Bluu mpya ya methilini na utiaji rangi wa retikulositi: rangi tofauti na mbinu ya seli hai

Mwanafunzi anajiandaa kuhesabu retikulositi, anaagiza bluu ya methilini, anaichanganya na damu, na haoni karibu chochote. Mwanafunzi mwenzake anatumia chupa yenye lebo ya bluu mpya ya methilini na anaona nyuzi za bluu zilizo wazi ndani ya baadhi ya seli nyekundu za damu. Mwanafunzi wa kwanza anadhani kwamba rangi katika chupa ya pili ni mpya zaidi au ina mkusanyiko mkubwa zaidi. Si mojawapo ya hayo. Ina molekuli tofauti.

Hili ndilo kosa la kimawazo linalosababisha mkanganyiko mwingi katika eneo hili. Jina linadokeza kwamba bluu mpya ya methilini ni kundi lililoboreshwa la bluu ya methilini. Kemia inaonyesha vinginevyo. Bluu mpya ya methilini N ni rangi tofauti ya fenothiazini yenye nambari yake ya Colour Index, mpangilio wake wa vikundi vya kibadala, na jukumu lake lililosanifishwa katika hematolojia. Tofauti hiyo inapokuwa wazi, sehemu nyingine za mbinu hii (kwa nini seli lazima ziwe hai zinapotiwa rangi, nini kinachohesabiwa kuwa retikulositi, miili ya Heinz inahusika wapi, na lini bluu angavu ya kresili inatumika) huwa rahisi kuelewa.

Jibu fupi

Bluu mpya ya methilini N, kitendanishi cha hematolojia, kwa kawaida hutambulishwa kama Basic Blue 24 katika rekodi ya PubChem ya bluu mpya ya methilini, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, fomula C18H22ClN3S. Bluu ya kawaida ya methilini ni kloridi ya methylthioninium, Basic Blue 9, katika rekodi yake ya PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, fomula C16H18ClN3S. Kimuundo, bluu mpya ya methilini ina vikundi viwili vya methili kwenye pete na minyororo ya pembeni ya ethylamino katika nafasi ambazo bluu ya methilini ina vikundi vya dimethylamino. Tofauti hiyo hubadilisha namna rangi inavyofanya kazi. Maandiko ya hematolojia yanaeleza bluu ya kawaida ya methilini kuwa rangi isiyofaa sana kwa retikulositi, na bluu mpya ya methilini kuwa inayotoa rangi iliyokolea zaidi na iliyo sawa zaidi, ulinganisho uliofupishwa katika mada ya ScienceDirect kuhusu bluu mpya ya methilini.

Ndiyo, bluu mpya ya methilini ni rangi ya supravitali. Utiaji rangi wa supravitali unamaanisha kutia rangi seli hai baada ya kuondolewa mwilini na kabla ya kufiksishwa, kama inavyofafanuliwa katika mapitio ya NCBI kuhusu kanuni za utiaji rangi wa supravitali. Bluu mpya ya methilini na bluu angavu ya kresili zote zimo katika kundi hili, na kiwango cha CLSI cha retikulositi kinataja wazi bluu mpya ya methilini kama rangi ya supravitali. Wakati mwingine wanafunzi huiweka mbinu hii katika kundi moja na utiaji rangi wa Romanowsky wa tabaka za damu zilizofiksishwa. Mtazamo huo haufai hapa. Fiksisha kwanza, na mbinu itaacha kufanya kazi.

Kwa wasomaji wanaofuatilia majina ya rangi yanayofanana, bluu ya methili dhidi ya bluu ya methilini inaeleza mkanganyiko tofauti na mkubwa zaidi kati ya rangi ya triarylmethane yenye chaji hasi na familia ya fenothiazini yenye chaji chanya. Muhtasari wa utiaji rangi wa maabara unaweka kazi ya supravitali katika muktadha wa mbinu za tabaka zilizofiksishwa, na mwongozo wa mofolojia ya seli za damu unaonyesha nafasi ya tathmini ya retikulositi katika utambuzi tofautishi mpana zaidi.

Tahadhari moja kuhusu katalogi: kuna aina tofauti ya bluu mpya ya methilini kama chumvi maradufu ya kloridi ya zinki chini ya CAS 6586-05-6. Kwa hiyo, sehemu ya mbinu inapaswa kutaja aina ya chumvi na msambazaji, si jina la kawaida pekee.

Utiaji rangi wa supravitali hufanya nini hasa

Retikulositi ni seli changa nyekundu ya damu ambayo imepoteza kiini chake lakini bado ina mabaki ya RNA ya ribosomu. Katika sampuli yenye unyevunyevu ambayo haijatiwa rangi, RNA hiyo haionekani. Rangi ya supravitali huingia kwenye seli hai na kusababisha RNA hiyo kutua au kukusanyika kuwa chembechembe na nyuzi za bluu, yaani nyenzo yenye muundo wa wavu na nyuzi inayoonekana kwa lenzi ya kuzamishwa katika mafuta. Kwa hiyo, mtandao huo ni zao la utiaji rangi, si kiunzi kilichokuwapo tayari kikisubiri rangi. Ndiyo sababu vigezo vya utaratibu (mkusanyiko wa rangi, bafa, uwiano wa damu kwa rangi, halijoto, muda) ni muhimu sawa na jina la rangi.

Matokeo yake kwa utendaji ni mpangilio madhubuti wa hatua: kwanza changanya damu iliyozuiwa kuganda na rangi, iache iatamie, kisha tengeneza tabaka nyembamba na uzichunguze bila kufiksishwa na bila rangi ya pili. Kufiksisha kabla ya kutia rangi, au kutumia rangi ya pili inayoficha nyuzi hafifu, huharibu taarifa ambayo hesabu hutegemea.

Utaratibu wa kuhesabu retikulositi kwa bluu mpya ya methilini

Hakuna fomula moja inayotumika kila mahali, kwa hiyo ripoti ile iliyotumika. Matoleo matatu yaliyoandikwa yanaonyesha utofauti uliopo.

Utaratibu wa jadi wa aina ya Brecher hutumia takribani asilimia 0.5 ya bluu mpya ya methilini pamoja na oksalati ya potasiamu, iliyochanganywa kwa ujazo sawa na damu yenye EDTA iliyochanganywa vizuri, kisha kuachwa iatamie kwa dakika 10 hadi 15 hivi katika halijoto ya kawaida ya chumba. Baada ya kuchanganya tena kwa upole, tabaka nyembamba zenye umbo la kabari hutayarishwa, hukaushwa kwa hewa, na huchunguzwa bila kufiksishwa chini ya lenzi objektivu ya mafuta ya 100x. Utaratibu wa NCBI wa kuhesabu retikulositi unaeleza mtiririko huu wa kazi na fremu ya kuhesabia inayotumika pamoja nao.

Toleo la Dacie na Lewis hutumia asilimia 1.0 ya bluu mpya ya methilini katika myeyusho wa chumvi wenye sitrati, iliyochanganywa na ujazo wa damu wa mara 2 hadi 4, na kuwekwa katika 37 C kwa dakika 15 hadi 20 kabla ya kutengeneza tabaka. Utekelezaji wa hivi karibuni wa kuoanisha utaratibu wa CLSI H44 ulitumia myeyusho wenye mkusanyiko mdogo zaidi wa asilimia 0.1 katika myeyusho wa chumvi wenye bafa ya fosfati katika pH 7.4, ukiatamiwa katika 20 C kwa dakika 10 bila kufiksishwa, kama ilivyoripotiwa katika utafiti wa 2026 wa kuoanisha NMB.

Kanuni za kuhesabu ni zilezile katika matoleo yote. Hesabu seli kama retikulositi ikiwa ina angalau chembechembe mbili tofauti zilizotiwa rangi ya bluu au vipande vya nyuzi, jambo linaloondoa amana ya rangi iliyojitenga. Hesabu angalau seli nyekundu za damu 1,000 katika kazi za kawaida na uripoti retikulositi kama asilimia. Asilimia inapokuwa ndogo, takwimu huhitaji seli nyingi zaidi. Mapitio ya mbinu ya CLSI H44 yanaeleza kwamba karibu na asilimia 1 ya retikulositi, takribani seli 4,400 zinahitajika ili kufikisha utofauti wa hesabu kwenye asilimia 5, katika mapitio ya CLSI H44 katika De Gruyter. Diski ya Miller ya lenzi ya macho hurahisisha kuhesabu idadi kubwa. Chuja rangi au tayarisha rangi mpya, kwa sababu mashapo yanafanana na mijumuisho ya chembechembe ndani ya seli.

Miili ya Heinz katika sampuli ileile

Tabaka ileile iliyotiwa rangi ya supravitali inaweza pia kuonyesha miili ya Heinz, ambayo ni mikusanyiko ya hemoglobini iliyooksidishwa na kupoteza muundo wake wa kawaida, badala ya mabaki ya RNA. Katika sampuli za bluu mpya ya methilini, huonekana kama miili ya mviringo, mara nyingi ikiwa mmoja mmoja na karibu na utando, yenye rangi ya bluu hafifu zaidi kuliko nyenzo yenye muundo wa wavu na nyuzi. Haihifadhiwi vizuri wakati wa kufiksisha na kutia rangi ya pili, kwa hiyo chunguza tabaka isiyofiksishwa. Utaratibu wa hivi karibuni uliotumia mikrolita 20 za damu yenye EDTA pamoja na mikrolita 20 za bluu mpya ya methilini ya asilimia 1 na muda wa kuatamisha wa dakika 15 ulipima idadi ya seli zenye miili ya Heinz kati ya erithrositi 250, katika utafiti wa PMC ulioripoti utaratibu huo.

Tofauti mbili huzuia usomaji potovu. Kwanza, urujuani ya methili na urujuani ya fuwele hutia miili ya Heinz rangi iliyokolea zaidi kuliko bluu mpya ya methilini, kama ilivyoelezwa katika mada ya ScienceDirect kuhusu miili ya Heinz. Bluu mpya ya methilini ni chaguo linalorahisisha kazi wakati retikulositi na miili ya Heinz zinatathminiwa pamoja, si rangi yenye nguvu zaidi iliyokusudiwa mahsusi kwa miili ya Heinz. Pili, mijumuisho ya HbH katika ubebaji wa sifa ya thalasemia alfa hutokeza vitone vingi vidogo kote katika seli baada ya utiaji rangi wa supravitali, ilhali miili ya Heinz ya kawaida ni michache zaidi, mikubwa zaidi, na mara nyingi huhusiana na utando. Amana ya rangi ni kitu cha tatu kinachoweza kufanana nayo: huwa nje ya kiwango cha fokasi cha seli na hutofautiana kati ya maeneo ya kutazamia.

Bluu angavu ya kresili dhidi ya bluu mpya ya methilini

Rangi zote mbili ni rangi za supravitali kwa retikulositi, lakini usanifishaji unapendelea mojawapo. Mbinu ya retikulositi ya CLSI H44-A2, iliyoandaliwa kwa ushirikiano na Baraza la Kimataifa la Usanifishaji katika Hematolojia na kuorodheshwa kwenye ukurasa wa kiwango cha CLSI H44, inateua utiaji rangi wa damu yenye EDTA kwa bluu mpya ya methilini kuwa mbinu ya ulinganisho ya kuhesabu kwa mkono. Mafundisho ya jadi ya hematolojia yanakubaliana kuhusu mwonekano: bluu mpya ya methilini hutia nyuzi rangi iliyokolea zaidi na iliyo sawa zaidi, ilhali bluu angavu ya kresili hutofautiana zaidi kati ya makundi ya uzalishaji na sampuli.

Hadhi hiyo inahitaji ufafanuzi wa mipaka yake. Mwongozo wa ICSH wa kutathmini vifaa vya uchanganuzi unakubali uchunguzi wa hadubini wa bluu mpya ya methilini kwa mkono kuwa njia ya ulinganisho wa marejeo, lakini unaeleza kwamba hutegemea uamuzi wa mchunguzi na una usahihi wa kurudiarudia ulio mdogo kwa kiasi fulani, huku ukipendelea taratibu za marejeo za saitometria ya mtiririko zinapopatikana. Ulinganisho wa 2022 wa sampuli 100 ulipata upendeleo mdogo zaidi wa kimfumo dhidi ya kifaa chake cha uchanganuzi kwa bluu angavu ya kresili kuliko kwa bluu mpya ya methilini, kama ilivyoripotiwa katika ulinganisho wa PMC wa mbinu za utiaji rangi. Muhtasari unaoweza kutetewa kwa wanafunzi ni huu: tumia bluu mpya ya methilini kama mbinu ya ulinganisho iliyosanifishwa ya kuhesabu kwa mkono, thibitisha mbinu yoyote ya eneo husika ya bluu angavu ya kresili kwa kuilinganisha nayo au na mfumo otomatiki, na tarajia mtawanyiko mpana zaidi wa matokeo kutoka uchunguzi wa hadubini wa kuhesabu kwa mkono katika hali zote mbili. Maandiko ya awali ya usanifishaji pia yalipendekeza Azure B iliyosafishwa kama mbadala safi zaidi kikemia kwa sababu makundi ya rangi za kibiashara yalitofautiana, katika utafiti wa Marshall kuhusu Azure B, jambo linaloeleza kwa nini kiwango cha ubora wa kitendanishi bado kinatajwa katika mijadala ya mbinu.

Kuepuka makosa ya kawaida

Makosa manne yanasababisha kushindwa kwa utayarishaji mwingi wa sampuli. Kuagiza bluu ya kawaida ya methilini badala ya bluu mpya ya methilini N husababisha utiaji rangi hafifu kutokana na kemia, si mbinu. Kufiksisha au kutia rangi ya pili kabla ya kuchunguza huondoa ishara ya supravitali. Kuhesabu mashapo ya rangi kama chembechembe huongeza matokeo kupita kiasi, jambo linalozuiwa na kanuni ya chembechembe mbili na rangi iliyochujwa. Kuhesabu seli chache mno wakati asilimia ya retikulositi ni ndogo hutokeza nambari inayoonekana kuwa sahihi lakini yenye mipaka mipana ya kujiamini ya kitakwimu. Kila kosa lina dalili ileile: mchunguzi wa hadubini huilaumu hadubini kwa matokeo yaliyoamuliwa na hatua ya kitendanishi.