Bluu ya methilini na autofajia: AMPK, mTOR, na majaribio ya neuroni

Fikiria unafanya jaribio la seli, unaongeza bluu ya methilini, kisha unaona ukanda wa protini inayoitwa LC3-II ukizidi kuwa mweusi kwenye bloti yako. Ni rahisi kutaka kutangaza kwamba kiwanja hiki “huongeza autofajia” na kuendelea. Hitimisho hilo ni la haraka mno. Ukanda mweusi zaidi wa LC3-II unaweza kumaanisha kwamba seli inaunda vifuko vingi zaidi vya usafishaji, au kwamba vifuko hivyo vinajikusanya kwa sababu hatua ya uondoaji imezuiwa. Tafsiri hizo mbili zinaelekea pande tofauti, na maandiko ya kisayansi kuhusu bluu ya methilini katika neuroni yana mifano ya kila aina ya ushahidi. Makala hii inapitia kile kilichopimwa hasa, kipimo baada ya kipimo.

Makroautofajia, aina iliyochunguzwa hapa, ni mfumo wa seli wa kuchakata tena nyenzo kwa wingi. Kifuko cha utando kinachoitwa fagofori hukua kuzunguka protini na organeli zilizochakaa, hujifunga na kuwa autofagosomu, huungana na lisosomu, kisha shehena yake huvunjwa na kuachiliwa kwa matumizi tena. Neuroni hutegemea utaratibu huu kwa sababu hazigawanyiki na haziwezi kupunguza mkusanyiko wa sehemu zilizoharibika kwa kujigawa. Uchakataji upya unapokwama, taka hujikusanya. Unapofanya kazi, seli hupata tena malighafi wakati wa msongo.

Kilichoonyeshwa na jaribio moja la hipokampasi

Utafiti mkuu wa uchocheaji ulitumia seli za hipokampasi za panya za HT22 zilizowekwa kwenye msongo kwa kuondolewa seramu kwa saa 24. Hali hii huondoa vihisishi vya ukuaji na ishara za kusaidia uhai wa seli, na huchochea apoptosis pamoja na autofajia. Watafiti waliripoti kwamba bluu ya methilini ilipunguza vifo vya seli kwa namna iliyotegemea dozi, na kwamba ulinzi huu uliambatana na dalili za makroautofajia.

Mabadiliko ya viashiria yalikuwa mahususi. Madoa ya LC3B yaliyokuwa yamesambaa yalijipanga upya na kuwa nukta kuzunguka kiini, kuanzia takriban 20 nM ya bluu ya methilini, huku mwitikio mkubwa zaidi wa LC3-I na LC3-II ukiwa karibu na 1 μM. LC3B-I na LC3B-II zote ziliongezeka kwa kutegemea dozi na muda. Jambo muhimu ni kwamba timu ilifanya zaidi ya kupima LC3 kwa bloti ya wakati mmoja. Iliongeza 10 μM ya klorokwini, ambayo huzuia uondoaji kupitia lisosomu, na ikapata LC3-II ya juu zaidi pamoja na p62 iliyodumishwa katika seli zilizotibiwa kwa bluu ya methilini. Muundo huo wa matokeo unaunga mkono uvunjaji na uondoaji unaotegemea lisosomu badala ya mkusanyiko tu. Pia ilionyesha kwamba klorokwini ilibatilisha kwa kiasi athari ya kuzuia apoptosis, jambo linalounganisha ulinzi huo na njia ya autofajia na lisosomu katika modeli hii.

Matokeo ya uashiriaji ndiyo sehemu inayonukuliwa vibaya mara nyingi zaidi. Uashiriaji wa AMPK, uliopimwa kupitia AMPK iliyofosforilishwa na shabaha yake ya hatua inayofuata, ACC iliyofosforilishwa, uliongezeka katika saa 12 na 24 kwa namna iliyotegemea dozi. Kizuizi cha AMPK kinachoitwa Compound C, kilichotumika katika 20 μM wakati wa saa 4 za mwisho, kilipunguza ufosforilishaji wa ACC na uamilishaji wa LC3. Kwa upande mwingine, mTOR iliyofosforilishwa haikuonyesha ukandamizaji ulioweza kugunduliwa. Kwa hiyo, katika seli za hipokampasi zilizokuwa kwenye msongo, matokeo yalikuwa uchocheaji unaohusishwa na AMPK kupitia njia iliyoonekana kutotegemea mTOR. Muundo huohuo ulionekana katika panya hai, ambapo matibabu ya bluu ya methilini yalichochea viashiria vya makroautofajia katika koteksi na hipokampasi.

Uchocheaji si mtiririko uliokamilika

Hapa ndipo tofauti kati ya dhana hizi inapokuwa muhimu zaidi. Uchocheaji unamaanisha kwamba mifumo ya hatua za awali hutengeneza autofagosomu nyingi zaidi. Mtiririko unamaanisha kwamba shehena hupitia njia nzima: kutengwa, kukomaa, kuungana na lisosomu, kuvunjwa, na kuchakatwa kwa matumizi tena. Kila ongezeko la LC3-II linaweza kudaiwa kuwa uchocheaji tu hadi kipimo cha mtiririko kithibitishe hatua zilizobaki za safari.

Kipimo cha kawaida cha mtiririko hupima LC3-II wakati kuna na wakati hakuna kizuizi cha muda mfupi cha lisosomu, kama vile bafilomycin A1 au klorokwini. Ikiwa matibabu yanaongeza kweli kasi ya uzalishaji, kuzuia uvunjaji kunapaswa kuongeza LC3-II hata zaidi. Kiashiria cha pamoja cha mCherry-GFP-LC3 hutoa mtazamo wa pili: miundo hung'aa kwa rangi ya njano kabla ya kuungana na lisosomu, na kwa rangi nyekundu pekee baada ya asidi kuzima ishara ya GFP. Kwa hiyo, nukta nyingi zaidi zenye rangi nyekundu pekee zinaunga mkono maendeleo kuelekea autolisosomu zenye asidi. Kupungua kwa protini ya p62 kunaweza kuthibitisha uvunjaji na uondoaji wa shehena, lakini kuna tahadhari kwamba unukuzi wa p62 wenyewe huitikia msongo na unapaswa kuchunguzwa katika kiwango cha mRNA.

Orodha ya ukaguzi hapa chini inaonyesha kila kipimo kilichotumika katika maandiko haya, kile kinachopima, na kile kisichoweza kuthibitisha peke yake. Wasomaji wanaweza kuitumia tena kwa dai lolote la baadaye kuhusu makroautofajia, yakiwemo madai kuhusu kufunga na maisha marefu yanayotumia viashiria hivi.

Zingatia mtego mmoja wa matumizi ya maneno ambao jedwali hili husaidia kuuepuka. ACC iliyofosforilishwa ni umbo ambalo shughuli yake ya kimeng'enya imezuiwa. Kuongezeka kwake kunaonyesha matokeo ya utendaji wa AMPK, si uamilishaji wa ACC.

Kauli “kuzuia makroautofajia kuliondoa ulinzi wa neuroni” inahitaji usahihi huohuo. Katika modeli ya HT22, inamaanisha kwamba kuvuruga njia ya autofajia na lisosomu kuliondoa faida ya bluu ya methilini katika kuendelea kuishi kwa seli wakati seramu ilipokosekana. Inaunga mkono autofajia kuwa muhimu au kuchangia katika mazingira hayo ya maabara. Haithibitishi kwamba autofajia ndiyo njia pekee ya ulinzi ya kiwanja hiki, wala haithibitishi kwamba klorokwini hufanya kazi kupitia autofajia pekee. Mabadiliko ya kijeni yanayovuruga ATG5, ATG7, au ULK1 yangehitajika ili kuimarisha dai la uhusiano wa kisababishi.

Njia mbili kuelekea mfumo uleule

Ramani iliyorahisishwa husaidia. Msongo wa nishati huongeza AMPK, AMPK huamilisha kompleksi ya ULK1, na autofajia huanza. Vihisishi vya ukuaji na virutubisho huongeza mTORC1, mTORC1 huzuia ULK1, na autofajia hubaki bila kuanzishwa. Katika hatua zinazofuata ULK1, kompleksi ya Beclin-1 na VPS34 huanzisha uundaji wa fagofori, LC3-I huunganishwa na lipidi na kuwa LC3-II, autofagosomu hujifunga, huungana na lisosomu, kisha shehena huvunjwa huku p62 ikivunjwa na kuondolewa.

Mchoro unaweka kila matokeo ya bluu ya methilini kwenye ramani hii: matokeo ya hipokampasi karibu na tawi la AMPK, na matokeo ya seli tangulizi karibu na tawi la mTOR.

Mtazamo huu unaeleza tofauti inayoonekana na utafiti wa pili wa Xie. Katika seli tangulizi za neva za panya zilizokuwa zikizaliana, jaribio tofauti liligundua kwamba 5 μM ya bluu ya methilini ilizuia uzalianaji na kukuza hali ya kutogawanyika. Seli zenye Ki67 zilipungua katika siku 1 na 3, huku utofautishaji kuelekea neuroni uliokuwa tayari umeamuliwa ukiendelea bila kuathiriwa. Hapo, utaratibu ulipitia ukandamizaji wa uashiriaji wa mTOR: kupungua kwa jumla ya mTOR na mTOR iliyofosforilishwa, pamoja na kupungua kwa uzalishaji wa p70S6K na 4EBP1, na kupunguzwa kwa uzalishaji wa saiklini E1, B1, D1, na D2. Sifa kuu iliyoonekana ilikuwa hali ya kutogawanyika kwa seli tangulizi, ambayo waandishi waliihusisha na kucheleweshwa kwa uzee wa seli, si kuokoa seli za hipokampasi zilizokuwa kwenye msongo.

Hakuna ukinzani kati ya makala hizo mbili. AMPK na mTOR ni viunganishi vya ishara vinavyobadilika kulingana na mazingira, si swichi zisizobadilika. Seli inayofanana na neuroni na iliyo kwenye msongo inaweza kutumia AMPK bila kizuizi cha mTOR kinachoweza kupimwa, ilhali seli tangulizi inayochochewa kugawanyika inaweza kuitikia kiwanja kilekile kwa kupunguza shughuli za mifumo ya ukuaji inayotegemea mTOR. Aina ya seli, mazingira ya msongo, mkusanyiko, na wakati wa kipimo huamua tawi linalotawala. Hiyo pia ndiyo sababu athari za bluu ya methilini kwenye nishati ya mitokondria na redoksi zinapaswa kujumuishwa katika picha hii: kama mapitio ya mifumo ya ulinzi wa neuroni yanavyoeleza, kiwanja hiki hufanya kazi kama kibebaji mbadala cha elektroni, hutumia uashiriaji wa kioksidishaji-kinzani na wa kuzuia apoptosis, huzuia MAO na NOS, na huhusishwa na upyaishaji wa mitokondria kupitia uundaji wa mitokondria mipya na autofajia. Autofajia ni tawi moja la athari zake nyingi, si maelezo yote.

Kile ambacho majaribio haya hayaonyeshi

Kuondoa seramu huiga msongo wa usaidizi wa uhai wa seli na wa kimetaboliki katika chombo cha maabara. Hakuigi kufunga kwa kiumbe kizima: glukosi, asidi za amino, na chumvi hubaki kwenye kiowevu cha msingi cha ukuzaji, na hakuna tabia ya ulaji. Mikusanyiko ya ukuzaji wa seli kutoka 20 nM hadi 5 μM haiwezi kubadilishwa kuwa dozi za binadamu kwa hesabu tu, kwa sababu ufyonzwaji, ufungamanaji na protini, hali ya redoksi, umetaboli, mkusanyiko katika tishu, na muda wa kuathiriwa vyote hutofautiana.

Hakuna jaribio la binadamu lililoundwa kuonyesha mtiririko wa autofajia uliochochewa na bluu ya methilini kwa wagonjwa. Ushahidi wa utaratibu wa utendaji bado unatokana na tafiti za seli, tishu zilizo nje ya kiumbe, na wanyama, na mapitio bado yanaeleza ushahidi wa matumizi kwa binadamu kuwa wa awali. Kwa hiyo, tafiti hizi hazionyeshi kwamba bluu ya methilini inaiga kufunga, huongeza muda wa maisha ya binadamu kupitia autofajia, au hukamilisha mtiririko wa autofajia katika ubongo wa binadamu. Madai ya kuiga kufunga na ya maisha marefu yanahitaji ushahidi wake wa kliniki, na majaribio ya bluu ya methilini kwa binadamu kwa matumizi mengine hayawi majaribio ya autofajia kwa sababu tu ya uhusiano huo. Utafiti wa modeli za msongo wa virutubisho na maisha marefu unapaswa kusomwa huku mpaka huo ukizingatiwa.

Kwa makala inayofuata utakayosoma, tumia orodha ya ukaguzi kwa mpangilio. Kwanza uliza ni tawi gani lililobadilika: AMPK, mTOR, au hakuna kati ya hayo. Kisha uliza ikiwa matokeo ya LC3 yaliambatanishwa na kipimo cha mtiririko au yamesimama peke yake. Halafu angalia ikiwa kuzuia njia hiyo kuliondoa faida, na kwa njia gani. Utafiti unaojibu maswali yote matatu una msingi wa dai thabiti la utaratibu wa utendaji. Una ojibu la kwanza pekee umeonyesha ishara ya kuruhusu, na sehemu iliyobaki ya safari bado haijaainishwa.