Ngukur spesies oksigen réaktif dina eksperimen métilén biru

Dua laboratorium ngalaksanakeun naon anu ku masing-masing disebut eksperimen antioksidan métilén biru. Hiji ngalaporkeun yén zat warna éta ngurangan spesies oksigen réaktif. Nu séjén ngalaporkeun yén éta ngahasilkeunana. Duanana némbongkeun kurva réspon dosis anu écés. Duanana jujur. Bédana lain lantaran panipuan atawa kurang kamampuh. Tapi lantaran dua kelompok éta ngukur hal anu béda dina kaayaan cahaya anu béda, maké probe anu ngajawab patalékan anu béda, tuluy ngajelaskeun duanana jawaban ku kecap anu sarua: ROS.

Métilén biru téh molekul anu hésé diukur sacara taliti lantaran éta milu dina réaksi kimia anu sakuduna dititénan ku éta. Dina poék, éta mindah-mindahkeun éléktron antara donor jeung akséptor sarta balik deui kana wangun awalna, siap ngulang siklus. Dina cahaya, éta jadi fotosensitiser, ngahontal kaayaan triplet tereksitasi anu ngamungkinkeun éta mindahkeun énergi ka oksigen pikeun nyieun oksigen singlet atawa mindahkeun éléktron pikeun nyieun radikal jeung hidrogén péroksida. Probe naon waé anu diasupkeun kana sistem éta bisa dioksidasi, diréduksi, dileungitkeun warnana, atawa sinyal optikna kahalangan ku zat warna éta sorangan. Ku kituna, patalékan munggaran tina bacaan ROS lain sabaraha angkana. Tapi naon anu sabenerna dideteksi ku uji éta, sarta naon pangaruh zat warna éta kana ujina.

Amplex Red: uji hidrogén péroksida anu dikalibrasi

Kombinasi métilén biru jeung Amplex Red mangrupa pasangan anu pangkuatna dasar ilmiahna dina literatur ieu, lamun disusun kalayan bener. Réaksi kimiana spésifik: péroksidase horseradish ngagunakeun hidrogén péroksida pikeun ngaoksidasi substrat Amplex jadi produk fluoresén, résorufin, dina stoikiométri kira-kira hiji banding hiji. Péroksida tina sampel jadi fluoresénsi dina detéktor. Teu aya anggota séjén tina kelompok ROS anu ilahar anu langsung ngajalankeun réaksi éta.

Kaunggulan anu pangpentingna nyaéta kalibrasi. Panalungtik anu taliti nguji standar péroksida anu geus dipikanyaho dina larutan panyangga anu sarua, kalayan konséntrasi péroksidase jeung substrat anu sarua, waktu inkubasi anu sarua, sarta setélan optik anu sarua, tuluy ngabandingkeun bacaan sampel jeung kurva éta. Dina panalungtikan mitokondria otak anu diisolasi anu jadi dasar métode ieu, panulis ngalakukeun persis kitu, nambahkeun péroksida dina jumlah anu geus dipikanyaho dina ahir unggal runtuyan uji, sarta angkana dilaporkeun minangka laju dina pikomol per menit per miligram protéin, lain unit fluoresénsi arbitrér. Éta anu ngarobah pendar cahaya jadi pangukuran.

Tilu rinci tina panalungtikan éta pantes diturutan. Kahiji, panulis mariksa sinyal ku katalase, anu ngancurkeun péroksida. Paningkatan fluoresénsi anu dipicu ku métilén biru eureun nalika katalase ditambahkeun, mastikeun yén sinyal éta asalna tina péroksida, lain artéfak optik. Kadua, maranéhna nguji panyinaran sacara langsung ku ngawatesan berkas éksitasi maké panutup, sangkan sampel nampa saperdalapan dosis cahaya normal, sarta sinyal ngan turun salapan persén. Leuwih ti salapan puluh persén péroksida anu dilaporkeun ku maranéhna henteu gumantung kana cahaya pangukuran. Katilu, maranéhna ngukur éliminasi péroksida sacara misah maké éléktroda sarta manggihan yén zat warna éta boh ningkatkeun produksi boh ngalambatkeun panyingkiranna. Probe anu ngan ngalaporkeun fluoresénsi neto bakal ngahijikeun dua pangaruh éta jadi hiji.

Uji ieu tetep boga kaayaan anu bisa nyababkeun gagal, sarta métilén biru bisa nyababkeun sababaraha di antarana. Zat warna éta nyerep cahaya sacara lega dina wewengkon beureum anu sarua jeung tempat résorufin mancarkeun cahaya, jadi dina konséntrasi zat warna anu luhur, sampel bisa ngahalangan sinyalna sorangan ngaliwatan pangaruh saringan internal. Ku sabab éta, standar kudu ngandung konséntrasi zat warna anu sarua jeung sampel. Amplex Red ogé bisa ngalaman fotooksidasi sorangan, sarta produkna, résorufin, bisa asup kana siklus fotorédoks anu ngahasilkeun supéroksida jeung péroksida; ieu penting pisan lamun eksperimen ogé nyaangan fotosensitiser. Cara praktis pikeun ngungkulanana nyaéta nyinaran sampel métilén biru heula, tuluy nguji alikuotna maké réagen Amplex dina poék, lain nyaangan zat warna jeung probe babarengan. Panungtungan, supéroksida dismutase lain saukur ngurangan sinyal Amplex: ngarobah supéroksida jadi péroksida bisa ningkatkeunana. Kontrol SOD anu ningkatkeun fluoresénsi lain hartina gagal. Éta geus ngaidéntifikasi supéroksida minangka spesies dina tahap réaksi saméméhna.

DCFDA: indikator oksidasi anu henteu spésifik

Pasangan métilén biru jeung DCFDA mangrupa sumber kalolobaan kabingungan. DCFH-DA nyaéta prékursor pikeun diasupkeun kana sél. Ésterase di jero sél ngaleupaskeun gugus asétatna nepi ka nyésakeun DCFH anu henteu fluoresén, sarta oksidasi DCFH ngahasilkeun DCF anu fluoresén. Daptar zat anu bisa ngaoksidasi éta panjang: radikal hidroksil, zat antara péroksidase jeung hém, nitrogén dioksida, asam hipoklorit, sarta radikal turunan péroksinitrit. Hidrogén péroksida nyalira henteu langsung ngaoksidasi éta dina laju anu mangpaat; fluoresénsi anu gumantung kana péroksida biasana merlukeun beusi, protéin hém, atawa réaksi kimia péroksidase dina prosésna.

Kritik anu sakuduna dicutat dina unggal bagian métode asalna tina analisis DCFH minangka probe ku Kalyanaraman jeung batur-baturna, sakumaha diringkeskeun dina panalungtikan mitokondria otak anu nolak DCFDA ku alesan ieu. Analisis éta némbongkeun yén zat warna ieu ngaréaksi lalaunan, kalayan stoikiométri anu can dikarakterisasi, tanpa kalibrasi anu sah, sarta ogé ngaréaksi jeung sanyawa non-ROS. Probe éta ogé ngagedékeun naon anu diukurna: oksidasi hiji éléktron tina DCFH ngahasilkeun radikal DCF anu ngaréaksi jeung oksigen pikeun nyieun supéroksida, anu ngalaman dismutasi jadi péroksida tambahan. Ku kituna, prosés maca sinyalna sawaréh nyieun réaksi kimia anu dilaporkeunana.

Sakabéh ieu henteu ngajadikeun DCFDA teu aya gunana. Ieu ngajadikeun éta alat panyaringan, lain alat idéntifikasi. Paningkatan fluoresénsi DCF hartina oksidasi probe anu gumantung kana oksidan geus ningkat. Éta lain hartina péroksida ningkat, sarta tangtu lain hartina total ROS ningkat, hiji kuantitas anu teu bisa diukur ku hiji probe waé. Panalungtikan métilén biru saméméhna anu ngandelkeun oksidasi DCF dina konséntrasi di luhur hiji mikromolar ngalaporkeun pangaruh prooksidan, sedengkeun sistem séjén dina mangsa anu sarua ngalaporkeun panyalindungan tina maotna sél anu dipicu ku péroksida. Duanana paniténan bisa bener pikeun zat warna anu sarua dina kontéks rédoks anu béda, sarta hasil DCF nyalira henteu bisa nétélakeun oksidan mana anu mawa sinyalna. Pentingna panalungtikan mitokondria otak saméméhna nyaéta yén éta ngaganti panyaringan ieu ku pangukuran péroksida anu dikalibrasi sarta manggihan bebanana sacara langsung: sanajan ngan saratus nanomolar zat warna, pelepasan péroksida ningkat sababaraha kali dina unggal substrat jeung kaayaan réspirasi anu diuji.

DCFDA boga hiji deui jebakan anu husus patali jeung métilén biru. Zat warna éta warnana pekat sarta aktip sacara rédoks, jadi bisa ngaleungitkeun fluoresénsi, mareuman émisi, atawa ngaoksidasi komponén kimia probe sacara mandiri tina ROS sélular. Kontrol tanpa sél anu ngandung zat warna jeung probe téh lain saukur tambahan pilihan. Éta téh eksperimen anu nétélakeun naha zat warna éta berinteraksi jeung probe.

Panangkepan spin jeung nyerepna oksigen: idéntitas jeung fluks

Lamun probe fluoresén ngalaporkeun yén aya hiji hal anu bisa dioksidasi, résonansi spin éléktron kalayan perangkap spin ngalaporkeun hal anu leuwih deukeut kana naon éta sabenerna. Panalungtikan fotokimia métilén biru klasik ngagunakeun ESR pikeun ngadeteksi radikal askorbat tina zat warna, askorbat, jeung cahaya, tuluy némbongkeun kabentukna péroksida dina eksperimen nyerepna oksigen sarta kabentukna radikal hidroksil anu dikatalisis ku beusi dina uji panangkepan spin. Unggal téknik ngajawab patalékan anu teu bisa dijawab ku téknik séjén: ESR méré idéntitas radikal, nyerepna oksigen méré fluks réaksi anu henteu gumantung kana probe fluoresén naon waé, sarta kombinasina némbongkeun yén boh jalur oksigen singlet boh jalur radikal jalan dina sistem anu sarua nalika dicaangan.

Hasil taun 1984 éta masih kénéh karasa minangka labél pangéling. Ku ayana panyinaran jeung agén réduktor, zat warna éta ngahasilkeun péroksida, sarta ku ayana beusi, sistemna ngahasilkeun radikal hidroksil, spesies anu pangréaktifna dina kelompok éta. Panulis ngahubungkeun ieu jeung askorbat dina panon sarta mempertanyakan pamakéan pikeun panon anu dilakukeun tanpa tinimbangan ati-ati. Nu maca ayeuna kudu merhatikeun kaayaanana: cahaya ditambah réduktor ditambah beusi. Lamun salah sahijina dileungitkeun, jalurna jadi lemah atawa leungit.

Éléktroda oksigen meunang tempatna ku cara anu béda. Éléktroda tipe Clark ngukur konsumsi oksigen neto, anu mastikeun yén réaksi kimia rédoks anu digerakkeun ku zat warna ngonsumsi oksigen molekular sarta méré data kinétika anu teu bisa dipalsukeun ku artéfak fluoresénsi. Éta henteu ngaidéntifikasi produkna. Kabentukna péroksida, supéroksida, jeung cai, ogé burukna oksigen singlet, kabéh ngonsumsi oksigen. Fluks tanpa idéntitas sarua teu lengkepna jeung idéntitas tanpa fluks, ku kituna tulisan ilmiah anu kuat masangkeun éléktroda jeung uji péroksida anu dikalibrasi atawa perangkap.

Naha hasil antioksidan patukang tonggong

Lamun tilu bacaan éta dibandingkeun babarengan, kontradiksi anu katémbong dina literatur métilén biru bisa dijelaskeun ku béda métode ditambah tilu fakta biologis.

Kahiji, zat warna éta mangrupa pamindah éléktron sakaligus sumber péroksida. Ku ngalihkeun éléktron ti situs réspirasi anu lamun henteu dialihkeun bakal ngarobah oksigen jadi supéroksida, éta bisa ngurangan hiji ROS, bari wangun zat warna anu diréduksi ngaréduksi oksigen langsung jadi péroksida, sahingga ningkatkeun ROS anu séjén. Ku sabab éta, laboratorium anu ngulik réaksi kimia rédoks mitokondria jeung peranna salaku jalur alternatif kudu ngantisipasi jawaban anu gumantung kana probe: bacaan anu sénsitip kana supéroksida turun, sedengkeun bacaan péroksida naék dina kuvét anu sarua.

Kadua, péroksida dina dosis handap téh sinyal, lain ngan ukur karuksakan. Panalungtikan mitokondria otak beurit anu nuturkeun panalungtikan saméméhna manggihan kabentukna péroksida tina zat warna sakedik lima puluh nanomolar tanpa lési DNA mitokondria dina kadar térapéutik, kalayan panyalindungan tina lési anu dipicu ku roténon sanggeus perlakuan awal. Ngan dina saratus mikromolar, jauh di luhur rentang térapéutik, zat warna éta ngaruksak fragmén DNA anu tangtu, sarta cahaya beureum ditambah dua puluh mikromolar zat warna ngahasilkeun oksigen singlet anu ngaruksak sakabéh fragmén anu diuji. Mékanisme anu diusulkeun nyaéta hormésis: produksi péroksida anu hampang micu pertahanan antioksidan anu patali jeung Nrf2 sarta biogénésis mitokondria, jadi bacaan prooksidan dina jangka pondok miheulaan hasil antioksidan dina jangka anu leuwih panjang. Uji anu dibaca sanggeus sajam jeung uji anu dibaca sanggeus sapoé bisa béda hasilna lantaran kaayaan biologisna robah di antara dua waktu éta.

Katilu, cahaya nangtukeun molekul mana anu aya dina sistem. Panyinaran ngadémétilasi zat warna éta ka arah Azure B jeung produk anu patali, sarta lampu mikroskop di luhur wadah waé geus cukup pikeun ngafotosensitisasi éta. Eksperimen dina poék jeung eksperimen anu dicaangan téh dua eksperimen anu béda, sarta bagian kontrol panyinaran jeung pananganan zat warna dina protokol naon waé kudu nganggap duanana kitu.

Sakumpulan kontrol minimum, jeung cara maca unggal klaim

Babandingan di handap mangrupa bahan rujukan asli pikeun artikel ieu. Saméméh narima hasil ROS métilén biru naon waé, pariksa baris mana anu dilengkepan ku panulis sarta mana anu diliwatan.

Tina ieu, aya aturan praktis pikeun maca hasil. Amplex kalayan péroksidase, dikalibrasi, sarta dipariksa ku katalase, mangrupa bukti ngeunaan péroksida. DCFDA mangrupa bukti ngeunaan oksidasi probe anu henteu spésifik, teu leuwih ti éta. Panangkepan spin kalayan kontrol zat panyapu radikal mangrupa bukti ngeunaan idéntitas radikal. Nyerepna oksigen mangrupa bukti ngeunaan fluks. Kalimah anu ngaklaim leuwih ti anu bisa dirojong ku ujina, sakumaha yakin ogé ditulisna, téh kalimah ngeunaan probe, lain ngeunaan zat warna. Pedaran anu patali ngeunaan gumantungna kana dosis jeung rentang hormésis, aliran éléktron mitokondria, gangguan uji dina sampel anu diwarnaan, sarta artéfak panyinaran mikroskopi ngalegaan unggal pokok ieu, sarta masing-masing tetep sah sanggeus rujukan pangisi samentarana diganti.