మిథిలీన్ బ్లూ మరియు బార్టోనెల్లా: ప్రయోగశాల ఫలితాలు, క్లినికల్ ఆధారాల పరిమితులు

కల్చర్ పాత్రకూ, రోగికీ ‘ఇన్ఫెక్షన్’ అనే పదం ఉమ్మడిగా ఉన్నా, దాని అర్థం ఒకటి కాదు. పాత్రలో ఇన్ఫెక్షన్ అంటే అగార్‌పై ఉన్న కాలనీల సంఖ్య. రోగిలో అది కణాలు, రక్తనాళాల లోపల ఉన్న బ్యాక్టీరియా, రక్తం, కణజాలం గుండా ప్రయాణించే ఔషధాలు, పనిలో కొంత భాగాన్ని నిర్వర్తించే రోగనిరోధక వ్యవస్థతో కూడుకున్నది. ఈ రెండింటినీ కలిపి చూస్తే, ఆకట్టుకునే ప్రయోగశాల సంఖ్య ఒక చికిత్సలా కనిపించడం మొదలవుతుంది. వాటిని వేర్వేరుగా చూస్తే, అదే సంఖ్య నిజంగా దేనికి సూచనో స్పష్టమవుతుంది: తదుపరి ప్రయోగం చేయడానికి ఒక కారణం.

మిథిలీన్ బ్లూ, బార్టోనెల్లాపై ఈ సమీక్ష ప్రధాన పని ఆ తేడాను స్పష్టంగా ఉంచడమే. ఒకే పరిశోధనా బృందం చేసిన రెండు ప్రయోగశాల అధ్యయనాలు, వృద్ధి చెందని స్థితుల్లో ఉన్న Bartonella henselaeపై మిథిలీన్ బ్లూను పరీక్షించాయి. గాజు, ప్లాస్టిక్ పాత్రల్లో బలమైన క్రియాశీలతను రెండూ నివేదించాయి. ఏదీ మనిషిపై పరీక్షించలేదు.

పరిశోధకులు స్థిర దశను ఎందుకు పరీక్షిస్తారు

చాలా యాంటీబయాటిక్ పరీక్షల్లో వృద్ధి చెందుతున్న కణాలను ఉపయోగిస్తారు. ఆ నమూనా మరింత కష్టమైన పరిస్థితిని పరిగణనలోకి తీసుకోదు: విభజన ఆగిపోయి, వృద్ధి చెందుతున్న తోటి కణాలను చంపే ఔషధాలను తట్టుకునే కణాలు.

బార్టోనెల్లా శరీరంలో, ఎర్ర రక్తకణాలు, ఎండోథీలియల్ కణాల లోపల సహా, కొనసాగి ఉండగలదు. అందుకే B. henselae స్థిర దశలోకి ప్రవేశించిన తర్వాత ఏ ఆమోదిత ఔషధాలు దాన్ని చంపగలవో ఆ బృందం పరిశీలించింది. వృద్ధి చెందుతున్న కణాలపై తక్కువ MIC ఉండటం, స్థిర దశలోని కణాలను చంపగల సామర్థ్యాన్ని ముందుగా సూచించలేదు. రిఫాంపిన్‌కు చాలా తక్కువ MIC ఉన్నప్పటికీ, స్థిర దశ కణాలను చంపడంలో దాని సామర్థ్యం తక్కువగా ఉంది; ఎక్కువ MIC విలువలున్న సమ్మేళనాలు వాటిని బాగా చంపాయి. ఇలాంటి పరిశోధనా పత్రాన్ని చదవడానికి సాధారణ పద్ధతి కావాలనుకునే పాఠకులకు, మిథిలీన్ బ్లూ పరిశోధనను చదివే మార్గదర్శకంలో అది లభిస్తుంది.

మొదటి స్క్రీనింగ్: Li మరియు సహచరులు, 2019

Antibioticsలో ప్రచురితమైన 2019 స్థిర దశ స్క్రీనింగ్లో B. henselae JK53 అనే ఒకే స్ట్రెయిన్‌ను ఉపయోగించారు. దాన్ని 10 percent పిండ దశ పశు రక్త సీరమ్ కలిగిన Schneider మాధ్యమంలో, 37 C వద్ద, 5 percent CO2తో పెంచారు. ఒక రోజు కల్చర్‌లలో ఎక్కువగా విడివిడిగా ఉన్న, విభజన చెందుతున్న కణాలు కనిపించాయి. సుమారు 10 to the 8th colony forming units per mL ఉన్న ఐదు రోజుల కల్చర్‌లను స్థిర దశగా పరిగణించారు; వాటిలో కనిపించే కణ సమూహాలు ఉన్నాయి.

పరీక్షలో ప్రొపిడియం అయోడైడ్‌తో పాటు SYBR Green Iను ఉపయోగించారు. సజీవ కణాలు, ఐసోప్రొపనాల్‌తో చంపిన కణాల మిశ్రమాలతో దాన్ని క్రమాంకనం చేశారు. మిథిలీన్ బ్లూకు గాఢమైన రంగు ఉండటంతో, క్రియాశీలంగా కనిపించిన పదార్థాల ఫలితాలను సూక్ష్మదర్శినితో, ఆ తర్వాత మరింత కఠినమైన తుది ప్రమాణమైన బ్లడ్ అగార్‌పై కాలనీల లెక్కింపుతో నిర్ధారించారు.

50 micromolar వద్ద పరీక్షించిన 1,581 ఆమోదిత ఔషధాల్లో, మిథిలీన్ బ్లూ తర్వాత ప్లేట్ రీడర్ ప్రకారం 16 percent, సూక్ష్మదర్శిని ప్రకారం 25 percent జీవనశీలత మిగిలింది. డాప్టోమైసిన్ ఫలితం 21 percent, పలు అజోల్‌ల ఫలితాలు 22 నుంచి 27 percent, జెంటామైసిన్ 32 percent, ఎరిథ్రోమైసిన్ 66 percent, సిప్రోఫ్లోక్సాసిన్ 74 percentగా ఉన్నాయి. పైర్వినియం పామోయేట్ రీడర్‌పై మరింత బలంగా కనిపించింది, కానీ దాని సొంత ఫ్లోరెసెన్స్ కారణంగా సూక్ష్మదర్శినితో దాని ఫలితాన్ని కొలవలేకపోయారు.

వృద్ధి చెందుతున్న B. henselaeపై మిథిలీన్ బ్లూ MIC 0.08 నుంచి 0.16 micrograms per mLగా ఉంది. ఐదు రోజుల స్థిర దశ కణాలను 5 micrograms per mLకు గురిచేసినప్పుడు, ఒక రోజు తర్వాత గుర్తించదగిన కాలనీలు ఏవీ లేకుండా కాలనీల సంఖ్య తగ్గింది. పరీక్షించిన సాంద్రతల్లో డాప్టోమైసిన్, పైర్వినియం పామోయేట్ ఫలితాలతో ఇది సరిపోలింది. విడిగా నిర్వహించిన కాలానుగుణ కణనాశన పరీక్షలో 10 micrograms per mLను ఉపయోగించారు. ఇవి ప్రయోగశాలలో కణాలను ఔషధానికి గురిచేసిన స్థాయిలే తప్ప, మోతాదులు కావు; పత్రం కూడా వాటిని అలాగే పేర్కొంది. మనుషుల్లో గరిష్ఠ ప్లాస్మా విలువ సుమారు 3.9 micrograms per mLగా ఉందన్న ప్రస్తావన పత్రంలో నేపథ్య సమాచారంగా మాత్రమే కనిపిస్తుంది. ప్లాస్మా విలువను కణజాల విలువగా ఎందుకు భావించకూడదో మిథిలీన్ బ్లూ ఫార్మాకోకైనెటిక్స్ అవలోకనం వివరిస్తుంది.

పత్రంలో రెండు పరిమితులను స్పష్టంగా పేర్కొన్నారు. బయోఫిల్మ్ నమూనా లేదు; మిథిలీన్ బ్లూ కలయిక పరీక్షలూ లేవు. ఐదు రోజుల కణ సమూహాలు స్థిర దశ ద్రవ కల్చర్‌లోని గుంపులే తప్ప, ధృవీకరించిన బయోఫిల్మ్ ప్రయోగం కాదు. జంతువులపై పరిశోధన, ఔషధ కలయికల పరిశోధన, బయోఫిల్మ్ పరిశోధన, ఇతర బార్టోనెల్లా జాతులపై పరీక్షలు అవసరమని రచయితలు సూచించారు.

కలయికలు, బయోఫిల్మ్ నుంచి సేకరించిన కణాలు: Zheng మరియు సహచరులు, 2020

BMC Microbiologyలో ప్రచురితమైన 2020 తదుపరి అధ్యయనంలో అదే స్ట్రెయిన్, మాధ్యమాన్ని కొనసాగించారు. అయితే ఆరు రోజుల స్థిర దశ కల్చర్‌లను ఉపయోగించి, మొదటి పత్రంలో లేని రెండు అంశాలను చేర్చారు: రెండు ఔషధాల కలయికలు, బయోఫిల్మ్ నుంచి సేకరించిన కణాల నమూనా.

ప్రతి ఒక్క ఔషధాన్ని ఒకే 5 micrograms per mL స్థాయిలో 24 hours పాటు పరీక్షించినప్పుడు, మిథిలీన్ బ్లూ తర్వాత 3.2 times 10 to the 4th colony forming units per mL మిగిలాయి; నియంత్రణ నమూనాలో ఇది సుమారు 2.8 times 10 to the 10thగా ఉంది. అదే సమయంలో సిప్రోఫ్లోక్సాసిన్, జెంటామైసిన్, నైట్రోఫ్యూరాంటోయిన్ తర్వాత తక్కువ కాలనీలు మిగిలాయి. ఇది 2019 ఫలితానికి భిన్నం; అక్కడ అదే నిర్దేశిత స్థాయిలో ఒక రోజు తర్వాత గుర్తించదగిన కాలనీలు ఏవీ లేవు. కల్చర్ వయస్సు, సాంద్రత, నిర్వహణ విధానం వేర్వేరుగా ఉండటంతో, కణనాశన ధోరణి పునరావృతమైనా, దాని పరిమాణం ఒకేలా లేదు. ప్రయోగాల మధ్య కనిపించే ఈ మార్పు, ప్రామాణిక భద్రత, ఔషధ పరస్పర చర్యల పరిశీలనలు ప్రయోగశాల శక్తిని క్లినికల్ ప్రభావం నుంచి వేరుగా పరిగణించడానికి ఒక కారణం.

కలయికల స్క్రీనింగ్‌ను ఎక్కువగా ఉటంకిస్తారు. ప్రతి భాగాన్ని 5 micrograms per mL వద్ద స్థిరంగా ఉంచారు. అజిథ్రోమైసిన్‌తో మిథిలీన్ బ్లూ, రిఫాంపిన్‌తో మిథిలీన్ బ్లూ కలయికలు రెండూ 24 hours తర్వాత గుర్తించదగిన స్థిర దశ కాలనీలను మిగల్చలేదు. సిప్రోఫ్లోక్సాసిన్‌తో ఉన్న రెండు జంటల ఫలితాలూ అలాగే ఉన్నాయి. పరీక్షించిన 25 జంటల్లో ఈ నాలుగు మాత్రమే అలా పనిచేశాయి. అధికారిక సహక్రియా విశ్లేషణ చేయలేదు; అందువల్ల సరైన పదం ‘ఈ పరిస్థితుల్లో క్రియాశీలమైన కలయిక’ అనేదే తప్ప, ‘నిరూపిత సహక్రియ’ కాదు.

బయోఫిల్మ్ ప్రయోగంలో కొత్తగా ఏర్పడిన, భంగపరిచిన బయోఫిల్మ్ నుంచి సేకరించిన కణాలను పరీక్షించారు; చెక్కుచెదరని, పరిపక్వ బయోఫిల్మ్‌లోకి ఔషధం చొచ్చుకుపోవడాన్ని కాదు. కల్చర్‌లను ఐదు రోజులు పెంచి, పలుచన చేసి వెల్ ప్లేట్‌లలో మరో ఐదు రోజులు ఉంచారు. క్రిస్టల్ వైలెట్ రంగుతో నిర్ధారించిన తర్వాత, ఔషధానికి గురిచేయడానికి ముందు వాటిని గీకి సేకరించారు. 5 micrograms per mL వద్ద మిథిలీన్ బ్లూ ఒక్కటే ఉపయోగించినప్పుడు, day 6 నాటికి సంఖ్య 2.3 times 10 to the 2ndకు తగ్గింది. ఇది అత్యుత్తమ ఒక్కో ఔషధ ఫలితాల్లో ఒకటి అయినా, సున్నా కాదు. మిథిలీన్ బ్లూ కలయికలు రెండూ day 6 నాటికి సున్నాకు చేరాయి; సిప్రోఫ్లోక్సాసిన్ కలయికలు రెండూ అలాగే చేరాయి.

జాగ్రత్తగా చదివే పాఠకుడు గుర్తించే పరిమితులనే రచయితలూ పేర్కొన్నారు: పాత, చెక్కుచెదరని బయోఫిల్మ్‌కు బదులు కొత్తగా ఏర్పడిన, గీకి సేకరించిన బయోఫిల్మ్; ప్రతి ఔషధానికి వాస్తవిక గరిష్ఠ స్థాయిని ఉపయోగించకుండా అన్ని ఔషధాలకు ఒకే సౌకర్యవంతమైన సాంద్రత; అజిథ్రోమైసిన్ లేదా రిఫాంపిన్ ఆధారంగా ఎంపిక చేసిన కొన్ని జంటలు మాత్రమే; ఒకే స్ట్రెయిన్; జంతువులపై పరీక్షలు లేవు; రోగులపై పరీక్షలు లేవు. తర్వాత మూడు ఔషధాల పరిశోధనను ప్రతిపాదించారు కానీ, దాని ఫలితాలను నివేదించలేదు.

అధ్యయన రూపకల్పనల పోలిక

ఈ వ్యాసం సారాంశాన్ని పట్టిక సంక్షిప్తంగా చూపిస్తుంది. చివరి నిలువు వరుసకు ఎడమవైపు ఉన్నదంతా కల్చర్ పరిశోధనే. రెండు పత్రాల్లోని ఏ అంశమూ చివరి నిలువు వరుసలోకి రాదు.

బార్టోనెల్లా బొర్రేలియా కాదు

రెండు పత్రాలూ లైమ్ వ్యాధికి కారణమైన స్పైరోకీట్ Borrelia burgdorferiను ప్రస్తావిస్తాయి. ఎందుకంటే రంగు ఆధారిత పరీక్ష అదే ప్రయోగశాలలో గతంలో చేసిన బొర్రేలియా స్థిర దశ పరిశోధన నుంచి వచ్చింది; ఆ పరిశోధనలోనూ మిథిలీన్ బ్లూ, డాప్టోమైసిన్ క్రియాశీల పదార్థాలుగా గుర్తించబడ్డాయి. ఆ నేపథ్యం ఉపయోగకరమే అయినా, తరచూ అపోహలకు మూలమవుతుంది.

బార్టోనెల్లాపై ఈ రెండు పత్రాల్లోని ఏ ప్రయోగమూ బొర్రేలియాను బార్టోనెల్లాతో పక్కపక్కనే పరీక్షించలేదు. జీవులు వేరు, మాధ్యమాలు వేరు, సాంద్రతలు వేరు. బార్టోనెల్లాలో మిథిలీన్ బ్లూ కణపొరపై చూపవచ్చని భావించిన ప్రభావాన్ని కూడా మరింత అధ్యయనం అవసరమైన ఊహగానే పేర్కొన్నారు. ఒక జాతి ఫలితాలను మరో జాతికి వర్తింపజేయకూడదు; పరాన్నజీవుల గురించి విస్తృత వాదనలకు ఏ పత్రమూ మద్దతు ఇవ్వదు. ఈ కారణంగానే బొర్రేలియా, బార్టోనెల్లాలో నిలిచి ఉండే కణాల పోలిక, ఈ రెండు పరిశోధనా సాహిత్యాలను వేరుగా ఉంచుతుంది.

కల్చర్ ఫలితాలు చికిత్సా విధానంగా ఎందుకు మారవు

మిథిలీన్ బ్లూ బార్టోనెల్లా చికిత్సా విధానం గురించి వెతకాలనే ఆసక్తి అర్థం చేసుకోదగినదే. అయితే ఆ పదబంధాన్ని కొనుగోలు జాబితాగా కాకుండా హెచ్చరిక సంకేతంగా ఎందుకు చూడాలో ఈ పత్రాలు తెలియజేస్తాయి.

మొదటిది, వెల్‌లో 5 micrograms per mL ఉండటం వైద్యుని ప్రిస్క్రిప్షన్ కాదు. దానితో పాటు శోషణ, పంపిణీ, ప్రోటీన్ బంధనం, కణాల లోపలికి ప్రవేశం లేదా తట్టుకోగల సామర్థ్యానికి సంబంధించిన సమాచారం లేదు. యాంటీబయాటిక్‌ల గరిష్ఠ స్థాయిలకు సుమారు సగటుగా రచయితలు దీన్ని ఎంచుకున్నారు; భవిష్యత్తు పరిశోధనలో ప్రతి ఔషధాన్ని దాని సొంత వాస్తవిక స్థాయిలో ఉపయోగించాలని చెప్పారు.

రెండవది, సున్నా కాలనీలు అంటే ఆ ప్లేటింగ్ పరిస్థితుల్లో కాలనీలు లేవని మాత్రమే; కణజాలం సూక్ష్మజీవరహితమైందని కాదు. నిలిచి ఉండే కణాలు, కణాల లోపలి బ్యాక్టీరియా, నమూనా సేకరణ పరిమితులు అన్నీ అగార్ ప్లేట్ పరిధికి బయటే ఉంటాయి.

మూడవది, వెల్‌లో సూక్ష్మజీవులను పూర్తిగా తొలగించే కలయికలు శరీరంలో విఫలం కావచ్చు లేదా హాని కలిగించవచ్చు. అజిథ్రోమైసిన్‌తో మిథిలీన్ బ్లూ, రిఫాంపిన్‌తో మిథిలీన్ బ్లూ అనేవి ప్రయోగశాల స్థాయిల్లో పరీక్షించిన ప్రయోగశాల జంటలు. జంతువుల్లో ఫార్మాకోకైనెటిక్స్, మనుషులపై నియంత్రిత డేటా లేకుండా మోతాదు, వ్యవధి, ప్రయోజనం–ప్రమాదం నిష్పత్తి ఏవీ నిర్ధారించబడలేదు. ఎంపికలను పరిశీలించే ఎవరైనా వాటి గురించి వైద్యునితో చర్చించాలి; పాత్రలోని డేటా నుంచి ఏ నిర్ణయానికైనా వచ్చే ముందు మిథిలీన్ బ్లూ వాడకానికి వైద్య పర్యవేక్షణ ఎప్పుడు అవసరమో సమీక్షించాలి.

ఈ పత్రాలు సమర్థించే పరిమిత నిర్ధారణ ఇదే: ప్రయోగశాల పరిస్థితుల్లో వృద్ధి చెందని B. henselae JK53పై మిథిలీన్ బ్లూ క్రియాశీలత పునరావృతంగా కనిపించింది; రెండు ఔషధాల ప్రయోగశాల కలయికల్లోనూ ఇది కనిపించింది. కలయికలు, బయోఫిల్మ్ నుంచి సేకరించిన కణాలకు సంబంధించిన అత్యంత బలమైన ఫలితాలు 2020 అధ్యయనం నుంచి వచ్చాయి. మనుషుల బార్టోనెల్లోసిస్‌లో ఈ క్రియాశీలతకు ప్రాముఖ్యత ఉందా అనే అంశంతో సహా మిగతావన్నీ ఇంకా పరీక్షించబడలేదు.