Kwa nini bluu ya methilini hutumiwa kama rangi kinzani katika utiaji rangi wa kuhimili asidi

Fundi wa maabara anachunguza smear ya makohozi baada ya mfululizo mzima wa utiaji rangi. Vijiti vyekundu vinaonekana wazi dhidi ya mandharinyuma ya bluu, na ripoti inatolewa ikisema basili zinazohimili asidi zimeonekana. Siku inayofuata, slaidi nyingine inaonyesha mandharinyuma ya bluu iliyo sawa kila mahali bila vijiti vyekundu, na inaripotiwa kuwa hasi kwa kifua kikuu. Mojawapo ya ripoti hizi inadai zaidi ya kile ambacho slaidi inaunga mkono, na si ile ya kwanza.

Mkanganyiko uko kwenye dhana. Fundi alichukulia rangi ya bluu kama sehemu ya kemia ya ugunduzi, kana kwamba bluu ya methilini ilisaidia kupata mikobakteria. Haikufanya hivyo. Kufikia wakati bluu ya methilini inapogusa slaidi, kipimo tayari kimekwisha. Rangi hupaka mandharinyuma tu ili matokeo yaweze kusomeka. Makala hii inaeleza kusudi la bluu ya methilini katika utiaji rangi wa kuhimili asidi, kwa nini ni bluu badala ya rangi nyingine yoyote, na hitimisho gani unaloweza kufikia kutokana na nyekundu dhidi ya bluu.

Jibu fupi

Utiaji rangi wa kuhimili asidi ni kipimo cha kutofautisha kinachotegemea dhana tatu. Fuksini ya karboli, ambayo ndiyo rangi ya msingi, hulazimishwa kuingia ndani ya kila seli, ikiwemo mikobakteria yenye tabaka la nta. Asidi-alkoholi, kiondoa-rangi, huondoa rangi nyekundu kutoka kwenye seli za kawaida lakini hushindwa kuiondoa kwenye zile zinazohimili asidi. Bluu ya methilini, rangi kinzani, kisha hupaka rangi kila kitu ambacho kiondoa-rangi kimeondolea rangi, hivyo seli zisizohimili asidi, seli za mwenyeji, na mabaki huonekana bluu huku basili zinazohimili asidi zikibaki nyekundu. Rangi kinzani hutoa utofautishaji. Haina jukumu lolote katika kemia inayofanya seli ihimili asidi.

Kazi ya kila hatua

Mchoro ulio hapa chini unaonyesha mgawanyo wa kazi. Usome kutoka kushoto kwenda kulia kama utaratibu, na usome ukanda wa chini kama ukumbusho kwamba kila kundi la mbinu za utiaji rangi huuliza swali tofauti.

Upenyaji huja kwanza. Mikobakteria hukinza rangi za kawaida za maji kwa sababu gamba lake halina mvuto kwa maji kwa kiwango kisicho cha kawaida, hivyo utaratibu hulazimisha rangi kuingia. Katika mbinu ya Ziehl-Neelsen, kupasha joto hadi kutoa mvuke husukuma fuksini ya karboli yenye fenoli kupenya ukuta wenye nta. Katika mbinu baridi ya Kinyoun, joto hubadilishwa na mchanganyiko wenye rangi ya msingi iliyokolea zaidi sana, na baadhi ya matoleo yaliyorekebishwa yasiyotumia joto huongeza viambato vinavyopunguza mvutano wa uso. Taratibu za utiaji rangi wa kuhimili asidi za American Society for Microbiology zinaeleza michanganyiko yote miwili sambamba, na tofauti ya ukolezi ni kubwa: takribani 0.3 g ya fuksini besi kwa 100 mL katika mbinu inayotumia joto dhidi ya karibu 4 g katika mbinu baridi.

Utofautishaji huja pili. Asidi-alkoholi, ambayo kwa kawaida ni 3 mL ya asidi hidrokloriki iliyokolea katika 97 mL ya ethanoli ya asilimia 95, huosha rangi nyekundu kutoka kwenye kila seli ambayo ukuta wake hauna ukinzani maalumu. Seli zenye gamba kamili la lipidi la mikobakteria hushikilia rangi. Hii ndiyo hatua ambayo mbinu nzima huitegemea, na ndiyo hatua inayoathiriwa zaidi na jinsi mbinu inavyotekelezwa, kama inavyojadiliwa hapa chini.

Utofautishaji wa rangi huja mwisho. Slaidi sasa ina seli nyekundu zinazohimili asidi kwenye mandharinyuma karibu isiyo na rangi ya seli zilizoondolewa rangi. Bluu ya methilini ya asilimia 0.3 w/v hurejesha mwonekano wa mandharinyuma hiyo kwa rangi iliyo tofauti sana na nyekundu. Utiaji wa rangi kinzani ni wa muda mfupi, kwa kawaida sekunde 20 hadi 30 katika mbinu inayotumia joto na hadi dakika chache katika baadhi ya matoleo ya mbinu baridi, na muda hutegemea utaratibu badala ya kuwa sifa ya rangi yenyewe.

Kwa nini rangi hii, na kwa nini bluu

Bluu ya methilini ni rangi besi ya kationi, maana yake ni kwamba ioni yake yenye rangi ina chaji chanya na hushikamana na nyuso zenye chaji hasi za bakteria zilizoondolewa rangi, seli za mwenyeji, na mabaki. OpenStax Microbiology inaeleza mantiki hii ya chaji kama kanuni ya jumla ya rangi besi. Lakini bluu ya methilini si ya kipekee kikemia katika kazi hii. Urujuani wa kristali na safranini pia ni rangi besi. Uchaguzi unahusu mwonekano, si kemia.

Vijiti vyekundu vinahitaji mandharinyuma yenye rangi inayotofautiana navyo, na bluu hutofautiana na nyekundu kwa namna yenye manufaa zaidi katika hadubini ya uwanja angavu. Safranini ingekuwa rangi kinzani isiyofaa kwa sababu rangi yake ya mwisho ya waridi-nyekundu inakaribiana sana na fuksini ya karboli iliyobaki, hivyo kuondoa tofauti yenyewe ambayo utaratibu uliunda. Urujuani wa kristali ungetoa mandharinyuma ya urujuani iliyokolea ambayo ingeshindana na basili nyekundu nyembamba kuvuta macho. Ushahidi mkubwa zaidi kwamba kazi hii ni utofautishaji wa rangi badala ya kemia ni uwezekano wa kubadilisha rangi: rangi kinzani za kijani kama kijani cha malakiti na kijani angavu hutumiwa katika baadhi ya taratibu za mifugo na taratibu zilizorekebishwa, na kipimo bado hufanya kazi, kwa sababu rangi yoyote iliyo tofauti kwa uwazi hufanya kazi hiyo hiyo.

Hili lina matokeo mawili ya kiutendaji. Kwanza, kichanganyio cha kawaida hakibainishi marekebisho yoyote ya pH; usichanganye myeyusho huu wa kawaida wa maji wa asilimia 0.3 na michanganyiko ya alkali kama bluu ya methilini ya Loeffler, ambayo ni sehemu ya dhana tofauti ya utiaji rangi. Pili, matumizi ya kupita kiasi huathiri matokeo. Maandiko ya histolojia yanaonya mahsusi kwamba mandharinyuma ya bluu iliyokolea kupita kiasi inaweza kuficha basili chache, hivyo kuacha slaidi ikiwa imefunikwa na rangi kwa muda mrefu kuliko unaoruhusiwa na utaratibu hupunguza usomekaji bila faida yoyote.

Kemia ya ukuta inayowezesha kipimo

Sababu inayofanya asidi-alkoholi itofautishe seli iko katika gamba la mikobakteria. Kiini cha muundo wake ni changamani ya mykolili-arabinogalaktani-peptidoglikani: peptidoglikani iliyounganishwa na arabinogalaktani ambayo ncha zake za nje hubeba asidi za mykoliki zenye minyororo mirefu sana, zikiunda utando wa nje wa mikobakteria wenye lipidi nyingi na upenyezaji mdogo kwa kiwango kisicho cha kawaida. Mapitio ya utando wa nje wa mikobakteria yanaeleza muundo huu kwa kina. Kizuizi hiki hufanya kazi katika pande zote mbili. Hukinza kuingia kwa rangi, ndiyo maana upenyaji unahitaji joto au rangi ya msingi iliyokolezwa zaidi, na hukinza kuondolewa kwa rangi, ndiyo maana asidi-alkoholi hushindwa kuondoa fuksini ya karboli baada ya kuingia ndani. Bakteria wa kawaida hawana gamba hili na hupoteza rangi. Kwa hiyo, uwezo wa kuhimili asidi unaeleweka vizuri zaidi kama jambo linalotokana na kizuizi cha lipidi, si fuksini kushikamana kikemia na asidi ya mykoliki.

Kemia hii pia inaeleza kitendawili cha kawaida: mikobakteria hupokea rangi vibaya na bila kutabirika kwa mbinu ya Gram, wakati mwingine ikionekana kama maumbo hafifu yenye mpangilio wa shanga au vivuli visivyotiwa rangi. Ukuta wake usiovutiwa na maji huzuia upenyaji wa urujuani wa kristali. Utiaji rangi wa kuhimili asidi si toleo lililorekebishwa la utiaji rangi wa Gram. Ni kanuni tofauti ya utofautishaji inayotegemea sifa tofauti ya ukuta, kama ulinganisho wa utiaji rangi rahisi na utiaji rangi wa Gram unavyoonyesha kwa mbinu hizo nyingine mbili.

Mbinu tatu, maswali matatu

Kwa kundi pana zaidi la mbinu za bakteria zinazotumia rangi moja, tazama atlasi ya utiaji rangi kwa hadubini.

Kile ambacho nyekundu dhidi ya bluu hakiwezi kuthibitisha

Vijiti vyekundu humaanisha kwamba vijidudu vilihifadhi fuksini ya karboli baada ya kupitishwa kwenye asidi-alkoholi. Matokeo hayo yanaendana na Mycobacterium tuberculosis, lakini mwongozo wa CDC wa uchunguzi wa kifua kikuu unasema wazi kwamba mikobakteria mingine pia huhimili asidi, hivyo utambuzi wa spishi unahitaji ukuzaji wa vimelea na upimaji wa asidi nukleiki, si rangi.

Makosa ya utekelezaji hujikita katika hatua mbili za kuosha. Uondoaji usiotosha wa rangi huacha nyenzo za mandharinyuma zikiwa nyekundu na kuongeza uwezekano wa usomaji chanya wa uongo. Uondoaji wa rangi kupita kiasi huondoa rangi ya msingi iliyoshikiliwa kwa udhaifu na kuchangia matokeo hasi ya uongo. Rangi kinzani iliyowekwa kwa wingi sana huficha basili chache ndani ya bluu. Smear nene, vitendanishi vilivyotengeneza mashapo, na maji ya kusuuza yaliyochafuliwa huongeza maumbo bandia ya aina zake.

Unyeti wa kipimo unawekewa kikomo na wingi wa vijidudu bila kujali umakini wa utekelezaji. Uchunguzi wa kawaida wa smear kwa hadubini unahitaji takribani basili 5,000 hadi 10,000 kwa mililita ya makohozi, na mapitio ya zamani ya ushahidi ya CDC yaliweka unyeti wa smear katika takribani asilimia 45 hadi 80 miongoni mwa visa vya kifua kikuu cha mapafu vilivyothibitishwa kwa ukuzaji wa vimelea. Kwa hiyo, smear hasi kamwe haiondoi uwezekano wa kifua kikuu. Mwongozo wa sasa wa CDC unaendelea kutaka ukuzaji wa vimelea pamoja na kila smear na unapendekeza kipimo cha ukuzaji wa asidi nukleiki kwenye angalau sampuli moja ya mfumo wa upumuaji pale kifua kikuu cha mapafu kinaposhukiwa na matokeo yangekuwa na athari kwenye usimamizi wa mgonjwa.

Kazi ya vitendo lazima ifuate taratibu zilizoidhinishwa

Maelezo ya kufundishia, yakiwemo makala hii, hayatoi idhini ya kufanya kazi ya kliniki. Kwa kazi ya maabara, fuata utaratibu sanifu wa uendeshaji wa maabara uliothibitishwa na kuoanisha na nyaraka za sasa za CDC, APHL, au CLSI; rejea ya CDC ya utiaji rangi wa kuhimili asidi iliyohifadhiwa katika kumbukumbu yake ya Stacks inaonyesha jinsi taratibu hizo zinavyobainisha vitendanishi na namna ya kusoma matokeo. Kushughulikia sampuli za kifua kikuu kunahitaji hatua za kuzuia kusambaa kwa vijidudu: smear huandaliwa ndani ya kabati la usalama wa kibayolojia kwa sababu maandalizi hutokeza erosoli na matone yanayorushwa, na mwongozo wa CDC wa usalama wa maabara unasema kwamba hata smear zilizofiksishwa kwa joto zinaweza kuwa na basili hai za kifua kikuu na lazima ziendelee kushughulikiwa kama zilizochafuliwa. Ingizo la CDC Public Health Image Library la smear ya fuksini ya karboli na bluu ya methilini iliyochunguzwa kwa M. leprae ni ukumbusho wenye manufaa wa matumizi ya mbinu hii zaidi ya kifua kikuu: utofautishaji uleule wa nyekundu kwenye bluu hutumika popote ambapo vijidudu vinavyohimili asidi vinatafutwa, na usomaji hasi uliofanywa kwa uangalifu wenyewe ni matokeo yanayostahili kurekodiwa.

Kusoma slaidi iliyokamilika

Rangi kinzani inaonyesha umuhimu wake wakati wa uchunguzi wa awali. Mchunguzi wa hadubini anayetazama kwa ukuzaji mdogo hutumia kwanza mandharinyuma ya bluu kutathmini ubora wa smear: usambazaji sawa wa seli, seli za mwenyeji zilizo kamili kwa ajili ya kuweka fokasi, na kutokuwepo kwa mashapo mengi. Miundo myekundu inayoshukiwa kisha huvuta macho hasa kwa sababu hakuna kitu kingine kwenye slaidi kilicho chekundu. Uthibitisho hufanyika kwa kutumia mafuta ya uzamishaji, ambapo basili halisi huonyesha vijiti vyembamba vinavyotarajiwa, wakati mwingine vikiwa vimepinda kidogo au vina mwonekano wa shanga, badala ya mabaki ya rangi yenye umbo sawa.

Utiaji rangi wa mandharinyuma pia huamua msamiati wa ripoti. Slaidi yenye basili nyekundu huripotiwa kuwa basili zinazohimili asidi zimeonekana, mara nyingi pamoja na daraja la ukadiriaji wa kiasi kulingana na kipimo cha maabara. Slaidi isiyo na vijidudu vyekundu huripotiwa kuwa hakuna basili zinazohimili asidi zilizoonekana, kamwe si kwamba ni hasi kwa kifua kikuu. Tofauti hii ni muhimu kwa sababu mandharinyuma ya bluu inathibitisha kwamba utiaji rangi ulifanya kazi, seli zilipokea rangi kinzani na mfumo wa macho ulitosha, huku bila kusema chochote kuhusu vijidudu vilivyo chini ya kikomo cha ugunduzi. Mandharinyuma ya bluu bila vijidudu vinavyoonekana ni matokeo halali kuhusu slaidi, si uamuzi kuhusu mgonjwa.

Kumbuka mgawanyo wa kazi, na kuandika ripoti kutakuwa rahisi. Fuksini ya karboli hutambua miundo inayoshukiwa. Asidi-alkoholi hufanya kipimo. Bluu ya methilini hufanya tu jibu lisomeke: nyekundu ilihifadhi rangi licha ya asidi, bluu iliipoteza. Mambo mengine yote, yaani spishi, wingi wa vijidudu, na maana ya kliniki, hutokana na kazi inayofanywa zaidi ya slaidi.