахши усулҳо иқтибос шавад, аз таҳлили DCFH ҳамчун зонд аз ҷониби Калянараман ва ҳамкорон бармеояд. Чунон ки дар таҳқиқоти митохондрияҳои мағзи сар, ки маҳз бо ҳамин сабаб DCFDA-ро рад кард, ҷамъбаст шудааст, онҳо нишон доданд, ки ин ранг суст реаксия мекунад, стехиометрияаш муайян нашудааст, калибровкаи боэътимод надорад ва бо пайвастагиҳое ҳам реаксия мекунад, ки ROS нестанд. Зонд инчунин он чиро чен мекунад, тақвият медиҳад: оксидшавии якэлектронии DCFH радикали DCF ҳосил мекунад, ки бо оксиген реаксия намуда, супероксид ба вуҷуд меорад; супероксид бошад, тавассути дисмутатсия ба пероксиди иловагӣ табдил меёбад. Яъне худи ченкунӣ қисме аз равандҳои кимиёвиеро ба вуҷуд меорад, ки гузориш медиҳад.

Ҳеҷ кадоме аз ин нуктаҳо DCFDA-ро бефоида намекунад. Онҳо нишон медиҳанд, ки ин санҷиши ибтидоӣ аст, на муайянкунии навъи модда. Афзоиши флуоресенсияи DCF маънои онро дорад, ки оксидшавии зонд аз таъсири оксидантҳо зиёд шудааст. Ин маънои афзоиши пероксидро надорад ва албатта маънои афзоиши умумии ROS-ро ҳам надорад — миқдоре, ки ҳеҷ як зонди ягона чен намекунад. Таҳқиқоти пешинаи кабуди метиленӣ, ки дар консентратсияҳои болотар аз як микромоляр ба оксидшавии DCF такя мекарданд, таъсирҳои прооксидантиро гузориш доданд, дар ҳоле ки системаҳои дигар дар ҳамон давра муҳофизат аз марги ҳуҷайраҳои аз пероксид баамаломадаро нишон доданд. Ҳар ду мушоҳида метавонанд барои як ранг дар муҳитҳои гуногуни редоксӣ дуруст бошанд, ва натиҷаи DCF ба танҳоӣ гуфта наметавонад, ки кадом оксидант сигналро ба вуҷуд овард. Аҳамияти таҳқиқоти пешинаи митохондрияҳои мағзи сар дар он аст, ки ин санҷиши ибтидоиро бо ченкунии калибровкашудаи пероксид иваз кард ва таъсирро мустақиман ошкор намуд: ҳатто сад наномоляр ранг хориҷшавии пероксидро дар ҳамаи субстратҳо ва ҳолатҳои нафаскашии санҷидашуда чанд баробар зиёд кард.

DCFDA боз як доми хоси кабуди метиленӣ дорад. Ин ранг ранги пуршиддат дорад ва аз ҷиҳати редоксӣ фаъол аст, аз ин рӯ метавонад флуоресенсияро беранг кунад, нурбарориро хомӯш намояд ё ҷузъҳои кимиёвии зондро новобаста аз ROS-и ҳуҷайра оксид кунад. Санҷиши назоратии бе ҳуҷайра, ки танҳо ранг ва зонд дорад, иловаи ихтиёрӣ нест. Ин ҳамон таҷрибаест, ки нишон медиҳад оё ранг бо зонд мутақобила мекунад.

Ба дом гирифтани спин ва ҷабби оксиген: муайянкунии навъ ва ҷараён

Дар ҳоле ки зондҳои флуоресцентӣ хабар медиҳанд, ки чизе пайдо шудааст, ки метавонад оксид шавад, резонанси спинии электронӣ бо домҳои спинӣ маълумотеро медиҳад, ки ба муайян кардани худи он модда наздиктар аст. Таҳқиқоти классикии фотокимиёи кабуди метиленӣ ESR-ро барои ошкор кардани радикали аскорбат аз ранг, аскорбат ва рӯшноӣ истифода бурд. Сипас дар озмоишҳои ҷабби оксиген ҳосилшавии пероксид ва дар озмоишҳои ба дом гирифтани спин ҳосилшавии радикали гидроксилиро бо катализи оҳан нишон дод. Ҳар усул ба саволе ҷавоб дод, ки усулҳои дигар дода наметавонистанд: ESR навъи радикалро муайян кард, ҷабби оксиген ҷараёни реаксияро новобаста аз ҳар гуна зонди флуоресцентӣ нишон дод, ва якҷоя онҳо исбот карданд, ки дар ҳамон системаи рӯшноигирифта ҳам роҳҳои оксигени синглетӣ ва ҳам роҳҳои радикалӣ амал мекунанд.

Он натиҷаи соли 1984 то ҳол ҳамчун огоҳӣ хонда мешавад. Дар ҳузури рӯшноӣ ва моддаи барқароркунанда ранг пероксид ҳосил кард, ва ҳангоми мавҷуд будани оҳан система радикали гидроксилӣ — фаъолтарин шакли ин гурӯҳро — ба вуҷуд овард. Муаллифон инро бо аскорбати чашм алоқаманд карданд ва истифодаи беэҳтиётонаи онро дар офталмология зери шубҳа гузоштанд. Хонандагони имрӯза бояд ба шароитҳо диққат диҳанд: рӯшноӣ, моддаи барқароркунанда ва оҳан. Ҳар кадоми онҳоро хориҷ кунед, ин роҳ заиф мешавад ё аз байн меравад.

Электродҳои оксигенӣ бо сабаби дигаре ҷойгоҳи худро доранд. Электроди навъи Кларк истеъмоли холиси оксигенро чен мекунад. Ин нишон медиҳад, ки равандҳои редоксие, ки ранг ба роҳ меандозад, оксигени молекулавиро сарф мекунанд ва маълумоти кинетикӣ медиҳад, ки ҳеҷ артефакти флуоресцентӣ онро сохтакорӣ карда наметавонад. Вале он маҳсулотро муайян намекунад. Ҳосилшавии пероксид, супероксид ва об, инчунин фурӯпошии оксигени синглетӣ ҳама оксигенро сарф мекунанд. Ҷараён бе муайянкунии навъ ҳамон қадар нопурра аст, ки муайянкунии навъ бе ҷараён. Аз ин рӯ, мақолаҳои қавӣ электродро бо таҳлили калибровкашудаи пероксид ё доми спинӣ якҷоя истифода мебаранд.

Чаро натиҷаҳои антиоксидантӣ бо ҳам мухолифанд

Агар ин се нишондиҳандаро паҳлуи ҳам гузорем, зиддиятҳои зоҳирии адабиёти кабуди метиленӣ ба фарқҳои усулҳо ва се далели биологӣ табдил меёбанд.

Аввал, ранг ҳам интиқолдиҳандаи электрон аст ва ҳам манбаи пероксид. Он электронҳоро аз ҷойҳои занҷири нафаскашӣ дур мекунад, ки дар онҳо оксиген дар акси ҳол ба супероксид табдил меёфт. Бо ин роҳ метавонад як навъи ROS-ро кам кунад, дар ҳоле ки шакли барқароршудаи он оксигенро мустақиман ба пероксид барқарор карда, навъи дигарро зиёд мекунад. Аз ин рӯ, озмоишгоҳе, ки бо кимиёи редоксии митохондрия ва нақши ранг дар гузаронидани электронҳо тавассути роҳи алтернативӣ сарукор дорад, бояд натиҷаҳои вобаста ба зондро интизор шавад: дар ҳамон кювета нишондиҳандаи ҳассос ба супероксид паст мешавад, вале нишондиҳандаи пероксид боло меравад.

Дуюм, пероксид дар миқдорҳои кам сигнал аст, на танҳо сабаби осеб. Таҳқиқоти митохондрияҳои мағзи муш, ки кори пешинаро идома дод, ҳосилшавии пероксидро ҳатто аз панҷоҳ наномоляр ранг бе осеби ДНК-и митохондрия дар сатҳҳои терапевтӣ муайян кард; коркарди пешакӣ инчунин аз осебҳои бо ротенон баамаломада муҳофизат намуд. Танҳо дар сад микромоляр, ки аз диапазони терапевтӣ хеле баланд аст, ранг ба порчаҳои интихобшудаи ДНК осеб расонд, ва рӯшноии сурх бо бист микромоляр ранг оксигени синглетие ҳосил кард, ки ба ҳамаи порчаҳои санҷидашуда осеб расонд. Механизми пешниҳодшуда горметикӣ аст: ҳосилшавии сабуки пероксид ҳимояҳои антиоксидантии вобаста ба Nrf2 ва биогенези митохондрияро фаъол мекунад, бинобар ин нишондиҳандаи кӯтоҳмуддати прооксидантӣ пеш аз натиҷаи дарозмуддати антиоксидантӣ меояд. Таҳлиле, ки пас аз як соат хонда мешавад, ва таҳлиле, ки пас аз як рӯз хонда мешавад, метавонанд бо ҳам мувофиқат накунанд, зеро дар ин фосила ҳолати биологӣ тағйир ёфтааст.

Сеюм, рӯшноӣ муайян мекунад, ки ҳатто кадом молекула мавҷуд аст. Рӯшноӣ рангро деметил карда, ба Azure B ва маҳсулоти ба он монанд табдил медиҳад, ва чароғи микроскоп дар болои зарф барои фотосенсибилизатсияи он кофист. Озмоишҳои торикӣ ва рӯшноӣ озмоишҳои гуногунанд, ва бахши назорати рӯшноӣ ва кор бо ранг дар ҳар протокол бояд онҳоро ҳамин тавр баррасӣ кунад.

Маҷмӯи ҳадди ақали санҷишҳои назоратӣ ва тарзи арзёбии ҳар иддао

Муқоисаи зер маводи аслии истинодии ин мақола аст. Пеш аз қабул кардани ҳар натиҷаи ROS бо кабуди метиленӣ, санҷед, ки муаллифон кадом сатрро иҷро кардаанд ва кадомашро гузарондаанд.

Аз ин қоидаи амалии тафсир бармеояд. Amplex бо пероксидаза, калибровка ва санҷиши каталаза далел дар бораи пероксид аст. DCFDA далел дар бораи оксидшавии ғайримахсуси зонд аст ва на чизи бештар. Ба дом гирифтани спин бо санҷишҳои назоратии моддаҳои радикалгиранда далел дар бораи навъи радикал аст. Ҷабби оксиген далел дар бораи ҷараён аст. Ҷумлае, ки аз имкони исботии таҳлил бештар иддао мекунад, ҳар қадар бо итминон навишта шуда бошад ҳам, ҷумлае дар бораи зонд аст, на дар бораи ранг. Муҳокимаҳои марбут ба вобастагӣ аз миқдор ва диапазони горметикӣ, ҷараёни электронҳо дар митохондрия, халалрасонӣ ба таҳлил дар намунаҳои рангкардашуда ва артефактҳои рӯшноӣ дар микроскопия ҳар яке аз ин нуктаро тавсеа медиҳанд, ва ҳар кадом пас аз иваз шудани истиноди муваққатиаш низ эътибори худро нигоҳ медорад.