EMB-agar kontra MacConkey-agar: val och tolkning av medier

En student stryker ut samma vattenprov på två plattor. På den ena uppträder mörka kolonier med grön metallisk glans. På den andra uppträder klart rosa kolonier med en disig halo. Båda plattorna inokulerades från samma rör, inkuberades sida vid sida och avlästes vid samma tidpunkt. Studenten frågar vilken platta som är rätt.

Båda plattorna är rätt. De besvarar olika frågor. Förvirringen uppstår när de två medierna behandlas som utbytbara screeningmedier för tarmbakterier. De har ett gemensamt syfte, nämligen att selektera gramnegativa enteriska organismer och skilja laktosfermenterare från icke-fermenterare, men de uppnår detta med olika kemi och olika visuell logik. När man väl ser de två bakomliggande principerna blir val av platta och avläsning av kolonier rutinmässigt.

Det korta svaret

EMB-agar använder två färgämnen, eosin Y och metylenblått, som fyller dubbla funktioner: de hämmar tillväxten av grampositiva organismer och fälls ut kring starka syraproducenter, vilket skapar mörka kolonier, klassiskt med metalliskt grön glans hos Escherichia coli. MacConkey-agar separerar funktionerna: gallsalter plus kristallviolett hämmar grampositiva organismer, laktos möjliggör fermentation och neutralrött visar syraproduktion som rosa eller röda kolonier. Om uppgiften är att ge en tydlig presumtiv demonstration av E. coli har EMB en självklar plats. Om uppgiften är en enkel uppdelning i rosa respektive färglösa laktosfermenterare och icke-fermenterare, särskilt i arbetsflöden för feces- eller urinprover, är MacConkey vanligtvis enklare att läsa av. Ingen av plattorna identifierar en organism enbart utifrån färg.

EMB: färgämnen som selekterar och indikerar samtidigt

EMB-principen kombinerar selektion och indikering i samma molekyler. ASM:s protokoll för eosin-metylenblå-agar beskriver EMB som både selektivt och differentiellt, där färgämnesparet hämmar många grampositiva organismer samtidigt som laktosfermentation driver upptag och utfällning av färgämnen. En standardformulering enligt Levine innehåller pepton, laktos, fosfat, eosin Y, metylenblått och agar, enligt FDA BAM-metoden för Levine EMB-agar. Observera att äldre EMB-recept ibland innehöll sackaros tillsammans med laktos, medan Levine EMB innehåller laktos utan sackaros, så dokumentera vilken formulering laboratoriet använder.

Att läsa EMB innebär att läsa färgämnenas beteende. Kraftig laktosfermentation producerar tillräckligt mycket syra för att driva omfattande färgämnesutfällning, vilket ger E. coli dess mörkt blåsvarta centra och, i det klassiska fallet, en grön metallisk glans i reflekterat ljus. Svagare fermenterare som Enterobacter och Klebsiella växer vanligtvis som rosa till lila, mukösa kolonier utan denna glans. Icke-fermenterare som Salmonella, Shigella och Proteus växer i allmänhet som färglösa eller genomskinliga kolonier eftersom de inte producerar den snabba syraökning som fäller ut färgämnena. Grampositiva organismer hämmas vanligtvis, även om graden av hämning varierar beroende på stam och produkt. Den fullständiga kemin bakom beredning av färgämnen, inklusive varför metylenblått över huvud taget beter sig som ett katjoniskt färgämne, hör hemma i en separat diskussion om färgämnesformuleringar, medan den allmänna mikroskopikontexten finns i en atlas över färgningsmetoder. Den här artikeln fokuserar på val och avläsning av plattor.

Figuren ovan är illustrativ. Den visar den visuella logik man kan förvänta sig: mörka kolonier med glans, rosa mukösa typer och bleka typer på EMB, jämfört med rosa respektive bleka typer på MacConkey. Använd den för att lära dig mönstret och bekräfta därefter varje bedömning mot fotograferade kontroller och produktbladet för exakt det medium som används på laboratoriebänken.

MacConkey: separata funktioner, enklare visuell regel

MacConkey-principen tilldelar varje funktion en separat ingrediens. ASM:s protokoll för MacConkey-agar använder samma indelning i selektivt och differentiellt medium, och FDA BAM-metoden för MacConkey-agar anger de verksamma komponenterna: peptoner, laktos, gallsalter, salt, neutralrött, kristallviolett och agar. Gallsalter plus kristallviolett selekterar mot grampositiva organismer. Laktos utgör fermentationssubstratet. Neutralrött fungerar som pH-indikator och blir rosa till rött där syra bildas, ibland med utfälld galla kring starka fermenterare.

Avläsningsregeln är avsiktligt enkel: rosa betyder laktosfermenterare, färglös eller blek betyder icke-fermenterare. E. coli framträder rosa till röd, ofta med en halo av gallutfällning. Klebsiella och Enterobacter framträder rosa och ofta mukösa på grund av sina kapslar. Salmonella, Shigella, Proteus och många andra gramnegativa stavar framträder färglösa. En praktisk fördel i undervisningslaboratorier är att gallsalter i allmänhet minskar svärmning hos Proteus, vilket gör det enklare att erhålla isolerade kolonier på MacConkey än på icke-selektiva medier, även om hämningen inte är absolut och saltfria alternativ finns när kontroll av svärmning är prioriterad.

Den molekylära orsaken till att färgämnena beter sig på detta sätt kan spåras till laddning och struktur. Metylenblått är ett katjoniskt fenotiazin-färgämne vars struktur och egenskaper förklarar dess affinitet för sura bakterieytor, samma affinitet som verkar när det fälls ut i sura zoner på EMB.

Jämförelse i korthet

Läs tabellen som en beslutsprocedur. När övningen kräver att studenterna ser en gradient i fermentationsstyrka med en tydlig slutpunkt visar EMB detta. När övningen kräver en snabb binär uppdelning före biokemisk bekräftelse visar MacConkey detta.

Vilket medium för vilket prov

För vattenövningar som syftar till presumtiv igenkänning av fekala koliformer eller E. coli är EMB attraktivt eftersom glansen är visuellt distinkt. MacConkey fungerar också för enteriska gramnegativa organismer och har historiskt använts för vattenprover, men ingen av plattorna ersätter en regulatorisk vattenmetod, som beroende på test kan föreskriva medier som modifierat mTEC eller MI. Kontrollera den metod som laboratoriet är skyldigt att följa.

För fecesliknande separationer av fermenterare från icke-fermenterare är MacConkey i allmänhet det mer användbara av de två. Praktiskt arbete med fecesprover för Salmonella eller Shigella kompletteras normalt med mer selektiva enteriska medier som XLD eller Hektoen enteric i stället för att enbart förlita sig på MacConkey.

För undervisning med urinprover som efterliknar kliniskt arbetsflöde kombineras MacConkey med blodagar. MacConkey ger den tidiga sorteringen av gramnegativa organismer, medan blodagar återvinner organismer som MacConkey hämmar. Denna kombination är standard i kliniska beskrivningar av upplägg för urinodling.

För renodlad konceptundervisning bör båda användas. EMB visar att fermentationsstyrka spelar roll och att en molekyl kan fylla två funktioner. MacConkey visar modulär design: selektor, substrat och indikator hålls åtskilda. Studenter som stryker ut en känd E. coli, en känd Klebsiella aerogenes och en känd Salmonella sida vid sida på båda medierna blandar sällan ihop de två principerna igen.

Tolkningsfel som återkommer varje termin

Det vanligaste felet är identifiering enbart utifrån färg. Rosa på MacConkey kan vara E. coli, Klebsiella, Enterobacter eller en annan fermenterare. Färglös kan vara Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas eller en annan icke-fermenterare. Färg är en screeningfenotyp som styr det bekräftande arbetet, till exempel gramfärgning, oxidas, biokemiska paneler eller instrumentbaserad identifiering, inte ett artnamn.

Det andra felet är att övertolka utebliven glans. Vissa äkta E. coli-kolonier, särskilt isolerade sådana, ger liten eller ingen metallisk glans på EMB. Avsaknad av glans utesluter inte E. coli, och förekomst av glans bevisar inte att det är E. coli. Behandla glansen som en presumtiv ledtråd.

Det tredje felet är att jämföra plattor med olika ålder. Fördröjda laktosfermenterare kan bli rosa på MacConkey efter förlängd inkubation, vilket gör den tydliga uppdelningen mellan fermenterare och icke-fermenterare mindre skarp. Läs av vid den tidpunkt som laboratoriet anger och registrera inkubationstiden tillsammans med resultatet.

Det fjärde felet är att tolka blandad tillväxt som en enda organism. En rosa koloni bredvid en färglös koloni visar två fenotyper, inte en mellanform. Välj välisolerade kolonier och bearbeta varje morfotyp separat. Mukös textur innebär en liknande fallgrop: både Klebsiella och Enterobacter kan se mukösa ut, så kapseln ensam avgör aldrig namnet. Organismen som tidigare lärdes ut som Enterobacter aerogenes klassificeras nu som Klebsiella aerogenes, vilket förklarar varför äldre tabeller och nyare etiketter kan verka motsäga varandra.

Kontroller och en avslutande regel

Kör fotograferade eller färska kontroller vid varje tillfälle: E. coli för reaktionen hos en stark fermenterare, Klebsiella aerogenes för mukös fermentation utan den klassiska glansen, en Salmonella-stam för den färglösa reaktionen hos en icke-fermenterare och Staphylococcus aureus för att bekräfta hämning av grampositiva organismer på den exakta produkt som används. Anpassa stamnummer och acceptanskriterier efter tillverkarens produktblad, eftersom selektiviteten förändras med innehållet av galla, kristallviolett och färgämnen.

Kom ihåg en mening vid laboratoriebänken. EMB använder färgämnen som både selekterar och signalerar, vilket ger en tydlig E. coli-signal till priset av en mer nyanserad avläsning. MacConkey skiljer selektion från indikering, vilket ger en enkel uppdelning i rosa respektive bleka kolonier till priset av mindre information om fermentationsstyrka. Välj det medium vars princip motsvarar frågan, bekräfta färgen med lämpliga tester, så slutar de två plattorna att konkurrera och börjar komplettera varandra.