மெத்திலீன் நீல ஈஸ்ட் சோதனைகள்: உயிருள்ள செல்களை எண்ணுவதும் சுவாச நேரத்தை அளவிடுவதும்

ஆய்வக மேசையில் இரண்டு குழாய்கள் உள்ளன. இரண்டும் நீல நிறத்தில் இருக்கின்றன. ஒன்றில், நுண்ணோக்கியில் தெரியும் நீல செல்கள் இறந்த ஈஸ்டைக் குறிக்கின்றன. மற்றொன்றில், நீலத்திலிருந்து நிறமற்றதாக மாறும் குழாய், ஈஸ்ட் உயிருடன் சுவாசித்துக்கொண்டிருப்பதைக் குறிக்கிறது. ஒரே சாயம், எதிரெதிரான விளக்கங்கள். இந்த இரண்டு சோதனைகளையும் குழப்பிக்கொண்டால், ஒவ்வொரு முடிவும் தலைகீழாகிவிடும்.

இந்த வேறுபாடுதான் கட்டுரையின் மையக்கருத்து. மெத்திலீன் நீலம் ஒரு ஆக்சிஜனேற்ற-ஒடுக்கச் சாயம்: ஆக்சிஜனேற்றப்பட்ட நிலையில் அது நீலமாகவும், ஒடுக்கப்பட்ட நிலையில் நிறமற்ற லியூகோமெத்திலீன் நீலமாகவும் இருக்கும். உயிர்வாழ்திறன் எண்ணிக்கை இந்த வேதியியலைக் குறுகிய நேர நுண்ணோக்கிப் பார்வையில் பயன்படுத்துகிறது. சுவாசப் பரிசோதனை இதையே மொத்தக் கலவையில் நேரம் அளவிடப்படும் வினையாகப் பயன்படுத்துகிறது. ஒவ்வொன்றுக்கும் தனித்தனி செய்முறை, கட்டுப்பாடுகள், விமர்சன ஆய்வு தேவை.

உயிர்வாழ்திறன் எண்ணிக்கை: குறுகிய நேரச் சாயமேற்றல், உடனடியாக மதிப்பிடுதல்

பீர் தயாரிப்பில் பயன்படுத்தப்படும் செய்முறையே மிகவும் தரப்படுத்தப்பட்ட வடிவமாகும். 2% சோடியம் சிட்ரேட்டில் 0.01% w/v மெத்திலீன் நீலத்தைத் தயாரித்து, ஈஸ்ட் மிதவைக் கலவையுடன் 1:1 விகிதத்தில் கலந்து, நிர்ணயிக்கப்பட்ட குறுகிய இடைவெளிக்குப் பிறகு கலவையைப் பார்வையிடுங்கள். வெளியிடப்பட்ட நேர இடைவெளிகள், பீர் தயாரிப்பு அறிவியல் நிறுவனக் கையேட்டில் 1 முதல் 2 நிமிடங்கள் வரையும், ஆராய்ச்சிச் செய்முறைகளில் சுமார் 5 நிமிடங்கள் வரையும் மாறுபடுகின்றன; OIV ஒயின் நுண்ணுயிரியல் முறை 10 நிமிடங்களுக்குள் பார்வையிட வேண்டும் எனக் கூறுகிறது. எண்ணிக்கைக் கலவையில் சாயத்தின் இறுதிச் செறிவு சுமார் 0.005% ஆகிறது. மேம்படுத்தப்பட்ட நியூபாவர் எண்ணிக்கை அறையில் கலவையை நிரப்பி, சுமார் 400x உருப்பெருக்கத்தில் அடர் நீல செல்களை உயிர்வாழ்திறனற்றவை என்றும், சாயமேறாத செல்களை உயிர்வாழ்திறனுள்ளவை என்றும் வகைப்படுத்துங்கள். OIV முறையில் வெளிர் நீல செல்கள் உயிருள்ளவையாகக் கணக்கிடப்படுகின்றன; கீழே விவாதிக்கப்படும் தனிநபர் மதிப்பீட்டுச் சிக்கலை இது ஏற்கெனவே சுட்டிக்காட்டுகிறது.

செல் செறிவு எண்ணிக்கை அறையின் வடிவியல் அளவுகளிலிருந்து பெறப்படுகிறது. மையத்திலுள்ள முழு 1 mm சதுரத்தையும் எண்ணும்போது, ஒரு mL-க்கான செல்கள் N பெருக்கல் நீர்த்தல் காரணி பெருக்கல் 10^4 ஆகும்; இங்கு N என்பது அந்தப் பகுதியில் எண்ணப்பட்ட செல்களின் எண்ணிக்கை. இது ASBC ஈஸ்ட் முறைகளில் விளக்கப்பட்டுள்ளது. உயிர்வாழ்திறன் கணக்கீடு இன்னும் எளிதானது: சாயமேறாத செல்களை மொத்தச் செல்களால் வகுத்து, 100-ஆல் பெருக்க வேண்டும். FEMS பீர் தயாரிப்பு ஒப்பீட்டு ஆய்வையும் OIV நடைமுறையையும் பின்பற்றி, உயிர்வாழ்திறன் மதிப்பீட்டிற்குச் சுமார் 400 செல்களை எண்ணுங்கள். ஒரே எல்லை விதியைத் தொடர்ந்து பயன்படுத்துங்கள்; உதாரணமாக, கீழ் மற்றும் இடது கட்டக்கோடுகளில் உள்ள செல்களைச் சேர்த்து, மேல் மற்றும் வலது கோடுகளில் உள்ளவற்றை விலக்கலாம்.

எண்ணத் தொடங்குவதற்கு முன்பே மொட்டுகளுக்கான விதியை நிர்ணயிக்க வேண்டும். பொதுவான நடைமுறையில், ஒரு மொட்டு தாய்ச் செல்லின் அளவில் சுமார் பாதியை எட்டியதும் தனிச் செல்லாக எண்ணப்படுகிறது; அதைவிடச் சிறியதாக இருந்தால் தாய்ச் செல்லுடன் சேர்த்து எண்ணப்படுகிறது. எந்த விதியைத் தேர்ந்தெடுத்தாலும், ஒவ்வொரு சதுரத்திற்கும் அதையே பயன்படுத்தி, அடுத்தவர் அதே முறையைப் பின்பற்றும் வகையில் பணித்தாளில் எழுதுங்கள்.

எண்ணிக்கைப் பணித்தாள் (இதை அச்சிடுங்கள்)

இந்தப் பணித்தாள் இக்கட்டுரைக்காகத் தனியாக உருவாக்கப்பட்டது. இதைக் குறிப்பேட்டில் நகலெடுக்கவும் அல்லது ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் ஒன்றை அச்சிடவும்.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, இங்கு N என்பது வரையறுக்கப்பட்ட எண்ணிக்கை அறைப் பகுதியிலிருந்து பெறப்படுகிறது. முதல் சூத்திரத்தில் உயிர்வாழ்திறன் சாயமேறாத செல்களின் விகிதத்திலிருந்தும், இரண்டாவதில் மொத்தச் செல் செறிவு எண்ணிக்கையையும் நீர்த்தல் காரணியையும் கொண்டும் கணக்கிடப்படுகிறது. முடிவுக்கு அருகில் சாயமேற்றல் நேர இடைவெளியைப் பதிவு செய்யுங்கள்; நேரம் குறிப்பிடப்படாத உயிர்வாழ்திறன் மதிப்பை மீண்டும் அதேபோல் பெற முடியாது.

உயிர்வாழ்திறன் மதிப்புகள் ஏன் மாறுகின்றன

நேரம்தான் முதல் குறுக்கீடு; அது இருவிதமாகவும் பாதிக்கிறது. வளர்சிதை மாற்றத்தில் செயல்படும் செல்கள் சாயத்தை ஒடுக்குகின்றன. ஆகவே, மிக விரைவாகப் பார்வையிட்டால், ஒடுக்கத்தை முடிக்காத உயிருள்ள செல்களை இறந்தவையாகத் தவறாக வகைப்படுத்தலாம். ஆனால் நீண்ட நேரச் சாயத் தொடர்பே நச்சுத்தன்மை கொண்டது; அது உண்மையாகவே சேதமடைந்த நீல செல்களை உருவாக்கி, இறப்பைக் காட்டும் தவறான சாயமேற்றல் முடிவைத் தருகிறது. எனவே, விஸ்கான்சின் ஈஸ்ட் கற்பித்தல் செய்முறையில் ஆவணப்படுத்தப்பட்டுள்ள ஆய்வகக் கற்பித்தல் முறை, 5 நிமிடங்களுக்குள் மதிப்பிட வேண்டும் எனக் குறிப்பிடுகிறது. மெத்திலீன் நீல மதிப்பீடு நேரத்தைச் சார்ந்தது என்பதே எச்சரிக்கையுடன் கூறக்கூடிய முடிவு; ஆகவே ஒரு குறுகிய இடைவெளியை நிர்ணயித்து, ஒரே தொடரிலுள்ள எல்லா மாதிரிகளுக்கும் அதை மாறாமல் பயன்படுத்துங்கள்.

குறைந்த உயிர்வாழ்திறனுள்ள மாதிரிகளில் இரண்டாவது சார்பு உள்ளது. உயிர்வாழ்திறன் சுமார் 80%-க்குக் கீழே இருக்கும்போது, மெத்திலீன் நீலம் உண்மையான உயிர்வாழ்திறனை மிகைப்படுத்தக்கூடும் எனத் தரப்படுத்தப்பட்ட முறை எச்சரிக்கிறது. ஏனெனில், இன்னும் சாயத்தை ஒடுக்கக்கூடிய செல்கள் இனப்பெருக்கத் திறனைத் தக்கவைத்திருக்க வேண்டிய அவசியமில்லை. உயிர்வாழ்திறன் கணிசமாகக் குறைந்திருக்கும்போது இதே நம்பகத்தன்மையின்மையைப் பீர் தயாரிப்பு இலக்கியங்களும் விவரிக்கின்றன. மெத்திலீன் நீலத்தை விரைவான, தோராயமான மதிப்பீடாகக் கருதுங்கள். ஈஸ்ட் வளர்ப்பை மீண்டும் சேர்ப்பது போன்ற, குறைந்த உயிர்வாழ்திறனைச் சார்ந்த முக்கிய முடிவுகளைத் தட்டு எண்ணிக்கைகள் அல்லது துணைச் சாயமேற்றல் மூலம் உறுதிப்படுத்துங்கள்.

மாதிரியின் பிற கூறுகளால் ஏற்படும் விளைவுகள் மூன்றாவது காரணம். OIV முறை சுமார் pH 4.6-இல் செயல்படுகிறது. வலுவான தாங்கல் திறனுள்ள குறைந்த pH மாதிரிகள் சாயம் சரியாகச் செயல்படுவதைத் தடுக்கின்றன என அது எச்சரிக்கிறது. மேலும், சர்க்கரை 100 g/L-க்கு மேல் இருக்கும்போது செல்கள் தவறாக வழிநடத்தும் வெளிர் நீல நிறத்தில் தெரிவதால், அந்நிலையில் இந்தச் சோதனையைத் தவிர்க்குமாறு அறிவுறுத்துகிறது. சாயமேற்றல் pH-ஐ ஒப்பிட்ட ஒரு பரிசோதனையில், சோதிக்கப்பட்ட வரம்பில் உணர்திறன் கணிசமாக மாறியது; இது pH-ஐச் சார்ந்த மெத்திலீன் நீல முறை ஆய்வுடன் ஒத்துப்போகிறது. கழிவுத்துகள்கள் தனியான சிக்கல்: தூய்மையற்ற தானியக் கூழ்களில் சாயமேறிய துகள்கள் இறந்த செல்களைப் போலத் தோன்றி, பரிசோதிப்பவர்களுக்கிடையிலான வேறுபாட்டை அதிகரிக்கின்றன.

இந்த வேறுபாடு வெறும் அனுபவக் கருத்தல்ல; அளவிடப்பட்டுள்ளது. FEMS ஈஸ்ட் ஒப்பீட்டில் தெரிவிக்கப்பட்ட ஆறு மாத பீர் தயாரிப்பு ஆய்வில், இருமுறை செய்யப்பட்ட மெத்திலீன் நீல அளவீடுகளின் சராசரி நியம விலகல் 6.1% ஆக இருந்தது; ஆக்சோனால் ஓட்ட செல்அளவீட்டில் அது 0.2% ஆக இருந்தது. ஒரே மாதிரியில் இரண்டு பரிசோதிப்பவர்களின் முடிவுகள் 13 சதவீதப் புள்ளிகள் வரை வேறுபட்டன. உயிர்வாழ்திறன் முறைகளின் 2023 அளவியல் ஒப்பீடு ஒளிர்வு நுண்ணோக்கியும் ஓட்ட செல்அளவீடும் கணிசமாக அதிகத் துல்லியமுள்ளவை எனக் கண்டறிந்தது; அதே நேரத்தில், செயல்திறன் உயிரின இனத்தையும் மாதிரியின் பிற கூறுகளையும் சார்ந்திருப்பதையும் காட்டியது. பெயிண்டிங் மற்றும் கிர்சாப் (PMID 24430080) வழங்கிய பாரம்பரிய முறை விளக்கம் இன்னும் அடிப்படை மேற்கோளாக உள்ளது. மேலும் விரிவான ஈஸ்ட் உயிர்வாழ்திறன் மற்றும் செயல்வீரியச் சோதனைகள் குறித்த மீளாய்வு (PMID 25154541), மெத்திலீன் நீலத்தை உறுதியான முடிவளிக்கும் சோதனையாக அல்லாமல் துணைச் சோதனையாக வகைப்படுத்துகிறது. இங்கு டிரைப்பான் நீலம் தானாகவே ஒரு மேம்பட்ட மாற்றாகிவிடாது: அது செல் சவ்வின் முழுமை இழப்பைக் காட்டுகிறது; மெத்திலீன் நீலம் சாயத்தை உட்கொள்ளுதலையும் ஒடுக்கும் செயல்பாட்டையும் காட்டுகிறது. எனவே, அழுத்தத்துக்குள்ளான செல்கள் இந்த இரண்டு சாயங்களிலும் வெவ்வேறாக வகைப்படுத்தப்படலாம்.

சுவாசப் பரிசோதனை: நீல நிறம் மறையும் நேரத்தை அளவிடுங்கள்

இரண்டாவது சோதனையில் நுண்ணோக்கி பயன்படுத்தப்படுவதில்லை. ஈஸ்ட், குளுக்கோஸ், நீர்த்த மெத்திலீன் நீலம் ஆகியவை ஒரு மூடிய குழாயில் சேர்க்கப்படுகின்றன; நீல நிறம் மறைய எவ்வளவு நேரமாகிறது என்பது அளவிடப்படுகிறது. செல்கள் வளர்சிதை மாற்றத்தில் ஈடுபடும்போது, நீலச் சாயத்தை அதன் நிறமற்ற வடிவமாக மாற்றக்கூடிய ஒடுக்கச் சமமானிகளை உருவாக்குகின்றன; கரைந்த ஆக்சிஜன் அதை மீண்டும் ஆக்சிஜனேற்றுகிறது. செல்கள் ஆக்சிஜன் அளவைக் குறைத்த பிறகு, நிகர ஒடுக்கம் மேலோங்கி, குழாயின் நிறம் மறைகிறது. எனவே, இறுதிப்புள்ளி சுவாசம், சாயச் செறிவு, ஆக்சிஜன் கிடைக்கும் அளவு ஆகியவற்றின் சமநிலையைப் பிரதிபலிக்கிறது. இதை மெத்திலீன் நீல ஒடுக்க நேரம் அல்லது நிறநீக்க நேரம் என்றே தெரிவிக்க வேண்டும்; மூலக்கூறு ஆக்சிஜன் நுகர்வின் நேரடி வீதமாகக் குறிப்பிடக்கூடாது.

நேர அளவீடு வசதியான வரம்பில் அமைய, உயிர்வாழ்திறன் சோதனையில் பயன்படுத்துவதைவிட மிக அதிகமாக நீர்த்த சாயத்தைப் பயன்படுத்துங்கள். AQA A நிலை கட்டாயச் செய்முறைக் கையேடு இதை நன்கு தரப்படுத்துகிறது: சுமார் 30 C வரை சூடாக்கப்பட்ட 100 mL நீருக்கு 1 g குளுக்கோஸ்; பயன்படுத்துவதற்கு உடனடியாக முன் சேர்க்கப்படும் 5 g உலர்ந்த ஈஸ்ட்; 1% மூலக் கரைசலின் 0.1 mL-ஐ 100 mL வரை நீர்த்துத் தயாரிக்கப்படும் சுமார் 0.001% பயன்பாட்டுச் சாயம். 2 mL ஈஸ்ட்-குளுக்கோஸ் மிதவைக் கலவையை 2 mL பயன்பாட்டுச் சாயத்துடன் கலந்து, சோதனை வெப்பநிலைக்கு நிலைப்படுத்தி, ஒருமுறை 10 வினாடிகள் குலுக்கி, நேரமானியைத் தொடங்குங்கள்; மீண்டும் குலுக்காதீர்கள். குலுக்குவது ஆக்சிஜனை மீண்டும் உள்ளே கொண்டு வந்து குழாயை மீண்டும் நீலமாக்குகிறது; செய்முறையால் ஏற்படும் மிகப்பெரிய செயற்கை விளைவு இதுவே. இந்தத் தயாரிப்பு பொதுவாக 35 C-இல் சுமார் 5 நிமிடங்களுக்குள் நிறமிழக்க வேண்டும் என AQA குறிப்பிடுகிறது. சோதனைச் சராசரிகள் 20 C-இல் 275 s, 35 C-இல் 128 s, 45 C-இல் 145 s ஆக இருந்தன. இவை ஒரு குறிப்பிட்ட அமைப்பிலிருந்து பெறப்பட்ட எடுத்துக்காட்டுகள்; எல்லா சூழல்களுக்கும் பொருந்தும் அளவுகோல்கள் அல்ல. கட்டுப்படுத்தப்பட்ட நிலைகளில் ஒடுக்க வீதத்துக்கும் வளர்சிதை மாற்றத்தில் செயல்படும் ஈஸ்டுக்கும் இடையிலான அளவியல் தொடர்பை, PMID 25773544 எனப் பட்டியலிடப்பட்ட ஆய்வும் ஈஸ்ட் இதழில் வெளியான இயக்கவியல் ஆய்வும் (2014) உள்ளிட்ட தனிப்பட்ட ஒடுக்க ஆய்வுகள் ஆதரிக்கின்றன.

காலப்போக்கு விளக்கக்காட்சி (தனியாக உருவாக்கப்பட்டது)

கீழுள்ள அட்டவணை, மேலே விவரிக்கப்பட்ட AQA பாணி அமைப்பைப் பயன்படுத்தி இக்கட்டுரைக்காகத் தனியாக உருவாக்கப்பட்ட விளக்கக்காட்சியாகும்: 2 mL ஈஸ்ட்-குளுக்கோஸ் கலவையுடன் சுமார் 0.001% செறிவுள்ள 2 mL பயன்பாட்டுச் சாயம்; ஒருமுறை 10 வினாடிகள் குலுக்குதல்; பின்னர் அசைக்காமல் அடைகாத்தல். மாணவர் குழு பதிவு செய்ய வேண்டிய வடிவத்தில் எடுத்துக்காட்டு அளவீடுகள் கொடுக்கப்பட்டுள்ளன. வீதக் குறியீடு என்பது 1-ஐ வினாடிகளில் அளவிடப்பட்ட நிறநீக்க நேரத்தால் வகுத்த மதிப்பாக வரையறுக்கப்படுகிறது. இதே குழாய் அமைப்புகளில் பரிசோதனையைச் செய்து, இந்தப் பதிவுகளுக்குப் பதிலாக அளவிடப்பட்ட மதிப்புகளை இடுங்கள்.

A, B, C குழாய்களின் வீதக் குறியீட்டை வெப்பநிலைக்கு எதிராக வரைபடமிடுங்கள். வளைவு உயர்ந்து, பின்னர் சமமாகவோ தாழ்ந்தோ செல்கிறது. இது நொதிகளால் இயக்கப்படும் வினையில் எதிர்பார்க்கப்படும் அமைப்பு; நேர்கோடு அல்ல. D, E, F குழாய்கள் அந்த வளைவின் தரவுப் புள்ளிகள் அல்ல. வளைவைப் புரிந்துகொள்ள உதவும் கட்டுப்பாடுகள் அவை.

ஒவ்வொரு சோதனைக்கும் பொருள் அளிக்கும் கட்டுப்பாடுகள்

ஒவ்வொரு சுவாசச் சோதனைக்கும் மூன்று துணைக் கட்டுப்பாடுகள் தேவை. கொதிக்கவைத்த அல்லது கொல்லப்பட்ட ஈஸ்ட், குளுக்கோஸ், சாயம் ஆகியவை சேர்ந்த கலவை நீலமாகவே இருக்க வேண்டும்; விரைவான ஒடுக்கம் உயிருள்ள செல்களின் வளர்சிதை மாற்றத்தைச் சார்ந்திருப்பதை இது உறுதிப்படுத்துகிறது. குளுக்கோஸ் சேர்க்காமல் உயிருள்ள ஈஸ்டையும் சாயத்தையும் மட்டும் பயன்படுத்துவது வினைமூலப்பொருள் கட்டுப்பாடாகும். இருந்தாலும், ஈஸ்ட் தனது உள் சேமிப்புகளைப் பயன்படுத்துவதால் மெதுவான நிறநீக்கத்தை எதிர்பார்க்கலாம். ஈஸ்ட் இல்லாமல் குளுக்கோஸும் சாயமும் மட்டும் இருப்பது வேதியியல் வெற்றுக் கட்டுப்பாடு. காரச் சூழலிலுள்ள குளுக்கோஸ், செல்கள் எதுவும் இல்லாமலேயே மெத்திலீன் நீலத்தை ஒடுக்கக்கூடும் என்பதால் இது அவசியம்.

உயிர்வாழ்திறன் எண்ணிக்கைக்கு வேறுவிதமான கட்டுப்பாடு தேவை: செய்முறையின் நிலைத்தன்மை. ஒரே சாய மூலக் கரைசல், ஒரே கலப்பு விகிதம், ஒரே சாயமேற்றல் நேர இடைவெளி, ஒரே எண்ணிக்கை அறைப் பகுதி, ஒரே மொட்டு மற்றும் எல்லை விதிகள் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்த வேண்டும். சாத்தியமானபோது மாதிரியின் விவரங்களை அறியாமல் எண்ண வேண்டும். இரண்டு பரிசோதிப்பவர்களின் முடிவுகள் பத்து புள்ளிகள் வேறுபட்டால், பணித்தாள் பொதுவாகக் காரணத்தை வெளிப்படுத்தும்: வெவ்வேறு நேரங்கள், நீலமாக வகைப்படுத்துவதற்கான வெவ்வேறு நிறத் தீவிர வரம்புகள், அல்லது வெவ்வேறு மொட்டு விதிகள். சாயமேற்றப்பட்ட செல்களைத் தயாரித்துப் பார்வையிடும் நுட்பங்கள் எளிய பாக்டீரியச் சாயமேற்றல் முறைகளுடன் தொடர்புடையவை. பல்வேறு மாதிரிகளில் இந்தச் சாயம் எவற்றைக் குறிக்கிறது என்பதற்கான விரிவான பார்வை நுண்ணோக்கிச் சாயமேற்றல் படத்தொகுப்பில் உள்ளது. எந்த நீல நிறத் தீவிரத்தையும் அளவியல் அடிப்படையில் மதிப்பிடுவதற்கான இயற்பியலைப் புரிந்துகொள்ள, நிலைகள் குறிப்பிடப்பட்ட உறிஞ்சல் மேற்கோள் உதவுகிறது; ஒவ்வொரு குணகத்துடனும் அதன் கரைப்பான், pH, செறிவு நிலைகள் ஏன் குறிப்பிடப்பட வேண்டும் என்பதை அது விளக்குகிறது.

கேள்விக்கேற்ப சோதனையைத் தேர்ந்தெடுங்கள். இப்போது எத்தனை செல்கள் உயிருடன் உள்ளன என்பது எண்ணிக்கையைப் பற்றிய கேள்வி; பணித்தாளுடன் நுண்ணோக்கியில் அதற்குப் பதில் கிடைக்கும். இந்த ஈஸ்ட் வளர்ப்பு எவ்வளவு தீவிரமாகச் சுவாசிக்கிறது என்பது வினைவேகத்தைப் பற்றிய கேள்வி; நிறுத்துக் கடிகாரமும் கட்டுப்படுத்தப்பட்ட குழாய்களும் அதற்குப் பதில் தருகின்றன. மெத்திலீன் நீலம் இரண்டுக்கும் பயன்படுகிறது; ஆனால் ஒரே குழாயில் ஒரே நேரத்தில் இரண்டுக்கும் அல்ல.