DNA மற்றும் RNA நிறமூட்டலுக்கான மெத்திலீன் நீலம்: ஜெல் மற்றும் மென்படலப் பயன்பாடுகள்

ஒரு மாணவர் அகரோஸ் ஜெல்லில் மின்பிரிப்பை நடத்தி, மெத்திலீன் நீலத்தால் நிறமூட்டுகிறார். தெளிவான பட்டை எதிர்பார்க்கப்பட்ட இடத்தில் எதுவும் தெரியவில்லை. அடுத்த ஆய்விடத்தில், முனைவர் பட்டத்துக்குப் பிந்தைய ஆராய்ச்சியாளர் ஒருவர் அதே நீல நிறமூட்டியைப் பயன்படுத்தி நார்தர்ன் மென்படலத்திற்கு நிறமூட்டுகிறார்; மூன்று நிமிடங்களில் தெளிவான ரைபோசோமல் பட்டைகள் கிடைக்கின்றன. ஜெல் செயல்முறை தோல்வியடைந்துவிட்டதாக மாணவர் முடிவு செய்கிறார். ஜெல் செயல்முறை தோல்வியடையவில்லை. இந்த இரண்டு பணிகளும் வேறுபட்டவை. அதே நிறமூட்டி அவற்றுக்குத் தரும் பதில்களில் உணர்திறனும் பின்னணியும் வேறுபடுகின்றன; அடுத்து என்ன செய்யலாம் என்பதற்கான விதிகளும் வேறுபடுகின்றன.

மெத்திலீன் நீல DNA நிறமூட்டலும் மெத்திலீன் நீல RNA நிறமூட்டலும் ஒரே வேதியியலைப் பகிர்ந்துகொள்கின்றன; ஆனால் அவற்றின் நோக்கம் ஒன்றல்ல. ஜெல்லில், நுண்துளைகள் கொண்ட கட்டமைப்புக்குள் எவ்வளவு நியூக்ளிக் அமிலம் இருக்கிறது என்பதை நிறமூட்டி காட்டுகிறது. மென்படலத்தில், மாற்றம் சரியாக நடந்ததா, பாதைகளில் சம அளவு மாதிரிகள் ஏற்றப்பட்டனவா என்பதைக் காட்டுகிறது. இந்த வேறுபாடு தெளிவானதும், செய்முறைகள், கண்டறிதல் வரம்புகள், இணக்கத்தன்மை வரம்புகள் ஆகியவற்றைப் புரிந்துகொள்ள முடியும்.

சுருக்கமான பதில்

மெத்திலீன் நீலம் என்பது தட்டையான அமைப்புடைய நேர்மின் அயனி நிறமூட்டி. பாஸ்பேட்டுடன் மின்னியல் ஈர்ப்பு, கார இணைகளுக்கு இடையில் இடைச்செருகல், சிறிய பள்ளத்துடன் இணைதல் ஆகியவற்றின் கலவையால், இது நியூக்ளிக் அமிலங்களுடன் சகப்பிணைப்பின்றி, மீளக்கூடிய வகையில் பிணைகிறது. அந்த மீளக்கூடிய தன்மையே முக்கியமானது. பட்டைகளுக்கு நிறமூட்டி, காணக்கூடிய ஒளியில் அவற்றைப் பதிவுசெய்து, பின்னர் நிறத்தை நீக்கலாம் அல்லது குளோனிங், கலப்பிணைவு, மீண்டும் ஆய்வுக்கூறு பயன்படுத்துதல் ஆகியவற்றுக்காகச் சுத்திகரிக்கலாம்.

இரட்டை இழை DNA-வுக்கான மெத்திலீன் நீல அகரோஸ் ஜெல் நிறமூட்டலில், வழக்கமான விரைவுச் செய்முறை நீரில் 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) ஆகும். சுமார் 15 நிமிடங்கள் நிறமூட்டிய பின், சுமார் 15 நிமிடங்கள் நீரில் நிறநீக்கம் செய்து, வெள்ளை ஒளிப் பெட்டியில் பார்க்க வேண்டும். மென்படலங்களுக்கு, பாரம்பரிய நார்தர்ன் ப்ளாட் செய்முறை pH 5.2-க்கு அருகிலுள்ள சோடியம் அசிட்டேட்டில் 0.02 முதல் 0.04 percent நிறமூட்டியாகும். மாதிரியை மாற்றி நிலைநிறுத்திய பின் சில நிமிடங்கள் நிறமூட்டி, நீரில் அலசி, கலப்பிணைவுக்கு முன் நிறத்தை முழுமையாக நீக்க வேண்டும். உணர்திறன் மிதமானதே: நல்ல சூழ்நிலைகளில் ஒரு ஜெல் பட்டைக்கு பத்துகள் முதல் நூறுகள் வரையிலான நானோகிராம்கள் தேவைப்படுகின்றன; எச்சரிக்கையான வழிகாட்டிகள் 0.5 முதல் 1 microgram எனக் குறிப்பிடுகின்றன. இது எத்திடியம் புரோமைடு மற்றும் SYBR நிறமூட்டிகளின் கண்டறிதல் வரம்பைவிட பல மடங்குகளின் படிநிலைகள் அதிகம். மென்படலங்களில், தனிப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்டுக்குப் பயனுள்ள ஒரே கண்டறிதல் வரம்பு இல்லை. ஏனெனில் இந்த நிறமூட்டி முக்கியமாக அதிக அளவில் உள்ள ரைபோசோமல் RNA-வையும் ஏற்றப்பட்ட மொத்தப் பொருளையும் காட்டுகிறது. சில்லறை விற்பனையில் கிடைக்கும் துணை உணவுப் பொருள் கரைசலை இந்த இரு செய்முறைகளிலும் மாற்றாகப் பயன்படுத்த வேண்டாம். சரிபார்க்கப்பட்ட முறைகள், பகுப்பாய்வுத் தர நிறமூட்டி, வரையறுக்கப்பட்ட தாங்கல் கரைசல்கள், RNA பயன்படுத்தப்படும் இடங்களில் RNase இல்லாத கையாளுதல் ஆகியவற்றை அடிப்படையாகக் கொண்டவை.

பிணைப்பு எவ்வாறு செயல்படுகிறது, எங்கு தவறாக வழிநடத்துகிறது

பயனுள்ள விளக்க மாதிரியில் மூன்று பகுதிகள் உள்ளன. முதலில், நேர்மின்னூட்டம் கொண்ட வளைய அமைப்பு, எதிர்மின்னூட்டம் கொண்ட பாஸ்பேட் முதுகெலும்பால் ஈர்க்கப்படுகிறது. குறைந்த உப்புச் செறிவில் இந்த மின்னியல் கூறு மேலோங்குவதாக நிறமாலையியல் ஆய்வுகள் காட்டுகின்றன. அதே நேரத்தில், இரட்டை இழை DNA-வில் இடைச்செருகலும் சிறிய பள்ளப் பிணைப்பும் நிலையான பிணைப்பு முறைகளாக இருப்பதை மாதிரியாக்கமும் மூலக்கூறு இயக்கவியலும் காட்டுகின்றன. இது மெத்திலீன் நீலத்தின் DNA பிணைப்பு குறித்த நிறமாலையியல் ஆய்வில் சுருக்கமாக விளக்கப்பட்டுள்ளது. இரண்டாவதாக, GC-க்கு ஓரளவு முன்னுரிமை உள்ளது. மாதிரியாக்கம் CpG மற்றும் GpC படிநிலைகளுக்கு முன்னுரிமை காட்டுகிறது; மெத்திலீன் நீல இடைச்செருகல் முன்னுரிமைகள் குறித்த ஆய்வுகளில், GC அதிகமுள்ள இரட்டை இழை அமைப்புகளுடன் முன்னுரிமையாக இணைவதைச் சோதனைகள் தெரிவிக்கின்றன. இருப்பினும், AT இரட்டை இழை அமைப்புகளும் பிணைகின்றன. வழக்கமான நிறமூட்டல் வரிசை-குறிப்பிட்டதல்ல. மூன்றாவதாக, ஒற்றை இழை DNA மற்றும் RNA, முக்கியமாக மின்னியல் ஈர்ப்பாலும் அணுகக்கூடிய காரங்கள் மற்றும் இரட்டை இழைப் பகுதிகளுடன் அடுக்கிணைவதாலும் பிணைகின்றன. இதனால்தான் நிறமூட்டலின் வலிமை நீளம், வரிசை, இரண்டாம் நிலைக் கட்டமைப்பு ஆகியவற்றைப் பொறுத்து மாறுகிறது.

இதிலிருந்து இரண்டு விளைவுகள் ஏற்படுகின்றன. பிணைப்பு சகப்பிணைப்பற்றது என்பதால், கழுவும்போது நிறமூட்டி வெளியேறுகிறது. திட்டமிட்டு நிலைநிறுத்தாவிட்டால் பாலிஅக்ரிலமைடு பட்டைகள் விரைவாக மங்கிவிடும். வழக்கமான நிறமூட்டல் தற்காலிகமானது என்பதாலேயே, அதற்கென ஒரு நிரந்தர நிலைநிறுத்தல் மாற்றுமுறை உள்ளது. இதை PAGE ஜெல்களுக்காக Soto மற்றும் Draper விவரித்துள்ளனர். இந்த நிறமூட்டி ஒளி உணர்வூட்டி என்பதால், ஆக்சிஜன் இருக்கும்போது நிறமூட்டப்பட்ட DNA மீது நீண்ட நேரம் பிரகாசமான ஒளி படுவது குவானினை ஆக்சிஜனேற்றி, இறுதியில் இழைகளில் சிறு வெட்டுகளை ஏற்படுத்தக்கூடும். இந்தச் செயல்முறை மெத்திலீன் நீலத்தால் ஒளி உணர்வூட்டப்பட்ட குவானின் ஆக்சிஜனேற்றம் குறித்த ஆய்வில் விரிவாக விளக்கப்பட்டுள்ளது. குறுகிய நேரம் வெள்ளை ஒளியில் பார்ப்பது, பாரம்பரிய எத்திடியம் புரோமைடு செய்முறைகளின் நன்கறியப்பட்ட UV சேதத்தைத் தவிர்க்கிறது. தயாரிப்புக்கான மீட்பில் இந்த நன்மை உண்மையானது. காணக்கூடிய ஒளி மென்மையானது; தீங்கற்றதல்ல. DNA-வை குளோனிங் செய்யவிருந்தால் ஒளியூட்டும் நேரத்தைக் குறைவாக வைத்திருக்கவும். இந்த எச்சரிக்கைக்குப் பின்னுள்ள விரிவான ஒளிவேதியியலுக்கு, மெத்திலீன் நீல ஒளிவேதியியலின் இரண்டு பாதைகளை பார்க்கவும். ஆக்சிஜனேற்றப்பட்ட வடிவம் ஏன் பிணைகிறது, ஒடுக்கப்பட்ட வடிவம் ஏன் பிணைவதில்லை என்பதை விளக்கும் ஆக்சிஜனேற்ற–ஒடுக்க இணை மற்றும் மின்னூட்ட நிலைகளுக்கு, மெத்திலீன் நீலத்தின் கட்டமைப்பு மற்றும் பண்புகளின் வேதியியலை பார்க்கவும்.

பணி ஒன்று: ஜெல்களுக்குள் நிறமூட்டுதல்

ஜெல் நிறமூட்டல் ஒரு கேள்விக்குப் பதிலளிக்கிறது: இந்தப் பட்டையில் கண்ணால் காண்பதற்குப் போதுமான நியூக்ளிக் அமிலம் உள்ளதா? அகரோஸில் உள்ள இரட்டை இழை DNA இதற்கான மிக நன்றாக ஆய்வு செய்யப்பட்ட நிலையாகும். Flores மற்றும் சக ஆய்வாளர்களின் தொடக்ககால மெத்திலீன் நீல ஜெல் முறை, 1 percent அகரோஸில் 0.02 percent விரைவுச் செய்முறையைச் சரிபார்த்து, அதன் பின்னர் வெற்றிகரமான மீட்பும் குளோனிங்கும் சாத்தியம் என்பதை நிரூபித்தது. இதே வழங்குநர் செய்முறை IBI Scientific மெத்திலீன் நீலத் தயாரிப்புப் பக்கத்திலும் உள்ளது. அதில் 0.04 percent மென்படலச் செய்முறையும் விரைவு ஜெல் மாற்றுமுறையும் அருகருகே பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன.

நடைமுறைச் செயல்முறை:

1. ஜெல்லில் வழக்கம்போல் மின்பிரிப்பை நடத்தவும். மாற்றியமைக்கப்பட்ட முறைக்கான மாதிரி மாற்றம் அல்லது பிரிப்புத் திறன் சரிபார்க்கப்பட்டிருந்தால் தவிர, மின்பிரிப்பின்போது அல்லாமல் அதன் பிறகு நிறமூட்டவும்.
2. காய்ச்சி வடித்த நீரில் உள்ள 0.02 percent w/v மெத்திலீன் நீலத்தில் மூழ்கவைத்து, மெதுவாக அசைத்தபடி சுமார் 15 நிமிடங்கள் வைத்திருக்கவும்.
3. நீரைப் பலமுறை மாற்றி, மொத்தம் சுமார் 15 நிமிடங்கள் நிறநீக்கம் செய்யவும். ஜெல் கட்டமைப்பின் பின்னணி நிறம் குறைந்து பட்டைகள் தெளிவாகத் தெரியும் வரை தொடரவும்.
4. வெள்ளை ஒளியூட்டியில் உடனடியாகப் புகைப்படம் எடுக்கவும்.

அகரோஸும் பாலிஅக்ரிலமைடும் வெவ்வேறாகச் செயல்படுகின்றன. அகரோஸ் தனது கட்டமைப்பில் நிறமூட்டியைத் தக்கவைத்துக்கொள்வதால், நிறநீக்கமே மெதுவான படியாகும். மெல்லிய பாலிஅக்ரிலமைடு ஜெல்கள் விரைவாக நிறமூட்டப்படுகின்றன; ஆனால் நிறமூட்டியை விரைவாக இழக்கவும் செய்கின்றன. இது தயாரிப்புக்காகப் பட்டைகளை வெட்டியெடுக்க உதவுகிறது; ஆனால் நீண்டகாலப் பதிவுகளைப் பாதிக்கிறது. நிறுவப்பட்ட Current Protocols பாணி PAGE முறைகளைப் பின்பற்றி, பாலிஅக்ரிலமைடில் உள்ள செயற்கை ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகளை அதே 0.02 percent செய்முறையில், மீண்டும் மீண்டும் நீரில் கழுவுவதன் மூலம் 20 முதல் 30 நிமிடங்களில் கண்டறியலாம். தயாரிப்புக்கான ஒலிகோக்களுக்கு, நீர்த்த TBE-யில் சுமார் 0.0002 percent அளவிலான மிகவும் நீர்த்த மாற்றுமுறைகள் பல மணிநேரங்களுக்கு பயன்படுத்தப்பட்டதாக அறிக்கைகள் உள்ளன; ஆனால் அவற்றுக்கான ஆதார அடித்தளம் வலுவற்றது.

DNA-வா RNA-வா என்பது முக்கியமானது. இரட்டை இழை DNA மிக வலுவான கட்டமைப்பு சார்ந்த பிணைப்பைத் தருகிறது. RNA மற்றும் ஒற்றை இழை DNA-வுக்கும் நிறமூட்டலாம்; ஆனால் அது பலவீனமாகவும் குறைவாகக் கணிக்கக்கூடியதாகவும் இருக்கும். ஃபார்மால்டிஹைடு அகரோஸ் RNA ஜெல்களில், பெரும்பாலான ஆய்வகங்கள் ஜெல்லுக்குள் நீல நிறமூட்டலைத் தவிர்த்து, முதலில் RNA-வை மென்படலத்துக்கு மாற்றி, அங்கு நிறமூட்டுகின்றன. இந்த மாற்றம், பலவீனமான ஜெல் சமிக்ஞைக்குப் பதிலாகத் தெளிவான மென்படலச் சமிக்ஞையையும் மாதிரி ஏற்றத்தின் பதிவையும் வழங்குகிறது.

பணி இரண்டு: மென்படலங்களில் நிறமூட்டுதல்

மென்படல நிறமூட்டல் வேறொரு கேள்விக்குப் பதிலளிக்கிறது: மாற்றம் சரியாக நடந்ததா, பாதைகளை ஒப்பிட முடியுமா? இதன் பாரம்பரியப் பயன்பாடு Herrin மற்றும் Schmidt உருவாக்கிய மீளக்கூடிய நார்தர்ன் ப்ளாட் நிறமூட்டல் ஆகும். தொடக்கச் செய்முறையில் pH 5.0-இல் 50 mM சோடியம் அசிட்டேட்டில் 0.04 percent நிறமூட்டியைப் பயன்படுத்தி 2 முதல் 3 நிமிடங்கள் நிறமூட்டி, நீரில் அலசினர். கலப்பிணைவுக்கு முன் SSPE-யில் உள்ள நீர்த்த SDS மூலம் இதை நீக்க முடியும்.

பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படும் நவீன மாற்றுமுறை பின்வருமாறு:

1. RNA அல்லது இயல்பிழக்கச் செய்யப்பட்ட DNA-வை நைலான் அல்லது நைட்ரோசெல்லுலோஸுக்கு மாற்றி, பின்னர் UV குறுக்குப்பிணைப்பு அல்லது வெப்பமூட்டல் மூலம் நிலைநிறுத்தவும். இதனால் நிறமூட்டலின்போது மாதிரி இழக்கப்படாது.
2. விருப்பமானது, ஆனால் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படுவது: மென்படலத்தை 5 percent அசிட்டிக் அமிலத்தில் சுமார் 15 நிமிடங்கள் நனைக்கவும்.
3. pH 5.2-க்கு அருகிலுள்ள 0.3 முதல் 0.5 M சோடியம் அசிட்டேட்டில் 0.02 முதல் 0.04 percent மெத்திலீன் நீலத்தைப் பயன்படுத்தி 5 முதல் 10 நிமிடங்கள் நிறமூட்டவும்.
4. நீரில் அலசி 5 முதல் 15 நிமிடங்கள் நிறநீக்கம் செய்து, பதிவுசெய்யவும். பின்னர் கலப்பிணைவுக்கு முன் எஞ்சிய நிறமூட்டியை நீக்கவும்.

நார்தர்ன் பணிகளில் நேர்மின்னூட்டம் கொண்ட நைலான் அதிகம் பயன்படுத்தப்படுகிறது. அதே அசிட்டிக் அமிலம் மற்றும் அசிட்டேட் செய்முறையுடன் நைட்ரோசெல்லுலோஸும் செயல்படுகிறது. மாற்றத்தை உறுதிப்படுத்தவும், 28S மற்றும் 18S பட்டைகளை ஒப்பிடவும் (பாக்டீரியா RNA-வுக்கு 23S மற்றும் 16S), அளவுக்குறித் தொகுப்புகளையும் தரநிலைகளையும் குறிக்கவும், மொத்த RNA அளவைத் தோராயமாக இயல்பாக்கிய பதிவை வைத்திருக்கவும் இந்தப் படம் பயன்படுத்தப்படுகிறது. வெளியிடப்பட்ட நார்தர்ன் முறைகள், ஏற்றப்பட்ட அளவைச் சரிபார்க்க நிறமூட்டப்பட்ட ரைபோசோமல் பட்டைகளை அளவிடுகின்றன. இதில் இயல்பாக்கத்திற்காக மெத்திலீன் நீல ரைபோசோமல் பட்டைகளைப் பயன்படுத்திய பால்வள அறிவியல் ஆய்வும் அடங்கும். சதர்ன் மென்படலங்களையும் இதேபோல் காண்பிக்கலாம். ஆனால் இந்த நிறமூட்டி நார்தர்ன் மாதிரி ஏற்றம் மற்றும் மாற்றத்தைச் சரிபார்ப்பதற்கே மிகவும் நிலைபெற்றுள்ளது. மேலும், சதர்ன் DNA மாற்றத்துக்கு முன் இயல்பிழக்கச் செய்யப்படுவதால், ஜெல்லுக்கான உணர்திறன் மதிப்புகளை அதற்குப் பயன்படுத்த முடியாது.

கண்டறிதல் வரம்புகளும் பின்னணியும்: நீல நிறமூட்டி பின்தங்கும் இடங்கள்

கீழுள்ள ஒப்பீடு திட்டமிட்டே தோராயமாக வழங்கப்பட்டுள்ளது. நிறமூட்டியின் செயல்திறன் ஜெல் சதவீதம், பட்டையின் அகலம், ஒளியியல் அமைப்பு, முறையான நிறநீக்கம் ஆகியவற்றைப் பொறுத்தது. ஒவ்வொரு எண்ணையும் துல்லியமான விவரக்குறிப்பாக அல்லாமல், அளவின் படிநிலையைக் காட்டுவதாகக் கருதவும்.

மிதமான சமிக்ஞை பயன்படுத்தத்தக்கதா என்பதைப் பின்னணிக் கட்டுப்பாடே தீர்மானிக்கிறது. பிணைக்கப்படாத நிறமூட்டி மிகவும் அடர்ந்த நிறம் கொண்டது. எனவே, பிணைந்த நிறமூட்டியை அகற்றாமல் பிணைக்கப்படாத நிறமூட்டியை நீக்குவதிலிருந்தே தெளிவான வேறுபாடு கிடைக்கிறது. அதிகச் செறிவுள்ள நிறமூட்டி உணர்திறனை அரிதாகவே அதிகரிக்கிறது. அது முக்கியமாக நிறநீக்க நேரத்தை அதிகரிக்கிறது. பயன்படுத்தவிருக்கும் அதே ஜெல், மென்படலம், கேமராவில் படிப்படியாக நீர்த்த மாதிரித் தொடரைச் சோதித்து, ஒருங்கிணைந்த அடர்த்தி ஏற்றப்பட்ட அளவுக்கு நேர்விகிதத்தில் இருக்கும் வரம்பை மட்டும் பயன்படுத்தவும். மெத்திலீன் நீலம் அரை-அளவியல் மாதிரி ஏற்ற இயல்பாக்கத்தை ஆதரிக்கிறது. இது பரந்த அளவீட்டு வரம்புள்ள அளவியல் சோதனை அல்ல. ஏனெனில் மென்படலக் கொள்ளளவு, மாற்றத் திறன், நிறைவு நிலை, நிறநீக்கம் ஆகியவை ஒவ்வொரு பாதையிலும் மாறுபடுகின்றன.

இணக்கத்தன்மை வரம்புகள்: நிறமூட்டலுக்குப் பிறகு எவை செயல்படுகின்றன

நீல நிறமூட்டலுக்குப் பிறகு குளோனிங் செய்ய முடியும் என்பது நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது. Flores மற்றும் சக ஆய்வாளர்கள் நிறமூட்டப்பட்ட அகரோஸ் பட்டைகளை வெட்டியெடுத்து, DNA-வை மீட்டு, இணைத்து, செல்களுக்குள் செலுத்தினர். UV-யுடன் எத்திடியம் புரோமைடு பயன்படுத்தியதைவிடச் சிறந்த குளோனிங் கிடைத்ததாக அவர்கள் தெரிவித்தனர். இதற்கான சாத்தியமான காரணம் குறைந்த ஒளிச்சேதமே தவிர, நிறமூட்டியால் நேரடியாகக் கிடைக்கும் நன்மை அல்ல. வெள்ளை ஒளி படும் நேரத்தைக் குறைவாக வைத்திருந்து, மீட்கப்பட்ட DNA-வை வழக்கமான ஜெல் பிரித்தெடுப்புச் சுத்திகரிப்புக்கு உட்படுத்தவும்.

PCR மற்றும் வரிசையாக்கத்துக்கான ஆதாரங்கள் குறைவானவை. எஞ்சிய நிறமூட்டி நியூக்ளிக் அமிலங்களுடன் பிணைவதால், நொதி சார்ந்த படிகளுக்கு முன் நிறநீக்கம் செய்து சுத்திகரிக்கவும். நீல நிறமூட்டப்பட்ட ஜெல்லிலிருந்து முறையாகத் தூய்மைப்படுத்தப்பட்ட DNA செயல்படும் என எதிர்பார்க்கப்படுகிறது. ஆனால் பல்வேறு பாலிமரேஸ்கள் மற்றும் வரிசையாக்க வேதியியல் முறைகளில், நேரடியாக எடுத்துச் செல்லப்படும் நிறமூட்டியின் மீதத்தை எவ்வளவு தாங்க முடியும் என்பது நன்கு அளவிடப்படவில்லை. அதை ஊகிக்க வேண்டாம்.

படிகளின் வரிசை கண்டிப்பாகப் பின்பற்றப்படும்போது ப்ளாட் கலப்பிணைவு இணக்கமானது: மாற்றம், நிலைநிறுத்தல், நிறமூட்டல், பதிவுசெய்தல், நிறநீக்கம், கலப்பிணைவு. இந்த வரிசையே Herrin மற்றும் Schmidt வடிவமைப்பாகும். மாற்றத்துக்கு முன் நிறமூட்டுவது அல்லது நிறநீக்கத்தைத் தவிர்ப்பது வேறு முறை; அதற்கென தனிச் சரிபார்ப்பு தேவை. நிறமூட்டி நீக்கப்பட்ட பிறகு, வழக்கமான ஆய்வுக்கூறு நீக்கம் மற்றும் மீண்டும் ஆய்வுக்கூறு பயன்படுத்துதல் இயல்பாக நடைபெறும். அதே நிறமூட்டிக் குடும்பத்தைக் கொண்டு செல் அளவில் நிறமூட்டுவது பற்றியும், நிலைநிறுத்தப்பட்ட படலத்துக்கான அணுகுமுறை ஏன் உயிருள்ள செல்களின் முறைகளுக்குப் பொருந்தாது என்பது பற்றியும் அறிய, நுண்ணோக்கி நிறமூட்டல் விளக்கத் தொகுப்பைப் பார்க்கவும்.

நிரந்தர நிலைநிறுத்தல் மாற்றுமுறையைத் தவிர்த்தால், தயாரிப்புக்கான அகரோஸிலும் நீல நிறமூட்டியால் கண்டறியப்பட்ட PAGE ஒலிகோக்களிலும் பட்டைகளை வெட்டியெடுக்க முடியும். மீளக்கூடிய பிணைப்புடைய நிறமூட்டிக்கு, நிறநீக்கத்துக்குப் பிறகு மின்வெளியேற்றம் செய்வது வேதியியல் ரீதியாகச் சாத்தியமானது. ஆனால் மெத்திலீன் நீலத்துக்கெனக் கட்டுப்படுத்தப்பட்ட விளைச்சல் தரவுகள் குறைவாக உள்ளன. வெளியேற்றத்துக்குப் பிறகு உப்பை நீக்கவும் அல்லது வீழ்படிவாக்கவும்.

மீண்டும் மீண்டும் ஏற்படும் தோல்விகள்

மங்கலான ஜெல் பட்டைகள் பொதுவாக நிறஅளவியல் நிறமூட்டிக்குப் போதாத மாதிரி நிறையைக் குறிக்கின்றன. குறிப்பாகக் குறுகிய ஒற்றை இழை அல்லது RNA இலக்குகளில் இது ஏற்படும். அதிக மாதிரியை ஏற்றவும், புதிய நிறமூட்டியைப் பயன்படுத்தவும், செறிவை அதிகரிப்பதற்கு முன் நிறமூட்டும் நேரத்தை நீட்டிக்கவும், நிறநீக்கத்தைச் சற்றுமுன்னதாக நிறுத்தவும். எந்தத் தெளிவான வேறுபாடும் இல்லாமல் முழுவதும் நீலமாக உள்ள ஜெல், பொதுவாக அதிகப்படியான நிறமூட்டல் அல்லது போதுமான முறை நீரை மாற்றாததைக் குறிக்கிறது. PAGE பட்டைகள் மங்குவது எதிர்பார்க்கப்படும் வேதியியல் நிகழ்வு; நிறமூட்டல் தோல்வியல்ல. விரைவாகப் புகைப்படம் எடுக்கவும். சீரற்ற மென்படலப் பின்னணி, மடிப்புகள், குமிழ்கள், விரல் தடங்கள், சீரற்ற அசைவு அல்லது திட்டுத்திட்டாக நடந்த மாற்றத்தைக் குறிக்கிறது. கலப்பிணைவுக் கட்டுப்பாடு இல்லாமல் அதைச் சமமற்ற மாதிரி ஏற்றமாகப் பொருள் கொள்ள வேண்டாம். பரவலாக மங்கிய பலவீனமான ரைபோசோமல் பட்டை அமைப்பு சிதைவைக் குறிக்கலாம். ஆனால் முழுமையற்ற மாற்றம், மிகக் குறைந்த மொத்த RNA அளவு (வழக்கமான பாதைகளில் சில முதல் பல பத்து மைக்ரோகிராம்கள் வரை இருக்கும்) அல்லது அதிகப்படியான நிறநீக்கம் காரணமாகவும் அது ஏற்படலாம். நிறமூட்டி அதிக அளவில் உள்ள ரைபோசோமல் RNA-வைக் காட்டுகிறது. அது குறிப்பிட்ட ஒரு டிரான்ஸ்கிரிப்டைக் காட்டுவதில்லை. அந்தப் பணி ஆய்வுக்கூறுக்குரியது.

மிகைப்படுத்தாமல் பாதுகாப்பும் கையாளுதலும்

எத்திடியம் புரோமைடைவிட மெத்திலீன் நீலத்தைக் கையாளுவது எளிதானது; ஆனால் அது தீங்கற்றதல்ல. தற்போதைய MilliporeSigma பாதுகாப்புத் தரவுத் தாள், இந்த நிறமூட்டியைத் திடீர் வாய்வழி நச்சுத்தன்மை Category 4 என வகைப்படுத்தி, விழுங்கினால் தீங்கு விளைவிக்கும் எனக் குறிப்பிடுகிறது. Sigma-Aldrich மெத்திலீன் நீல SDS படி, அங்கீகரிக்கப்பட்ட கழிவு அகற்றும் முறையில் இதை அகற்ற வேண்டும். எத்திடியம் புரோமைடுக்கு வலுவான மரபணு நச்சுத்தன்மை எச்சரிக்கைகள் உள்ளன. அதன் Sigma-Aldrich எத்திடியம் புரோமைடு SDS-இல் இனப்பெருக்கச் செல்கள் மீதான சந்தேகிக்கப்படும் பாதிப்புகளும் குறிப்பிடப்பட்டுள்ளன. Thermo Fisher நியூக்ளிக் அமில நிறமூட்டி வழிகாட்டியில் குறிப்பிட்டுள்ளபடி, அதன் ஜெல்களும் கரைசல்களும் பொதுவாக அபாயகரமான வேதியியல் கழிவுகளாகத் தனியே பிரிக்கப்படுகின்றன. இரண்டுக்கும் SDS மற்றும் நிறுவன விதிகளைப் பின்பற்றவும். உலர் நிறமூட்டியை இறுக்கமாக மூடி உலர்ந்த நிலையில் வைத்திருக்கவும். பயன்பாட்டுக் கரைசலைச் செய்முறை அனுமதிக்கும் அளவுக்கு மட்டுமே மறுபயன்பாடு செய்யவும். நிறமூட்டப்பட்ட மென்படலங்களை வடிகட்டித் தாள்களுக்கு இடையில் உலர்ந்த நிலையில் சேமிக்கவும். பட்டைகள் பரவி மறையும் முன் ஜெல்களைப் புகைப்படம் எடுக்கவும்.

ஆய்வுமேசைக்கான இந்தச் சுருக்கத்தை நினைவில் கொள்ளுங்கள். ஜெல்கள், அதிக மாதிரி அளவில் வெள்ளை ஒளியில் காணக்கூடிய தன்மையைச் சோதிக்கின்றன. ஆய்வுக்கூறு உணர்திறன் மிக்க பணியைச் செய்வதற்கு முன், மென்படலங்கள் மாற்றத்தையும் மாதிரி ஏற்றத்தையும் சோதிக்கின்றன. ஒரே நிறமூட்டி இரண்டுக்கும் பயன்படுகிறது; மிதமான உணர்திறன், மீளக்கூடிய பிணைப்பு, கண்டிப்பான செயல்பாட்டு வரிசை ஆகியவற்றுடன்.