Metylenblått och Bartonella: laboratoriefynd och den kliniska evidensens begränsningar

En odlingsskål och en patient har ett ord gemensamt, infektion, men inte samma innebörd. I skålen är infektion ett antal kolonier på agar. Hos patienten handlar det om bakterier inuti celler och kärl, läkemedel som rör sig genom blod och vävnad och ett immunsystem som gör en del av arbetet. Blandar man ihop de två börjar ett slående laboratorieresultat se ut som en behandling. Håller man dem åtskilda blir samma resultat vad det faktiskt är: en anledning att göra nästa experiment.

Att upprätthålla den åtskillnaden är hela syftet med denna genomgång av metylenblått och Bartonella. Två laboratoriestudier från en och samma forskargrupp testade metylenblått mot Bartonella henselae i icke-växande tillstånd. Båda rapporterade stark aktivitet i glas och plast. Ingen av dem testade en människa.

Varför forskare testar den stationära fasen

De flesta antibiotikatester använder växande celler. Den modellen missar ett svårare fall: celler som har slutat dela sig och tolererar läkemedel som dödar deras växande motsvarigheter.

Bartonella kan finnas kvar i kroppen, bland annat inuti erytrocyter och endotelceller. Därför undersökte gruppen vilka godkända läkemedel som kan döda B. henselae efter att bakterien gått in i stationär fas. Ett lågt MIC-värde mot växande celler förutsade inte avdödning i stationär fas. Rifampicin hade ett mycket lågt MIC-värde men dödade stationära celler dåligt, medan ämnen med högre MIC-värden dödade dem väl. Läsare som vill ha en generell metod för att läsa den här typen av artikel hittar den i guiden till att läsa forskning om metylenblått.

Första screeningen: Li och kollegor, 2019

Screeningen av stationär fas från 2019 i Antibiotics använde en enda stam, B. henselae JK53, som odlades i Schneider-medium med 10 procent fetalt bovint serum vid 37 C med 5 procent CO2. Endagsodlingarna bestod främst av spridda, delande celler. Femdagarsodlingarna, med omkring 10 upphöjt till 8 kolonibildande enheter per mL, betraktades som stationär fas och innehöll synliga aggregat.

Analysen använde SYBR Green I med propidiumjodid, kalibrerat mot blandningar av levande celler och celler avdödade med isopropanol. Eftersom metylenblått är starkt färgat bekräftades träffarna med mikroskopi och därefter med koloniräkning på blodagar, det striktare utfallsmåttet.

Av 1,581 godkända läkemedel vid 50 mikromolar lämnade metylenblått 16 procent livskraftiga celler enligt plattläsaren och 25 procent enligt mikroskopin. Daptomycin gav 21 procent, flera azoler gav 22 till 27 procent, gentamicin 32 procent, erytromycin 66 procent och ciprofloxacin 74 procent. Pyrviniumpamoat såg starkare ut i plattläsaren men kunde inte bedömas med mikroskopi på grund av sin egen fluorescens.

Mot växande B. henselae var MIC-värdet för metylenblått 0.08 till 0.16 mikrogram per mL. Mot fem dagar gamla stationära celler vid 5 mikrogram per mL sjönk kolonitalet till inga detekterbara kolonier efter en dags exponering, vilket motsvarade daptomycin och pyrviniumpamoat vid deras testade koncentrationer. Ett separat försök med tidsberoende avdödning använde 10 mikrogram per mL. Detta är exponeringsnivåer i laboratoriet, inte doser, och artikeln anger dem som sådana. Ett citerat värde för maximal plasmakoncentration hos människa på omkring 3.9 mikrogram per mL förekommer i artikeln enbart som bakgrundsinformation. Översikten över metylenblåtts farmakokinetik förklarar varför ett plasmavärde inte kan tolkas som ett vävnadsvärde.

Två begränsningar anges uttryckligen i artikeln. Det fanns ingen biofilmsmodell och inga tester av kombinationer med metylenblått. De fem dagar gamla aggregaten var kluster i flytande odling i stationär fas, inte ett validerat biofilmsexperiment. Författarna efterlyste djurförsök, kombinationsstudier, biofilmsstudier och tester på andra Bartonella-arter.

Kombinationer och celler från biofilm: Zheng och kollegor, 2020

Uppföljningen från 2020 i BMC Microbiology behöll samma stam och medium men övergick till sex dagar gamla stationära odlingar och lade till två saker som den första artikeln saknade: kombinationer med två läkemedel och en modell med celler från biofilm.

För enskilda läkemedel vid samma koncentration, 5 mikrogram per mL under 24 timmar, lämnade metylenblått 3.2 gånger 10 upphöjt till 4 kolonibildande enheter per mL, jämfört med en kontroll på omkring 2.8 gånger 10 upphöjt till 10. Ciprofloxacin, gentamicin och nitrofurantoin lämnade färre kolonier vid samma tidpunkt. Det skiljer sig från resultatet 2019, då samma nominella nivå gav inga detekterbara kolonier efter en dag. Odlingarnas ålder, täthet och hantering skilde sig åt, så avdödningen var reproducerbar till sin riktning men inte identisk i omfattning. Denna variation mellan försöken är en anledning till att vanliga säkerhets- och interaktionskontroller behandlar laboratoriepotens som något skilt från klinisk effekt.

Kombinationsscreeningen är den mest citerade delen. Varje komponent hölls vid 5 mikrogram per mL. Både azitromycin plus metylenblått och rifampicin plus metylenblått gav inga detekterbara kolonier i stationär fas efter 24 timmar, liksom båda ciprofloxacinkombinationerna. Endast dessa fyra av 25 testade par gjorde det. Ingen formell synergianalys utfördes, så den korrekta termen är en aktiv kombination under dessa förhållanden, inte bevisad synergi.

Biofilmsexperimentet testade celler som hämtats från en ung, sönderdelad biofilm, inte penetration i en intakt, mogen biofilm. Kulturerna odlades i fem dagar, späddes och överfördes till brunnsplattor i ytterligare fem dagar, bekräftades med kristallviolettfärgning och skrapades sedan loss före läkemedelsexponeringen. Vid 5 mikrogram per mL minskade metylenblått ensamt kolonitalet till 2.3 gånger 10 upphöjt till 2 vid dag 6, bland de bästa enskilda medlen, men inte till noll. Båda kombinationerna med metylenblått nådde noll vid dag 6, liksom båda ciprofloxacinkombinationerna.

Författarna lyfte fram samma begränsningar som en noggrann läsare skulle göra: ung, avskrapad biofilm i stället för gammal, intakt biofilm, en praktiskt vald koncentration för alla läkemedel i stället för varje läkemedels egen realistiska toppkoncentration, endast utvalda par med azitromycin eller rifampicin, en enda stam, inga djur och inga patienter. Senare studier med tre läkemedel föreslogs men rapporterades inte.

Jämförelse av studieupplägg

Tabellen sammanfattar artikelns poäng. Allt till vänster om den sista kolumnen är odlingsarbete. Ingenting i någon av artiklarna hör hemma i den sista kolumnen.

Bartonella är inte Borrelia

Båda artiklarna nämner Borrelia burgdorferi, spiroketen som orsakar borrelia, eftersom färgämnesanalysen kom från tidigare arbete med Borrelia i stationär fas i samma laboratorium, där även metylenblått och daptomycin hade identifierats som träffar. Den historiken ger användbar bakgrund och är en vanlig källa till fel.

Inget experiment i någon av Bartonella-artiklarna testar Borrelia sida vid sida med Bartonella. Organismerna skiljer sig åt, medierna skiljer sig åt, koncentrationerna skiljer sig åt, och den föreslagna membraneffekten av metylenblått hos Bartonella beskrevs som en spekulation som behövde undersökas vidare. Resultat bör inte överföras mellan arter, och ingen av artiklarna stöder breda påståenden om parasiter. Jämförelsen av persisterceller hos Borrelia och Bartonella håller därför isär de två forskningsfälten.

Varför odlingsresultat inte kan omvandlas till ett behandlingsprotokoll

Sökintresset för ett behandlingsprotokoll med metylenblått mot Bartonella är förståeligt. Dessa artiklar är skälet till att den formuleringen bör ses som en varningssignal snarare än en inköpslista.

För det första är 5 mikrogram per mL i en brunn inte en ordination. Värdet säger inget om absorption, distribution, proteinbindning, intracellulär penetration eller tolerabilitet. Författarna valde det som ett grovt genomsnitt av antibiotikas toppkoncentrationer och angav att framtida studier bör använda varje läkemedel vid dess egen realistiska nivå.

För det andra betyder noll kolonier inga kolonier under just dessa utplateringsförhållanden, inte steril vävnad. Persisterceller, intracellulära bakterier och provtagningens begränsningar ligger alla utanför agarplattan.

För det tredje kan kombinationer som steriliserar en brunn misslyckas eller orsaka skada i en kropp. Azitromycin plus metylenblått och rifampicin plus metylenblått är laboratoriepar vid laboratorieexponeringar. Utan farmakokinetiska djurstudier och kontrollerade humandata finns ingen fastställd dos, ingen behandlingstid och inget förhållande mellan nytta och risk. Den som överväger alternativ bör diskutera dem med en läkare och läsa om när användning av metylenblått kräver medicinsk övervakning innan några slutsatser dras från data från odlingsskålar.

Den begränsade slutsats som dessa artiklar faktiskt stöder är denna: metylenblått har reproducerbar aktivitet mot icke-växande B. henselae JK53 in vitro, även i laboratoriekombinationer med två läkemedel, och de starkaste resultaten för kombinationer och celler från biofilm kommer från studien 2020. Allt annat, inklusive om den aktiviteten har betydelse för bartonellos hos människa, är fortfarande oprövat.