EMB அகாரில் E. coli மற்றும் பிற காலனிகளின் தோற்றங்களைப் புரிந்துகொள்ளுதல்

ஒரு மாணவர், அடையாளம் தெரியாத மாதிரியை ஈசின் மெத்திலீன் புளூ அகாரில் கோடிட்டு விதைத்து, இரவு முழுவதும் வளர்ப்புக்கு வைத்து, மறுநாள் பச்சைப் பளபளப்புடன் கூடிய கருமையான காலனிகள் உள்ள தட்டைப் பார்க்கிறார். குறிப்பேட்டில் "E. coli, உறுதிப்படுத்தப்பட்டது" என்று எழுதுகிறார். தட்டு வழங்கக்கூடிய ஆதாரத்தைவிட அதிகமான முடிவை அந்தப் பதிவு தெரிவிக்கிறது. குறிப்பிட்ட சூழ்நிலைகளில் ஏற்பட்ட வளர்ச்சி மற்றும் நொதித்தலின் வெளிப்பண்பையே தட்டு காட்டுகிறது. உயிரின இனத்தின் அடையாளம் என்பது தனியான முடிவு; அதற்குத் தனியான ஆதாரம் தேவை.

இந்த வழிகாட்டி EMB அகார் முடிவுகளைப் பொருள் விளக்கும் பணியாக அணுகுகிறது. அதன் அடிப்படைக் கருத்தை விளக்கி, கட்டுப்பாடுகளுடன் கூடிய விளக்கத் தட்டுத் தொகுப்பை விவரித்து, பாடநூலில் காட்டப்படும் தோற்றம் தவறாக வழிநடத்தக்கூடிய சூழல்களைச் சுட்டிக்காட்டுகிறது.

தட்டின் பின்னுள்ள கருத்து

EMB அகார் தேர்ந்தெடுக்கும் தன்மையும் வேறுபடுத்தும் தன்மையும் கொண்டது. ஈசின் Y மற்றும் மெத்திலீன் புளூ சாயங்கள் பல கிராம் நேர்மறை உயிரினங்களை ஒடுக்குவதால், இந்த ஊடகம் கிராம் எதிர்மறை உயிரினங்களின் வளர்ச்சிக்குச் சாதகமாக உள்ளது. அதே சாயங்கள் குறிகாட்டிகளாகவும் செயல்படுகின்றன: ஓர் உயிரினம் கிடைக்கும் சர்க்கரையை நொதித்து, அதன் சுற்றுப்பகுதியில் போதுமான அமிலத்தை உருவாக்கும்போது, காலனி அதிக அளவில் சாயத்தை ஏற்று, அடர் ஊதாவிலிருந்து நீலம் கலந்த கருப்பு நிறமாக மாறுகிறது. தீவிரமான அமில உற்பத்தியின்போது, காலனியின் மேற்பரப்பில் உலோகப் பச்சை வண்ணப்பளபளப்பு தோன்றலாம். ஈசின் மெத்திலீன் புளூ அகார் தட்டுகளுக்கான ASM செய்முறை, தேர்ந்தெடுத்தல் மற்றும் வேறுபடுத்தலின் இந்த இணைந்த செயல்பாட்டை விவரித்து, கற்பித்தலுக்கான குறிப்புப் புகைப்படங்களையும் வழங்குகிறது.

எந்த முடிவையும் படிப்பதற்கு முன் ஒரு விவரம் முக்கியம்: எந்தக் கலவை வடிவம் பயன்படுத்தப்படுகிறது என்பதைச் சரிபார்க்கவும். பழைய Holt Harris Teague கலவை வடிவத்தில் லாக்டோஸ் மற்றும் சுக்ரோஸ் இரண்டும் உள்ளன; Levine EMB-யில் லாக்டோஸ் மட்டுமே உள்ளது. பல Serratia marcescens தனிமைப்படுத்தப்பட்ட உயிரினங்களைப் போல, சுக்ரோஸை நொதித்து லாக்டோஸை நொதிக்காத ஓர் உயிரினம், இந்த இரண்டு வடிவங்களிலும் வெவ்வேறு தோற்றம் காட்டலாம். EMB ஊடகங்களுக்கான உற்பத்தியாளர் ஆவணம் இந்தக் கலவை வேறுபாட்டைத் தெளிவாகக் குறிப்பிடுகிறது. முடிவுடன் சேர்த்து உற்பத்தியாளர் மற்றும் கலவை வடிவத்தையும் குறிப்பேட்டில் பதிவு செய்யவும்.

தயாரிக்கப்பட்டு, உயிரினம் விதைக்கப்படாத EMB அகார் பொதுவாகச் சிவப்பு கலந்த பழுப்பிலிருந்து சிவப்பு கலந்த ஊதா நிறத்தில் இருக்கும்; சில நேரங்களில் பச்சைச் சாயல் அல்லது நுண்ணிய படிவு காணப்படலாம். அந்தப் பின்னணி நிறம் வளர்ச்சி அல்ல. ஒவ்வொரு மதிப்பீட்டையும் உயிரினம் விதைக்கப்படாத தட்டு அல்லது ஆவணப்படுத்தப்பட்ட அடிப்படைத் தோற்றத்துடன் ஒப்பிடவும். கற்பித்தல் செய்முறை வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடாவிட்டால், 35 முதல் 37 C வெப்பநிலையில் சுமார் 18 முதல் 24 மணிநேரக் காற்றுள்ள வளர்ப்புக்குப் பிறகு முதன்மைத் தட்டை மதிப்பிடவும். நீண்ட வளர்ப்புக் காலம் நொதித்தலின் தோற்றத்தை மாற்றலாம்.

தட்டை எப்படிப் பார்ப்பது

இரண்டு வகையான ஒளியைப் பயன்படுத்தவும். முதலில் பிரதிபலித்த அல்லது சாய்வான ஒளியில் தட்டைப் பார்த்து, அதைச் சாய்க்கவும்: உலோகப் பளபளப்பு வண்ணமாறும் தன்மை கொண்டது; பார்க்கும் கோணத்தைப் பொறுத்துத் தோன்றலாம் அல்லது மறையலாம். பிறகு காலனியின் நிறத்தையும் கருமையான மையங்களையும் மதிப்பிட, தட்டினூடே செல்லும் ஒளியில் ஆய்வு செய்யவும். நன்கு தனித்துள்ள காலனிகளை அடிப்படையாகக் கொள்ளவும்; நெருக்கமும் அண்டைக் காலனிகளும் உள்ளூர் அமிலச் சேர்க்கையை மாற்றி, நிறத்தை ஒடுக்கவோ மிகைப்படுத்தவோ முடியும். ASM படத் தொகுப்பு இதை நேரடியாகக் காட்டுகிறது: கலப்பு வளர்ப்பில், சுற்றியுள்ள உயிரினங்கள் அமிலச் சூழலை மாற்றுவதால் E. coli அதன் எதிர்பார்க்கப்படும் பளபளப்பை இழக்கலாம்.

பயிற்சி அனுமதிக்கும்போதெல்லாம் கட்டுப்பாடுகளைச் சேர்க்கவும். பொதுவாகக் கற்பித்தலில் பயன்படுத்தப்படும் தொகுப்பில், நீலம் கலந்த கருப்பு நிறம் மற்றும் உலோகப் பளபளப்பு வெளிப்பண்புக்காக E. coli ATCC 25922, நிறமற்ற வெளிப்பண்புக்காக Salmonella Typhimurium ATCC 14028 அல்லது Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 போன்ற நொதிக்காத உயிரினம், மேலும் வளர்ச்சித் தடுப்புக் கட்டுப்பாடாக Enterococcus faecalis அல்லது Staphylococcus aureus போன்ற கிராம் நேர்மறை உயிரினம் இடம்பெறும். இவை EMB ஊடகங்களுக்கான வழக்கமான தரக் கட்டுப்பாட்டு அட்டவணைகளில் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன. நேர்மறைக் கட்டுப்பாட்டில் பளபளப்பு இல்லாவிட்டால், அடையாளம் தெரியாத உயிரினத்தைப் பற்றிச் சந்தேகிப்பதற்கு முன் வளர்ப்பு நிலை, நெருக்கம் அல்லது கலவை வடிவத்தைச் சந்தேகிக்கவும்.

விளக்கத் தட்டுத் தொகுப்பு

கீழே உள்ள தட்டுகள் உருவாக்கப்பட்ட விளக்கப்படங்கள்; உண்மையான வளர்ப்புகளின் புகைப்படங்கள் அல்ல. கவனிக்க வேண்டிய தோற்ற அமைப்பையே அவை காட்டுகின்றன; எந்தவொரு தனிப்பட்ட திரிபின் துல்லியமான நிறச் சாயலையும் அல்ல. அவற்றை ASM குறிப்புப் புகைப்படங்களுடனும், கற்பித்தல் ஆய்வகத்தின் உண்மையான தட்டுகளுடனும் ஒப்பிடவும்.

தட்டு 1: EMB அகாரில் Escherichia coli, தீவிரமாக லாக்டோஸை நொதிக்கும் உயிரினம்

EMB அகாரில் E. coli பொதுவாக அடர் ஊதாவிலிருந்து நீலம் கலந்த கருப்பு நிறத்தில் இருக்கும்; பெரும்பாலும் கருமையான மையமும், தீவிரமான அமில உற்பத்தியால் உண்டாகும் உலோகப் பச்சைப் பளபளப்பும் காணப்படும். மாணவர்கள் தேடும் பிரபலமான அம்சம் இந்தப் பளபளப்புதான்; ஆனால் இதை வரையறையாக அல்லாமல், ஆதரவளிக்கும் சான்றாகக் கருதவும். பளபளப்பின் தீவிரம் திரிபு, வளர்ப்புக் காலம், காலனி அடர்த்தி மற்றும் பார்க்கும் கோணம் ஆகியவற்றைப் பொறுத்து மாறும். பளபளப்பு இல்லாததால் E. coli இல்லை என்று நிராகரிக்க முடியாது; பளபளப்பில்லாத கருமையான காலனி வேறு பல நொதிக்கும் உயிரினங்களையும் சுட்டிக்காட்டலாம். அடுத்தகட்டப் பணிகளுக்கு, நெரிசலான பகுதியிலிருந்து மதிப்பிடுவதற்குப் பதிலாக நன்கு தனித்துள்ள காலனியைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.

தட்டு 2: EMB அகாரில் Klebsiella pneumoniae, சளிப்பாங்கான நொதிக்கும் உயிரினம்

EMB அகாரில் Klebsiella pneumoniae பொதுவாகப் பெரிய, ஒளிரும், சளிப்பாங்கான காலனிகளை உருவாக்குகிறது. அவை இளஞ்சிவப்பு கலந்த ஊதாவிலிருந்து பழுப்பு கலந்த ஊதா நிறச் சாயல்களில் இருக்கும்; பெரும்பாலும் கருமையான மையங்கள் இருந்தாலும், வழக்கமாக வலுவான உலோகப் பளபளப்பு இருக்காது. Enterobacter போன்ற தொடர்புடைய நொதிக்கும் உயிரினங்களிலும் இதேபோன்ற உருவத்தோற்றம் காணப்படும். சளிப்பாங்கான தன்மையும் காலனி அளவும் மதிப்பீட்டின் பகுதிகள்: சிறிய, தட்டையான இளஞ்சிவப்புக் காலனியின் சான்று மதிப்பு, பெரிய, குவிந்த, சளிப்பாங்கான காலனியின் சான்று மதிப்பிலிருந்து வேறுபடும். E. coli-யைப் போலவே, இங்கும் தட்டு ஒரு நொதித்தல் வெளிப்பண்பை முன்வைக்கிறது; இன அளவில் பெயரிடுவதற்குக் கீழே விவரிக்கப்பட்டுள்ள உயிர்வேதியியல் உறுதிப்படுத்தல் தேவை.

தட்டு 3: EMB அகாரில் Salmonella மற்றும் பிற நொதிக்காத உயிரினங்கள், நிறமற்ற காலனிகள்

EMB அகாரில் Salmonella மற்றும் Shigella, பல Pseudomonas தனிமைப்படுத்தப்பட்ட உயிரினங்கள் உள்ளிட்ட தொடர்புடைய லாக்டோஸை நொதிக்காத உயிரினங்கள், பொதுவாக நிறமற்ற, ஒளி ஊடுருவும் அல்லது வெளிர் அம்பர் நிறக் காலனிகளாக வளரும். சில கலவை வடிவங்களும் சூழ்நிலைகளும் மங்கலான இளஞ்சிவப்புச் சாயலை அளிக்கின்றன; எனவே வெளிர் இளஞ்சிவப்புக் காலனி என்றாலே அது நொதிக்கும் உயிரினம் என்று கருத முடியாது. EMB, Salmonella-வை Shigella-விலிருந்தோ பிற நொதிக்காத உயிரினங்களிலிருந்தோ வேறுபடுத்துவதில்லை; அந்த வேறுபாட்டை அடுத்தகட்டச் சோதனைகள்தான் கண்டறிய வேண்டும். மேலும், E. coli போன்ற உலோகப் பளபளப்புள்ள காலனிகளை உருவாக்கும் லாக்டோஸ் நேர்மறை Salmonella திரிபுகளும் ஆவணப்படுத்தப்பட்டுள்ளன. ஒரே தட்டால் முடிவை உறுதிசெய்ய முடியாததற்கு இது மேலும் ஒரு காரணம்.

தட்டு 4: Serratia marcescens மற்றும் கலவை வடிவம் ஏற்படுத்தும் தவறான புரிதல்

மாணவர்கள் அடிக்கடி சிவப்புக் காலனிகளை எதிர்பார்த்து, பின்னர் தட்டைத் தவறாகப் புரிந்துகொள்வதால் Serratia marcescens-க்கெனத் தனிப் பகுதி தேவைப்படுகிறது. பெரும்பாலான மருத்துவ மாதிரிகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்ட உயிரினங்கள் லாக்டோஸை நொதிப்பதில்லை; எனவே Levine EMB-யில் அவை பொதுவாக வெளிர் நிறமாகவோ மங்கலான நிறத்துடனோ தோன்றும். பல தனிமைப்படுத்தப்பட்ட உயிரினங்கள் சுக்ரோஸை நொதிப்பதால், சுக்ரோஸ் உள்ள கலவை வடிவம் அதிகக் கருமையான அல்லது அமிலத்துடன் அதிகம் தொடர்புடைய எதிர்வினையை அளிக்கலாம். 35 முதல் 37 C வெப்பநிலையில் வழக்கமான சிவப்பு புரோடிஜியோசின் நிறமியையும் எதிர்பார்க்க வேண்டாம்; வளர்ப்புக் கருவியின் வெப்பநிலையில் நிறமி உற்பத்தி நம்பகமானதல்ல. செய்முறை EMB அகாரில் Serratia marcescens-ஐக் குறிப்பிடும்போது, அந்தக் கூற்று எந்தக் கலவை வடிவத்தை அடிப்படையாகக் கொண்டுள்ளது என்பதைச் சரிபார்க்கவும். Serratia வளர்சிதை மாற்றம் குறித்த மதிப்பாய்வு, இந்தத் தவறான புரிதலுக்குக் காரணமான லாக்டோஸ் எதிர்மறைத் தன்மையையும் சுக்ரோஸ் நொதித்தலில் காணப்படும் மாறுபாட்டையும் சுருக்கமாக விளக்குகிறது.

தட்டு 5: கட்டுப்பாடுகளும் வளர்ச்சி தடுக்கப்பட்ட உயிரினங்களும்

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus மற்றும் Bacillus போன்ற கிராம் நேர்மறை உயிரினங்களின் வளர்ச்சி பொதுவாக EMB அகாரில் தடுக்கப்படுகிறது அல்லது குறிப்பிடத்தக்க அளவில் ஒடுக்கப்படுகிறது. எனினும், எல்லாத் திரிபுகளிலும் வளர்ச்சித் தடுப்பு முழுமையாக இருப்பதில்லை. கட்டுப்பாட்டுத் தொகுப்பு மதிப்பீட்டை நம்பகமானதாக ஆக்குகிறது: E. coli கட்டுப்பாடு நீலம் கலந்த கருப்பு நிறத்துடனும் பளபளப்புடனும் நல்ல வளர்ச்சியைக் காட்ட வேண்டும்; நொதிக்காத உயிரினக் கட்டுப்பாடு நிறமற்ற வளர்ச்சியைக் காட்ட வேண்டும்; வளர்ச்சித் தடுப்புக் கட்டுப்பாடு மிகக் குறைந்த வளர்ச்சியையோ வளர்ச்சியின்மையையோ காட்ட வேண்டும். வளர்ச்சித் தடுப்புக் கட்டுப்பாடு நன்றாக வளர்ந்தால், தேர்ந்தெடுக்கும் செயல்பாடு தோல்வியடைந்துள்ளது; அந்தத் தொகுதியில் உள்ள மற்ற எல்லா மதிப்பீடுகளும் சந்தேகத்திற்குரியவை. சாயமிடும் முறைகள், வளர்ப்பு ஊடகங்கள் பதிலளிப்பதிலிருந்து வேறுபட்ட கேள்விக்குப் பதிலளிக்கின்றன; ஆய்வகத்தில் நுண்ணோக்கித் தகடுகளுக்குச் சாயமிடுவது குறித்துப் பார்க்க, மெத்திலீன் புளூ சாயமிடல் படத் தொகுப்பைக் காணவும்.

வரம்புகளுடன் கூடிய ஒப்பீடு

தவறாக வழிநடத்தும் தோற்றங்களை மூன்று வாக்கியங்கள் சுருக்குகின்றன. கருமை என்பது E. coli என்று பொருளல்ல; ஏனெனில் Klebsiella, Enterobacter மற்றும் பிற நொதிக்கும் உயிரினங்கள் பளபளப்பில்லாமல் கருமையான மையங்களை உருவாக்குகின்றன. இளஞ்சிவப்பு என்பது Klebsiella என்று பொருளல்ல; ஏனெனில் மிதமாக அல்லது மெதுவாக நொதிக்கும் உயிரினங்களும், பொதுவாக நொதிக்காதவை என வகைப்படுத்தப்படும் சில உயிரினங்களும் இளஞ்சிவப்பு அல்லது வெளிர் ஊதா நிறத்தில் தோன்றுகின்றன. பளபளப்பு என்பது உறுதியான E. coli அடையாளம் என்று பொருளல்ல; ஏனெனில் தீவிரமாக நொதிக்கும் பிற உயிரினங்களும் அதை உருவாக்கலாம். கற்பித்தல் செய்முறையும் அதன் கலப்பு வளர்ப்புப் படங்களும் இந்த ஒவ்வொரு தவறான முடிவையும் விளக்குகின்றன.

உறுதிப்படுத்தலின் வரம்புகள்

EMB அகார் ஓர் வெளிப்பண்பைக் காட்டுகிறது; ஓர் இனத்தை அல்ல. வெவ்வேறு உயிரினங்கள் ஒரே காலனித் தோற்றத்தைக் கொண்டிருக்கலாம். ஒரே உயிரினமும் திரிபு, வயது, நெருக்கம், கலவை வடிவம் மற்றும் வளர்ப்பு நிலை ஆகியவற்றைப் பொறுத்து அதன் பாடநூல் தோற்றத்திலிருந்து மாறுபடலாம். அதனால்தான் கற்பித்தல் மற்றும் மருத்துவ ஆய்வகப் பணிமுறைகள் EMB உருவத்தோற்றத்தைத் தற்காலிக அடையாளமாகக் கருதுகின்றன.

சான்றுகளால் ஆதரிக்கக்கூடிய மாணவர் பணிமுறை இதுவாகும்: தனித்துள்ள காலனியை விவரிக்கவும் — அளவு, நிறம், மையம், சாய்வான ஒளியில் பளபளப்பு, சளிப்பாங்கான தன்மை ஆகியவற்றைக் குறிப்பிடவும்; கலவை வடிவம், வளர்ப்புக் காலம், வெப்பநிலை மற்றும் கட்டுப்பாடுகளைப் பதிவு செய்யவும்; பிறகு எந்த உறுதிப்படுத்தும் சோதனைக்கும் முன் நன்கு தனித்துள்ள காலனியைத் தூய வளர்ப்பாகப் பெற மறுவளர்ப்பு செய்யவும். வழக்கமான அடுத்தகட்டச் சோதனைகளில், தற்காலிக E. coli மற்றும் கோலிஃபார்ம் அடையாளத்திற்காக கிராம் சாயமிடலுடன் IMViC வினைகள், குடல்சார் உயிரினங்களுக்காக TSI அல்லது KIA மற்றும் உயிரினத்திற்கேற்ற உயிர்வேதியியல் சோதனைத் தொகுப்புகள் ஆகியவை அடங்கும். பணியின் தேவைக்கேற்ப சீராலஜி, MALDI TOF அல்லது பிற சரிபார்க்கப்பட்ட அடையாள முறைகளும் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. தேர்ந்தெடுக்கும் மற்றும் வேறுபடுத்தும் குடல்சார் ஊடகங்களில் EMB எவ்வாறு பொருந்துகிறது என்பதற்கான பின்னணிக்கு, குடல்சார் வளர்ப்பு ஊடகங்களின் அறிமுகங்களையும் கிராம் சாயமிடல் அடுத்தகட்ட ஆய்வையும் காணவும். நீல நிற நுண்ணோக்கித் தகடு சாயமிடல் எதை நிரூபிக்க முடியும், எதை நிரூபிக்க முடியாது என்ற தொடர்புடைய கேள்விக்கு, மெத்திலீன் புளூ சாயமிடல் படத் தொகுப்பு இதே அணுகுமுறையில் காண்பதையும் முடிவையும் தனித்தனியாக வைத்திருக்கிறது.

முடிவுக்கு முன் காண்பதை எழுதவும். "24 மணிநேரத்தில் Levine EMB-யில், பார்க்கும் கோணத்தைப் பொறுத்துப் பச்சைப் பளபளப்பைக் காட்டும் அடர் நீலம் கலந்த கருப்புக் காலனிகள்; தீவிரமான லாக்டோஸ் நொதித்தலுடன் ஒத்துப்போகின்றன" என்பது ஆதரிக்கக்கூடிய கூற்று. "E. coli, உறுதிப்படுத்தப்பட்டது" என்பதற்கு, தட்டு மட்டும் வழங்க முடியாத உறுதிப்படுத்தும் படிநிலை தேவை.