Makala
Bluu ya methilini na oksidi nitriki: NOS, cGMP, na uashiriaji wa mishipa
Swali linasikika kuwa rahisi: je, bluu ya methilini huzuia oksidi nitriki? Maabara, jibu hugawanyika katika maswali manne tofauti, na kila moja lina jaribio tofauti la kulichunguza. Kuyachanganya ndiyo sababu kuu inayofanya maandishi kuhusu bluu ya methilini na oksidi nitriki yaonekane yenye uhakika lakini yasiyo wazi.
Fikiria ishara ya oksidi nitriki kama mnyororo wenye viungo vinne. Jeni hunakiliwa ili kutengeneza sintasi ya oksidi nitriki. Kimeng'enya hubadilisha arginini kuwa oksidi nitriki. Gesi husambaa kuelekea shabaha yake kabla haijaitikia na kitu kingine. Siklasi ya guanilati mumunyifu huitambua na kutengeneza GMP ya mzunguko. Athari za bluu ya methilini katika kila kiungo zimeripotiwa katika machapisho, lakini ushahidi unatokana na mifumo tofauti ya majaribio, viwango tofauti vya mkusanyiko, na isoformu tofauti. Matokeo katika kiungo kimoja hayathibitishi athari katika kingine.
Mnyororo wa kawaida, ukielezwa kwa uwazi
Katika ukuta wa mshipa wa damu, mfuatano wa kawaida huenda hivi. Kichocheo huathiri seli ya endotheliamu. Sintasi ya oksidi nitriki ya endotheliamu, inayoitwa eNOS au NOS3, hutengeneza kiasi kidogo cha oksidi nitriki kwa muda mfupi. Gesi husambaa hadi kwenye seli jirani ya misuli laini, hufungamana na heme yenye chuma kilichopokea elektroni katika siklasi ya guanilati mumunyifu, na huharakisha ubadilishaji wa GTP kuwa GMP ya mzunguko. GMP ya mzunguko huwasha kinasi ya protini G, ushughulikiaji wa kalsiamu hubadilika, na misuli hulegea.
Kuna mnyororo wa pili unaostahili kutofautishwa. Wakati wa maambukizi au kuathiriwa na saitokini, seli hunakili jeni la kimeng'enya tofauti, sintasi ya oksidi nitriki inayochochewa au iNOS, inayoitwa pia NOS2. Hutoa mtiririko mkubwa zaidi wa oksidi nitriki unaodumu kwa muda mrefu zaidi kuliko eNOS. Isoformu ya tatu, NOS ya nyuroni au nNOS, inahusiana na muktadha mwingine tena. Makala ya utafiti inaposema sintasi ya oksidi nitriki bila kubainisha isoformu, simama na uangalie ni ipi iliyopimwa. Muhtasari wa jinsi bluu ya methilini inavyohamisha elektroni unasisitiza jambo hilo hilo kuhusu shabaha za redoksi kwa ujumla: mfumo wa kupitisha elektroni haufanyi chochote peke yake, na mshirika katika kila mwisho ndiye anayeamua matokeo.
GMP ya mzunguko inayopimwa pia ni kiashiria kinachounganisha michakato kadhaa, si kipimo cha moja kwa moja cha kimeng'enya. Kiwango chake huakisi usanisi unaofanywa na siklasi ukiondoa uvunjaji unaofanywa na fosfodiesterasi, hasa PDE5 katika misuli laini ya mishipa. Kwa hiyo, kupungua kwa GMP ya mzunguko kunamaanisha kwamba ishara kidogo zaidi ilifikia kipokezi. Peke yake, hakutaji kiungo kilichoshindwa kufanya kazi.
Kiungo 1: kimeng'enya cha iNOS kinatengenezwa kwa kiasi kidogo zaidi
Katika makrofaji za panya wadogo zilizochochewa kwa lipopolisakaridi ya bakteria, interferoni gama, au vyote viwili, bluu ya methilini ilizuia ongezeko lililotarajiwa la protini ya iNOS na kupunguza sana RNA ya ujumbe ya iNOS katika majaribio ya unakili katika makrofaji. Sehemu yenye kutoa ufahamu zaidi ni kile ambacho hakikubadilika. Uvunjaji wa kizuizi I kappa B alpha, ufosforilishaji wa NF kappa B na STAT1, na uhamaji wa vipengele hivyo hadi kwenye kiini viliendelea kwa kiasi kikubwa bila kuathiriwa. Kilichopungua ni ufungamanaji wake na DNA, jambo lililothibitishwa kwa uwekaji mashapo ya kromatini kwa kutumia kingamwili, ambao ulionyesha kupungua kwa uwepo wake katika promotori ya iNOS.
Hiyo ni athari ya udhibiti wa jeni inayotokea kabla ya kuamuliwa kwa kiasi cha kimeng'enya, si uzuiaji wa haraka wa kimeng'enya kilichopo tayari. Inahusiana na uashiriaji wa uchochezi, ambapo vipengele vya unakili lazima vifungamane na promotori kabla protini haijazalishwa. Haisemi chochote moja kwa moja kuhusu eNOS inayokuwapo kiasili katika mshipa ulio katika hali ya kawaida, na inapaswa kuelezwa kwa mipaka hiyo.
Kiungo 2: kimeng'enya cha NOS kilichopo hufanya kazi polepole zaidi
Utafiti wa panya wakubwa ulichunguza kiwango tofauti. Panya wakubwa wa kiume waliokuwa macho walipewa lipopolisakaridi kupitia mshipa, kisha saa tatu baadaye wakapewa ama mchanganyiko wa chumvi au bluu ya methilini kwa kiasi cha 3 mg kwa kg kupitia mshipa. Shughuli ya sintasi ya oksidi nitriki katika sehemu ya kati ya msingi wa hipothalamasi ilipimwa kwa ubadilishaji wa arginini yenye alama kuwa sitrulini katika utafiti wa shughuli ya NOS katika hipothalamasi. Msongo pamoja na mchanganyiko wa chumvi pekee vilichochea kiasi fulani cha shughuli isiyotegemea kalsiamu, na lipopolisakaridi iliiongeza hadi karibu mara kumi ya kiwango cha kundi la udhibiti. Bluu ya methilini iliondoa vipengele vyote viwili vya shughuli vilivyochochewa. Shughuli ya kiasili inayotegemea kalsiamu haikubadilika katika tishu hiyo kwa kiasi hicho na wakati huo wa kipimo.
Soma matokeo hayo kama yalivyoandikwa: shughuli iliyopimwa ya aina ya iNOS ilipunguzwa chini ya hali hizo. Hicho si kipimo cha uonyeshaji wa jeni, wala si uthibitisho wa uteuzi wa kudumu wa iNOS badala ya eNOS au nNOS. Utafiti wa vimeng'enya vilivyosafishwa unasisitiza tahadhari hiyo. Katika vipimo vya moja kwa moja vya sintasi ya oksidi nitriki iliyosafishwa, bluu ya methilini ilizuia kabisa utengenezaji wa sitrulini katika mkusanyiko wa 30 micromolar, huku mkusanyiko wa kuzuia nusu ya shughuli ukiwa karibu 5.3 micromolar bila dismutasi ya superoksidi na 9.2 micromolar ikiwa ipo, kama ilivyoripotiwa katika ulinganisho wa NOS iliyosafishwa na siklasi ya guanilati. Utafiti mwingine wa nNOS iliyosafishwa ulihusisha uoksidishaji wa heme iliyofungamana na kimeng'enya. Funzo la msingi ni kwamba uzuiaji wa moja kwa moja wa NOS ni halisi katika mifumo iliyotengwa, lakini matokeo ya hipothalamasi hayawezi kupanuliwa kuwa dai la jumla kwamba bluu ya methilini haiathiri NOS zote za kiasili kila mahali.
Kiungo 3: oksidi nitriki hupotea kabla haijafika
Uthibitisho ulio wazi zaidi kwamba kitu kingine kisicho uzuiaji wa kimeng'enya kinaweza kueleza kupungua kwa GMP ya mzunguko unatokana na seli za misuli laini ya ateri ya mapafu ya sungura zilizokuzwa maabara. Mpangilio wa jaribio uliruka kabisa NOS ya ndani kwa kuongeza moja kwa moja vitu vinavyotoa oksidi nitriki, kisha ukachunguza kama bluu ya methilini bado ilipunguza mwitikio wa GMP ya mzunguko katika utafiti wa superoksidi katika misuli laini ya mishipa.
Vitu vitatu vinavyotoa oksidi nitriki vilijaribiwa katika mikusanyiko ya 1 hadi 100 micromolar: S nitroso L cysteine, nitroprusidi ya sodiamu, na analojia thabiti iliyoondolewa kundi la amini inayoitwa MPANO. Vyote viliongeza GMP ya mzunguko hadi takribani mara 1.5 hadi mara 12. Bluu ya methilini katika mkusanyiko wa 10 micromolar ilizuia athari za viwili vya kwanza kwa asilimia 51 hadi 100 na kuacha mwitikio wa MPANO bila mabadiliko. Kama bluu ya methilini ingekuwa inazuia tu eneo la kichocheo la siklasi, ingekuwa vigumu kueleza uteuzi huo kati ya vitu vinavyotoa oksidi nitriki, kwa sababu vyote vitatu huelekea kwenye kimeng'enya kilekile katika hatua ya baadaye.
Kisha vipimo vitatu vya udhibiti vilibainisha kuwa utaratibu huo unahusisha superoksidi. Kwanza, kuzalisha superoksidi nje ya seli kwa kutumia ksantini pamoja na oksidasi ya ksantini kulirudia muundo uleule: athari za CYSNO na nitroprusidi zilizuiwa, huku MPANO ikiwa haijaathiriwa. Pili, bluu ya methilini ilisababisha seli za misuli laini kuzalisha superoksidi kwa kutegemea kiasi kilichotumika na muda, jambo lililopimwa kupitia upunguzaji wa saitokromu c. Tatu, dismutasi ya superoksidi ilizuia kabisa uzuiaji huo ilhali katalasi haikufanya hivyo, jambo linaloelekeza kwenye superoksidi badala ya peroksidi ya hidrojeni kama kisababishi cha karibu katika mfumo huo wa jaribio.
Toleo la jaribio la kukuza seli za aina mbili pamoja linastahili kuelezwa kwa sababu linaonyesha mahali athari ilipotokea. Seli za endotheliamu zilizokuwa kwenye vioo vidogo vya kufunika sampuli zilikuzwa kwa muda mfupi pamoja na seli za misuli laini, hivyo kipengele kilichotolewa na endotheliamu katika hali ya kawaida kikaongeza GMP ya mzunguko ya misuli laini mara tatu hadi nane. Kutibu mojawapo ya makundi hayo ya seli kwa bluu ya methilini kabla ya jaribio kulipunguza ishara hiyo, na dismutasi ya superoksidi ilirejesha kwa kiasi fulani ishara iliyopunguzwa na matibabu ya awali ya endotheliamu. Kwa maneno mengine, si lazima bluu ya methilini itende ndani ya seli ya misuli laini inayopokea ishara. Inaweza kupunguza ishara kwa kuondoa mjumbe akiwa njiani. Mwongozo wa kusoma utafiti wa bluu ya methilini unachukulia hili kama kanuni ya jumla: taja sehemu ambapo hatua ya majaribio ilifanyika kabla ya kutaja shabaha ya molekuli.
Kuita jambo hili uzuiaji wa NOS kungekuwa kosa. Hakuna hatua ya sintasi iliyohitajika ili vitu hivyo vinavyotoa oksidi nitriki vifanye kazi, lakini ishara bado ilipungua.
Kiungo 4: kipokezi chenyewe huitikia kwa kiwango kidogo zaidi
Athari za moja kwa moja kwenye siklasi ya guanilati mumunyifu zipo, lakini viwango vya mkusanyiko vina umuhimu. Katika ulinganisho wa vimeng'enya vilivyosafishwa uliotajwa hapo juu, siklasi iliyochochewa na oksidi nitriki ilihitaji karibu 60 micromolar ya bluu ya methilini ili kuzuia nusu ya shughuli, ikilinganishwa na uzuiaji wa nusu ya shughuli ya NOS katika karibu 5 hadi 9 micromolar. Hata 1 millimolar ilizuia sehemu tu ya shughuli ya juu kabisa. Hiyo ni tofauti ya takribani mara sita hadi kumi na moja. Kwa hiyo, jaribio la seli katika mkusanyiko mdogo wa micromolar linalopunguza GMP ya mzunguko haliwezi kuitwa uzuiaji teule wa siklasi kwa kutegemea tu thamani ya GMP ya mzunguko.
Utafiti wa baadaye wa redoksi uliongeza tahadhari ya pili: bluu ya methilini ilizima siklasi iliyowashwa na oksidi nitriki kupitia utaratibu tofauti na uoksidishaji rahisi wa chuma cha heme unaosababishwa na hewa. Kwa hiyo, kipokezi kinaweza kuathiriwa, lakini kemia yake haijabainishwa kikamilifu. Tofauti ya viwango vya mkusanyiko inamaanisha kuwa, katika viwango vidogo vya micromolar, athari za superoksidi na NOS zinapaswa kuchunguzwa na kuondolewa kama maelezo yanayowezekana kwanza. Hapa ndipo udhibiti wa fosfodiesterasi pia unapohusika. Isipokuwa uvunjaji ulipimwa au kuzuiwa, kupungua kwa mkusanyiko wa GMP ya mzunguko kunaendana na usanisi mdogo zaidi, uvunjaji wa haraka zaidi, au vyote viwili.
Kwa nini haya hayawezi kufupishwa kuwa dai moja kuhusu shinikizo la damu
Kila kiungo kilithibitishwa katika mfumo tofauti. Unakili katika makrofaji si sawa na shughuli ya kimeng'enya katika hipothalamasi. Shughuli katika hipothalamasi baada ya lipopolisakaridi si sawa na hali ya kawaida ya endotheliamu inayodhibiti mkazo wa mishipa. Kipengele kinachotolewa na endotheliamu katika hali ya kawaida wakati seli zinakuzwa pamoja si sawa na upanuzi wa mishipa unaochochewa na agonisti. Seli za ateri ya mapafu zilizokuzwa maabara katika bluu ya methilini ya 10 micromolar si sawa na mzunguko wa damu wa binadamu. Kuunganisha yote hayo katika kauli kama vile bluu ya methilini huongeza shinikizo la damu kwa kuzuia oksidi nitriki kunapuuza tofauti zilezile ambazo vipimo vya udhibiti vilibuniwa kuhifadhi.
Ukaguzi wa mambo matatu huweka maelezo katika usahihi. Kwanza, taja isoformu: eNOS kwa mkazo wa kawaida wa mishipa, iNOS kwa mtiririko unaochochewa wakati wa uchochezi, na nNOS kwa mazingira ya nyuroni na baadhi ya majaribio ya vimeng'enya vilivyosafishwa. Pili, taja jinsi ishara ya oksidi nitriki ilivyotolewa: usanisi wa ndani, utolewaji wa kawaida kutoka endotheliamu, au kitu maalumu kinachotoa oksidi nitriki kama CYSNO, nitroprusidi, au MPANO, kwa kuwa kile thabiti hakikuathiriwa na bluu ya methilini ilhali vile visivyo thabiti viliathiriwa. Tatu, taja mkusanyiko na urejeshaji: urejeshaji kwa dismutasi ya superoksidi unaashiria kuhusika kwa superoksidi, kushindwa kwa katalasi kunatoa ushahidi dhidi ya peroksidi ya hidrojeni katika mfumo huo wa jaribio, uigaji kwa oksidasi ya ksantini unaonyesha kwamba athari hiyo inatosha, na vipimo vya vimeng'enya vilivyosafishwa vinatenganisha athari za moja kwa moja kwenye shughuli ya kichocheo na upotevu unaotokea njiani.
Muhtasari mfupi ni huu. Ni bora kuichukulia bluu ya methilini kama kitu kinachovuruga uashiriaji kutoka oksidi nitriki hadi GMP ya mzunguko katika sehemu nyingi kuliko kama kizuizi teule cha siklasi. Kulingana na mfumo wa jaribio na mkusanyiko, inaweza kupunguza ufungamanaji wa vipengele vya unakili vya iNOS, kuzuia moja kwa moja vimeng'enya vya NOS, kupunguza upatikanaji wa oksidi nitriki kupitia uzalishaji wa superoksidi, na kudhoofisha siklasi iliyowashwa na oksidi nitriki. Nafasi ya uashiriaji wa GMP ya mzunguko katika tafiti za mishipa na ulinganisho wa vitu vinavyotoa oksidi nitriki vinavyotumiwa katika vipimo vya seli kila moja inajadili mojawapo ya matawi hayo kwa undani zaidi, na mbinu zinazotumiwa kutenganisha athari za redoksi na athari za vimeng'enya inaeleza kwa nini dismutasi ya superoksidi pamoja na katalasi na kipimo cha udhibiti cha kitu thabiti kinachotoa oksidi nitriki huonekana mara nyingi katika maandiko haya ya utafiti.
Thamani ndogo ya GMP ya mzunguko baada ya bluu ya methilini huonyesha mnyororo uliokatika. Ni vipimo vya udhibiti pekee vinavyosema ni kiungo gani kilichokatika.