G6PD ஆய்வகப் பரிசோதனைகளில் மெத்திலீன் நீலம்: இந்தச் சாயம் உண்மையில் என்ன செய்கிறது

அடைகாப்புக்குப் பிறகு ஒரு மாணவர் இரண்டு சோதனைக் குழாய்களைப் பார்க்கிறார். ஒன்று எதிர்பார்த்த நிறத்திற்கு மாறியுள்ளது. மற்றொன்று மாறவில்லை. இரண்டாவது நோயாளிக்கு குளுக்கோஸ்-6-பாஸ்பேட் டீஹைட்ரஜனேஸ் குறைபாடு இருப்பதாக மாணவர் முடிவு செய்கிறார். அந்த முடிவு சரியாக இருக்கலாம். ஆனால், பரிசோதனை செயல்படுவதற்கு அடிப்படையான கருத்தை அந்தப் பகுத்தறிவு தவறவிடுகிறது. குழாயில் உள்ள எதுவும் நொதியை நேரடியாக அளவிடுவதில்லை. மெத்திலீன் நீலத்தை இடைத்தரகராகப் பயன்படுத்தி, நொதி உற்பத்தி செய்வதையே குழாய் அளவிடுகிறது.

இந்த மறைமுக அணுகுமுறை தெளிவானதும், செயல்முறை, கட்டுப்பாட்டு மாதிரிகள், தவறான முடிவுகளுக்கான நீண்ட பட்டியல் ஆகியவை தன்னிச்சையாக அமைந்தவைபோல் தோன்றாது.

சுருக்கமான பதில்

G6PD பரிசோதனையில் மெத்திலீன் நீலம் ஓர் ஆக்சிஜனேற்ற-ஒடுக்கக் குறிகாட்டி. G6PD நொதி NADPH-ஐ உருவாக்குகிறது. NADPH-ஐச் சார்ந்த அமைப்புகள் நீல நிற மெத்திலீன் நீலத்தை அதன் நிறமற்ற லியூகோ வடிவமாக ஒடுக்குகின்றன; அல்லது எலக்ட்ரான்களைக் கடத்த அதைப் பயன்படுத்துகின்றன. இயல்பான நொதிச் செயல்பாடு திறமையான ஒடுக்கத்தை அளிக்கிறது. குறைவான செயல்பாடு மெதுவான அல்லது முழுமையற்ற ஒடுக்கத்தை அளிக்கிறது. பரிசோதனையின் சமிக்ஞை இதுவே.

வரலாற்றில் பயன்படுத்தப்பட்ட இரண்டு முறைகளும் ஒரே சாயத்தைப் பயன்படுத்துகின்றன. ஆனால் அவற்றின் இறுதிநிலைகள் வேறுபடுகின்றன. அவற்றைத் தனித்தனியாகப் புரிந்துகொண்டால், பெரும்பாலான குழப்பம் நீங்கிவிடும்.

இரண்டு பரிசோதனைகள், ஒரு சாயம், வெவ்வேறு இறுதிநிலைகள்

முதலாவது, நேரடி மெத்திலீன் நீல ஒடுக்கப் பரிசோதனை. இதை சாஸ் மற்றும் சக ஆய்வாளர்கள் விவரித்தனர்; பின்னர் கிப்ஸ் மதிப்பீடு செய்தார். இதில் இறுதிநிலை சாயத்திலேயே காணப்படுகிறது: ஆக்சிஜனேற்றமடைந்த நீல நிற மெத்திலீன் நீலம், நிறமற்ற லியூகோமெத்திலீன் நீலமாக ஒடுக்கப்படுகிறது. அந்த மாற்றத்தின் வேகம் NADPH-ஐ உருவாக்கும் திறனைப் பிரதிபலிக்கிறது. முதற்கட்டப் பரிசோதனை குறித்த முதன்மை ஆய்வுக் கட்டுரை PubMed-இல் சாஸ் மற்றும் சக ஆய்வாளர்கள் (1966) என்ற பதிவின் கீழ் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளது.

இரண்டாவது, ப்ரூவர் மெத்ஹீமோகுளோபின் ஒடுக்கப் பரிசோதனை. முதலில் சோடியம் நைட்ரைட், ஹீமோகுளோபினைப் பழுப்பு நிற மெத்ஹீமோகுளோபினாக ஆக்சிஜனேற்றுகிறது. பின்னர் மெத்திலீன் நீலம் எலக்ட்ரான் பரிமாற்ற இடைத்தரகராகச் செயல்படுகிறது: ஒடுக்கப்பட்ட மெத்திலீன் நீலம் ஒடுக்கத் திறனுடைய எலக்ட்ரான்களை மெத்ஹீமோகுளோபினுக்கு வழங்கி, அதை மீண்டும் சிவப்பு நிற ஹீமோகுளோபினாக மாற்றுகிறது. எனவே, கண்ணுக்குத் தெரியும் இறுதிநிலை பழுப்பு நிறமா அல்லது சிவப்பு நிறமா என்பதுதான்; நீல நிறமா அல்லது நிறமற்றதா என்பதல்ல. அசல் முறை உலக சுகாதார அமைப்பின் செய்தியிதழில் (ப்ரூவர் மற்றும் சக ஆய்வாளர்கள், 1960) வெளியானது.

ப்ரூவர் பரிசோதனையைச் சாயத்தின் நிறநீக்கப் பரிசோதனை என்று அழைப்பது வேதியியல் ரீதியாகத் துல்லியமற்றது. சாயம் சுழற்சியாக மாற்றமடைகிறது; ஹீமோகுளோபின்தான் நிறம் மாறுகிறது. கீழேயுள்ள வரைபடம் இரு பாதைகளையும் காட்டுகிறது.

அடிப்படை வினை

பென்டோஸ் பாஸ்பேட் பாதையின் முதல் ஆக்சிஜனேற்றப் படியை G6PD வினையூக்குகிறது:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

முதிர்ந்த சிவப்பணுக்கள் NADPH-க்காக இந்தப் பாதையைப் பெரிதும் சார்ந்துள்ளன. இது Blood இதழில் லுஸாட்டோ மற்றும் சக ஆய்வாளர்களின் ஆய்வுரையில் (2020) விளக்கப்பட்டுள்ளது. NADPH, குளூட்டதயோனை ஒடுக்கப்பட்ட நிலையில் வைத்திருப்பதுடன், உயிரணுவை ஆக்சிஜனேற்றச் சேதத்திலிருந்து பாதுகாக்கிறது. மெத்திலீன் நீலம் இந்த அமைப்பில் எலக்ட்ரான் ஏற்பியாகப் பங்கேற்கிறது. போதுமான G6PD இருந்தால் போதுமான NADPH கிடைக்கும்; அதனால் திறமையான ஒடுக்கம் நிகழும். குறைவான G6PD இந்தச் சங்கிலியின் முதல் இணைப்பையே முறிக்கிறது.

சாயத்தை இயந்திரமாக அல்லாமல், எரிபொருள் அளவுமானியாக நினைத்துக்கொள்ளுங்கள். அது NADPH கிடைப்பைப் பற்றித் தெரிவிக்கிறது. அந்தக் கிடைப்பையோ அளவீட்டின் வெளிப்பாட்டையோ மாற்றும் வேறு எந்தக் காரணியும், மரபணுவில் மாற்றம் இல்லாமலேயே அளவுமானியின் முள்ளை நகர்த்தலாம்.

ப்ரூவர் வகைச் செயல்முறை எவ்வாறு நடைபெறுகிறது

வினைப்பொருள் தயாரிப்பு முறைகள் பல தசாப்தங்களாக மாறிவந்துள்ளன. எனவே, கற்பித்தலுக்கான விளக்கத்தை மருத்துவப் பரிசோதனை நெறிமுறையாக எடுத்துக்கொள்ளக் கூடாது. ஒவ்வொரு ஆய்வகமும் தனக்கெனச் சரிபார்க்கப்பட்ட நிலையான செயல்பாட்டு நடைமுறையைப் பின்பற்றுகிறது. இந்த எச்சரிக்கையுடன், வழக்கமான சோதனைக் குழாய் அமைப்பு பின்வருமாறு செயல்படுகிறது. மூன்று குழாய்களையும் 3 மணிநேர அடைகாப்பையும் பயன்படுத்தும் வடிவம் இந்த வெளியிடப்பட்ட செயலாக்கத்தில் ஆவணப்படுத்தப்பட்டுள்ளது:

1. நோயாளியின் குழாய்: முழு இரத்தத்துடன் குளுக்கோஸ், சோடியம் நைட்ரைட், மெத்திலீன் நீலம் சேர்க்கப்படும். நைட்ரைட் மெத்ஹீமோகுளோபினை உருவாக்குகிறது; குளுக்கோஸ் சிவப்பணுக்களின் வளர்சிதை மாற்றத்திற்கு ஆதாரமாகிறது; சாயம் NADPH-ஐச் சார்ந்த எலக்ட்ரான் கடத்தலை வழங்குகிறது.
2. ஆக்சிஜனேற்றப்பட்ட கட்டுப்பாட்டு மாதிரி: இரத்தத்துடன் நைட்ரைட் மற்றும் குளுக்கோஸ் சேர்க்கப்படும்; ஆனால் மெத்திலீன் நீலம் சேர்க்கப்படாது. இது குறைபாட்டைக் குறிக்கும் பழுப்பு நிற மெத்ஹீமோகுளோபின் இறுதிநிலையைக் காட்டுகிறது.
3. ஹீமோகுளோபின் கட்டுப்பாட்டு மாதிரி: இரத்தத்துடன் நீர் சேர்க்கப்படும். இது இயல்பான நிலையைச் சுட்டும் சிவப்பு நிற ஹீமோகுளோபின் இறுதிநிலையைக் காட்டுகிறது.
4. எல்லாக் குழாய்களையும் 37 C-க்கு அருகிலான வெப்பநிலையில், பொதுவாக 3 மணிநேரம், மெதுவாகக் கலந்தபடி அடைகாப்பில் வைக்கவும்.
5. உயிரணுக்களைச் சிதைத்து, நிறங்களை ஒப்பிட்டுப் பார்க்க ஏதுவாக, ஒவ்வொரு குழாயிலிருந்தும் சிறிய அளவு மாதிரியை எடுத்து வடிகட்டிய நீரில் நீர்த்துப்போகச் செய்யவும்.
6. நோயாளியின் குழாயை இரண்டு கட்டுப்பாட்டு மாதிரிகளுடனும் ஒப்பிடவும். சிவப்பு நிறத்தை நோக்கி மாறுவது கணிசமான ஒடுக்கத் திறனைக் குறிக்கிறது. பழுப்பு நிறமாகவே இருப்பது குறிப்பிடத்தக்க குறைபாட்டைச் சுட்டுகிறது.

வரலாற்றில் பயன்படுத்தப்பட்ட ஒரு தயாரிப்பு முறையில் சுமார் 1 mL இரத்தத்துடன், ஏறத்தாழ 180 mM சோடியம் நைட்ரைட், 280 mM டெக்ஸ்ட்ரோஸ், 0.4 mM மெத்திலீன் நீலம் கொண்ட வினைப்பொருள்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன. இந்த எண்களை ஆய்வு இலக்கியத்திலிருந்து எடுக்கப்பட்ட ஓர் எடுத்துக்காட்டாகக் கருதுங்கள்; எல்லா இடங்களுக்கும் பொருந்தும் விவரக்குறிப்பாக அல்ல.

முடிவைப் புரிந்துகொள்வது

பண்புரீதியான முதற்கட்டப் பரிசோதனை, இயல்பான செயல்பாட்டின் 30 முதல் 40 சதவீதத்தைச் சுற்றியுள்ள நிலையில் மிகச் சிறப்பாக வேறுபடுத்திக் காட்டுகிறது. இது G6PD கண்டறிதலில் உள்ள இடைவெளிகள் குறித்த இந்த Malaria Journal ஆய்வுரையில் விவாதிக்கப்பட்டுள்ளது. எனவே, இயல்பான முதற்கட்டப் பரிசோதனை முடிவு என்பது கடுமையான குறைபாட்டை அந்தப் பரிசோதனை கண்டறியவில்லை என்பதையே குறிக்கிறது. செயல்பாடு முற்றிலும் இயல்பாக உள்ளது என்று அது உறுதியளிப்பதில்லை.

முதற்கட்டப் பரிசோதனை ஏன் தவறாக வழிநடத்துகிறது

இரத்தச் சிவப்பணுச் சிதைவுக்குப் பிறகு ரெட்டிகுலோசைட்டுகள் அதிகரிப்பது தவறான இயல்புநிலை முடிவுக்கான வழக்கமான காரணமாகும். இளம் சிவப்பணுக்களிலும் ரெட்டிகுலோசைட்டுகளிலும் பழைய உயிரணுக்களைவிட அதிக G6PD உள்ளது. திடீரென ஏற்படும் சிவப்பணுச் சிதைவு நிகழ்வின்போது, மிகப் பழைய, அதிகக் குறைபாடுள்ள உயிரணுக்கள் ஏற்கெனவே அழிந்திருக்கலாம். இதனால், பரிசோதனையில் இயல்பான செயல்பாட்டைக் காட்டும் இளம் உயிரணுக்களே எஞ்சியிருக்கலாம். இதே உயிரியல் நிகழ்வு சாயம் சார்ந்த முதற்கட்டப் பரிசோதனைகளை மட்டுமல்லாமல், அளவுரீதியான பரிசோதனைகளையும் தவறாக வழிநடத்துகிறது.

அண்மையில் செய்யப்பட்ட இரத்தமேற்றல் குறைபாட்டை மறைக்கிறது. ஏனெனில், கொடையாளரின் சிவப்பணுக்கள் அவற்றின் சொந்த நொதியை மாதிரியில் சேர்க்கின்றன. நம்பகமற்ற நொதி முடிவுகளுக்கான காரணங்களில், ரெட்டிகுலோசைட்டுகள் அதிகரிப்பு மற்றும் வெள்ளையணுக்களின் குறுக்கீடு ஆகியவற்றுடன் இரத்தமேற்றலையும் Mayo Clinic Laboratories பட்டியலிடுகிறது.

வேறுபட்ட இரு மரபணு மாற்றுருக்களைக் கொண்ட பெண்கள் மிகவும் சிக்கலான பிரிவினர். சீரற்ற X-குரோமோசோம் செயலிழப்பு, இயல்பான மற்றும் குறைபாடுள்ள சிவப்பணுக்கள் கலந்த ஒரு தொகுப்பை உருவாக்குகிறது. அதன் மொத்தச் செயல்பாடு கடுமையான குறைபாட்டிலிருந்து வெளிப்படையாக இயல்பாகத் தோன்றும் நிலை வரை எங்கும் அமையலாம். பண்புரீதியான முதற்கட்டப் பரிசோதனைகள் இடைநிலை வெளிப்பண்புகளை அடிக்கடி தவறவிடுகின்றன. G6PD பரிசோதனை குறித்த WHO ஆவணம் இந்த வரம்பை விரிவாக விவாதிக்கிறது.

மாதிரி எடுக்கப்பட்டதிலிருந்து கடந்த நேரம், சேமிப்பு வெப்பநிலை, கண்ணால் இறுதிநிலையை மதிப்பிடுவதில் உள்ள தனிநபர் சார்பு, ஹீமட்டோக்ரிட், வினைப்பொருள்களின் தரம் ஆகியவை இந்த உயிரியல் விளைவுகளுடன் கூடுதலாகப் பகுப்பாய்வு மாறுபாடுகளைச் சேர்க்கின்றன.

முதற்கட்டப் பரிசோதனை நோயறிதல் அல்ல

குறைபாட்டைக் காட்டும், இடைநிலையைக் காட்டும் அல்லது மருத்துவ நிலைக்கு ஒத்துப்போகாத முதற்கட்டப் பரிசோதனை முடிவுக்கு அளவுரீதியான G6PD நொதிப் பரிசோதனை தேவை. வெப்பநிலை கட்டுப்படுத்தப்பட்ட அளவுரீதியான நிறமாலை ஒளியளவீட்டை WHO ஒப்பீட்டு ஆதார முறையாகக் கருதுகிறது. அந்தப் பரிசோதனையில், சிவப்பணுக்கள் சிதைக்கப்பட்ட மாதிரியில் குளுக்கோஸ்-6-பாஸ்பேட் மற்றும் NADP+ சேர்க்கப்படுகின்றன. உருவாகும் NADPH, 340 nm-இல் அதிகரிக்கும் ஒளி உறிஞ்சுதிறன் மூலம் கண்காணிக்கப்படுகிறது. மாற்றத்தின் வேகம் நொதிச் செயல்பாட்டுக்கு நேர்விகிதத்தில் இருக்கும். பொதுவாக, இது ஒரு கிராம் ஹீமோகுளோபினுக்கான அலகுகளாகச் சீராக்கப்படுகிறது. தற்போதைய மருத்துவ ஆய்வக நடைமுறை G6PD செயல்பாட்டுக்கான Mayo பரிசோதனைப் பட்டியல் பதிவில் சுருக்கமாகத் தரப்பட்டுள்ளது.

முடிவுகளைப் புரிந்துகொள்ள, ஆய்வகம் சரிபார்த்த ஒப்பீட்டு வரம்பு பயன்படுத்தப்படுகிறது. இது பெரும்பாலும் மக்கள்தொகையின் இயல்பான செயல்பாட்டுடன் ஒப்பிட்டு வரையறுக்கப்படுகிறது. குறைபாடு பொதுவாக 30 சதவீத வரம்பைச் சுற்றியும், இடைநிலைச் செயல்பாடு அதற்கு மேலாகவும் விவாதிக்கப்படுகிறது. G6PD பரிசோதனைகளுக்கான WHO இலக்கு தயாரிப்பு விவரங்கள் (2022) அந்த நோயறிதல் கட்டமைப்பை விளக்குகின்றன. அண்மைய சிவப்பணுச் சிதைவோ இரத்தமேற்றலோ வெளிப்பண்பு மதிப்பீட்டை நம்பகமற்றதாக்கினால், சிவப்பணுத் தொகுப்பு மீண்டும் சமநிலையை அடைந்த பிறகு பரிசோதனையை மீண்டும் செய்ய வேண்டும். மூலக்கூறு பரிசோதனை கூடுதல் தகவலை வழங்கலாம்; ஆனால் அது நொதி அளவீட்டுக்கு மாற்றாகாது.

பேண வேண்டிய ஒரு எல்லை

இந்தப் பரிசோதனைகளில் மெத்திலீன் நீலம் உடலுக்கு வெளியே பயன்படுத்தப்படும் ஆய்வக வினைப்பொருள் ஆகும். நோயாளிக்கு மெத்திலீன் நீலத்தை வழங்குவதன் பாதுகாப்பு குறித்த விவாதத்திலிருந்து இது வேறுபட்டது. அந்தப் பாதுகாப்பு விவாதம் மெத்திலீன் நீலத்தைப் பயன்படுத்தக் கூடாத நிலைகள் குறித்த வழிகாட்டுதலில் இடம்பெறுகிறது. மருந்தும் NADPH-ஐச் சார்ந்த ஒடுக்கத்தை நம்பியிருப்பதால், உயிர்வேதியியல் இவ்விரண்டையும் இணைக்கிறது. ஆனால், சோதனைக் குழாயில் உள்ள சாயம் என்பது இரத்த ஓட்டத்தில் வழங்கப்படும் மருந்தளவு அல்ல. வேறொரு சூழலில் நிறமூட்டும் சாயமாக அது எவ்வாறு செயல்படுகிறது என்பதைப் புரிந்துகொள்ள, மெத்திலீன் நீல நிறமூட்டல் கொள்கைகளைப் பார்க்கவும். அது சார்ந்த வேதியியல் குடும்பத்தைப் பற்றி அறிய, ஆய்வகத்தில் பயன்படுத்தப்படும் ஆக்சிஜனேற்ற-ஒடுக்கச் சாயங்களைப் பார்க்கவும்.

ஒடுக்கத் திறன் பாதிக்கப்படாமல் இருப்பதாகத் தோன்றுகிறதா என்பதே முதற்கட்டப் பரிசோதனையின் கேள்வி. உண்மையில் எவ்வளவு நொதி உள்ளது என்பதே உறுதிப்படுத்தும் பரிசோதனையின் கேள்வி. இரண்டாவது கேள்விக்குப் பதிலளிக்குமாறு அதைக் கேட்காதவரை, சாயம் முதல் கேள்விக்கு நன்றாகப் பயன்படுகிறது.