Ngukur pangaruh métilén biru kana mitokondria: oksigén, ATP, jeung poténsial mémbran

Upamana hiji laboratorium nambahan métilén biru kana mitokondria anu réspirasina kaganggu, tuluy niténan konsumsi oksigénna naék. Kalimah anu lumrah ditulis nyaéta yén zat warna éta mulihkeun fungsi mitokondria. Éta kalimah bisa waé salah. Fluks oksigén, sintésis ATP, jeung poténsial mémbran téh tilu konsép anu béda. Katiluna aya dina organél anu sarua, kawas cadangan data, sinkronisasi, jeung babagi data anu ngagunakeun polder méga anu sarua: silih patali, tapi diatur ku aturan anu béda. Lamun hiji disaruakeun jeung nu séjén, interpretasina bakal gagal, sanajan unggal pangukuran sacara téknis geus bener.

Métilén biru ngajadikeun kabingungan éta leuwih gampang kajadian lantaran zat ieu milu aub dina sistem anu keur diukur. Ieu zat ngalakukeun siklus rédoks anu narima éléktron di bagian hulu jeung nyumbangkeunana di bagian hilir, mangrupa kation lipofilik anu ngumpul dina mitokondria anu miboga énergi, sarta sanyawa biru pekat anu nyerep jeung mancarkeun cahaya dina pita spéktral anu sarua jeung probe anu ilahar dipaké. Hiji hasil pangukuran waé teu cukup pikeun ngajelaskeun sakabéh éta. Pola anu bisa dipercaya, sakumaha ditémbongkeun dina runtuyan studi mitokondria Budapest, nyaéta ngukur fluks oksigén ditambah laju sintésis ATP ditambah poténsial mémbran ditambah pelepasan hidrogén péroksida, kalayan kontrol husus pikeun zat warna dina unggal léngkah.

Réspirométri ngukur fluks oksigén, lain kaluaran énergi

Réspirométri résolusi luhur, boh ku Oroboros Oxygraph boh ku Seahorse extracellular flux analyzer, ngalaporkeun hiji hal: sabaraha gancang oksigén diréduksi. Ieu teu ngalaporkeun sabaraha proton anu dipompa pikeun unggal éléktron, sabaraha gradién anu dipertahankeun, atawa naha ATP sintase ngagunakeun éta gradién.

Istilah anu dipaké téh penting. Dina mitokondria anu diisolasi, substrat tanpa ADP ngahasilkeun réspirasi bocor, substrat kalayan ADP dina kadar jenuh ngahasilkeun kapasitas fosforilasi oksidatif, sarta titrasi ku zat pamegat gandéngan ngahasilkeun kapasitas transfer éléktron maksimum. Dina sél gembleng, padanan Seahorse-na nyaéta réspirasi basal, réspirasi anu patali jeung ATP sarta sénsitip kana oligomisin, kabocoran proton, réspirasi maksimum anu ditangtukeun ku FCCP, sarta konsumsi oksigén non-mitokondria anu tahan kana rotenon ditambah antimisin. Nyebut kaluaran Seahorse minangka State 3 jeung State 4 téh nginjeum tingkat katepatan anu teu dirojong ku préparat éta, sakumaha dijelaskeun dina kerangka Agilent Mito Stress Test.

Métilén biru megatkeun hubungan intuitif antara leuwih loba oksigén jeung leuwih loba énergi. Dina mitokondria otak marmot anu diisolasi, zat warna 100 nM nepi ka 1 uM ningkatkeun konsumsi oksigén dina kaayaan istirahat kalayan substrat glutamat ditambah malat, suksinat, jeung alfa-glisérofosfat, kalayan kanaékan kira-kira 64 persén dina alfa-glisérofosfat. Tapi, réspirasi anu dirangsang ku ADP dina mitokondria séhat dina dasarna teu robah, nurutkeun studi mitokondria otak anu diisolasi. Lantaran kabocoran naék bari fluks anu dirangsang ku ADP tetep, rasio kontrol réspirasi anu diitung jadi turun. Turunna éta lain hartina zat warna ngaruksak mitokondria. Hartina, zat warna nambahan siklus rédoks anu ngonsumsi oksigén salian ti réspirasi normal. Uji konsumsi oksigén métilén biru anu ngan ngalaporkeun kanaékan éta geus ngukur réaksi kimia anu nyata, tapi teu ngajelaskeun nanaon ngeunaan konservasi énergi.

Ékspérimén pamulihan némbongkeun kasenjangan anu sarua dina skala anu leuwih gedé. Nalika Kompleks I dipeungpeuk, fluks oksigén pulih kira-kira tilu kali lipet, sedengkeun sintésis ATP ngan pulih kira-kira 1.5 kali lipet. Leuwih loba oksigén nepi ka éléktroda. Bagian anu nyumbang kana produksi ATP mah leuwih saeutik. Sagala klaim ngeunaan ningkatna fosforilasi oksidatif merlukeun data ATP ogé, idéalna ditepikeun minangka rasio ATP per oksigén kalayan konvénsi pangbagina dijelaskeun.

Uji ATP ngukur laju sintésis, anu teu bisa diganti ku jumlah ATP

Uji ATP ngajawab patarosan anu béda: sabaraha ATP anu dihasilkeun per satuan waktu. Pangukuran kinétik, boh luminesénsi lusiferase kunang-kunang anu dilacak salila sababaraha menit boh uji énzim gandéngan héksokinase ditambah glukosa-6-fosfat déhidrogénase anu dibaca dina 340 nm, ngahasilkeun hiji laju. Hiji pangukuran total ATP dina titik ahir ngahasilkeun jumlah ATP, anu ngagambarkeun sintésis dikurangan konsumsi sarta, lamun dipaké nyalira, ngan méré saeutik katerangan ngeunaan fosforilasi oksidatif.

Kelompok Budapest ngagunakeun métode énzimatik gandéngan kalayan adénilat kinase diteken, sarta manggihan yén métilén biru dina 1 nepi ka 2 uM ningkatkeun produksi ATP sacara leutik tapi signifikan dina mitokondria anu dibéré rotenon jeung antimisin. Éta téh pamulihan anu nyata, sarta ngan sabagian. Studi toksisitas TEGDMA ngahasilkeun pola jawaban anu sarua dina modél anu béda: monomér dental TEGDMA 5 mM nurunkeun réspirasi anu patali jeung Kompleks I tina kira-kira 286 jadi 28 unit fluks, sarta zat warna 2 uM mulihkeunana jadi kira-kira 86.

Aya dua kontrol anu wajib pikeun sanyawa rédoks anu boga warna. Kahiji, paké oligomisin pikeun nangtukeun sabaraha bagian sintésis ATP anu diukur gumantung kana ATP sintase. Kadua, lakukeun uji pamulihan tina tambahan ATP tanpa sél, maké ATP anu jumlahna dipikanyaho ditambah réagén lengkep ditambah konséntrasi zat warna anu persis sarua jeung anu dipaké, sahenteuna 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, jeung 2 uM. Zat warna bisa nyerep cahaya anu dipancarkeun, ngahambat énzim pelapor, atawa ngarobah kimia rédoks réagén. Pituduh umum uji lusiferase nyarankeun uji tandingan biokimia husus pikeun golongan gangguan ieu. Ulah nganggap 1 uM bébas tina artéfak ngan lantaran pangpareuman fluoresénsi biasana leuwih parah dina konséntrasi anu leuwih luhur.

Probe poténsial mémbran ngukur distribusi zat warna, lain fluks

Safranin O, TMRM jeung TMRE, rodamin 123, sarta JC-1 kabéh mangrupa kation anu bisa nembus mémbran. Zat-zat ieu ngumpul dina matriks anu muatanana négatif luyu jeung kasaimbangan éléktrokimia, jadi fluoresénsi total ngalaporkeun poténsial sacara teu langsung dumasar kana tempat probe ayana. Taya hiji ogé anu ngukur ATP atawa fluks éléktron.

Unggal probe boga préparat anu pangcocogna. Safranin O cocog pikeun mitokondria anu diisolasi jeung sél anu diperméabilisasi, biasana dina kira-kira 2 uM kalayan éksitasi deukeut 495 nm jeung émisi deukeut 585 nm. Probe ieu dipaké dina kaayaan pangpareuman fluoresénsi, nalika asupna probe ngarobah fluoresénsi total. TMRM jeung TMRE cocog pikeun sél gembleng dina kadar muatan nanomolar anu handap, dina modeu tanpa pangpareuman fluoresénsi; dépolarisasi ngaleupaskeun zat warna sarta fluoresénsi mitokondria turun. Dina kadar muatan anu luhur, arah sinyal bisa malik alatan pangpareuman fluoresénsi ku zat éta sorangan. JC-1 méré rasio héjo kana beureum anu praktis, tapi gumantung kana kadar muatan jeung massa mitokondria. Ieu ngajadikeunana kurang kuat pikeun pagawéan kuantitatif dibandingkeun jeung TMRM anu dikontrol sacara taliti. Kaunggulan jeung kakurangan ieu diringkeskeun dina ulasan probe poténsial mémbran mitokondria anu loba dipaké.

Métilén biru ngaganggu sacara optik persis dina konséntrasi anu dipaké pikeun pangukuran. Pita serepanna deukeut 600 nepi ka 665 nm tumpang tindih jeung émisi probe beureum, jadi éfék saringan internal, pangpareuman fluoresénsi, jeung nyerepna cahaya éksitasi kabéh mungkin kajadian. Zat warna ieu ogé mangrupa kation lipofilik kadua anu distribusina sorangan robah saluyu jeung poténsial anu keur diukur. Cara ngajagana nyaéta ngagunakeun pangukuran pangrojong ditambah blangko: probe wungkul, zat warna wungkul, probe ditambah unggal konséntrasi zat warna, dépolarisasi lengkep ku FCCP minangka rujukan nol, sarta idéalna probe kadua anu béda sacara optik. Studi jalur alternatif Kompleks III méré conto éta ku ngulang pamulihan poténsial mémbran maké safranin O jeung TMRM sanggeus inhibisi ku antimisin jeung miksotiazol, sarta meunangkeun pamulihan kualitatif anu sarua. Hiji pelapor optik téh mangrupa petunjuk. Dua pelapor anu mandiri téh mangrupa bukti.

Tilu préparat, tilu patarosan anu béda

Mitokondria anu diisolasi, sél anu diperméabilisasi, jeung sél gembleng lain setélan sensitipitas dina hiji uji anu bisa silih tukeur. Éta téh konsép anu béda kalayan prinsip operasional anu béda.

Mitokondria anu diisolasi ngajaga ranté transport éléktron, mémbran jero, jeung sistem matriks, bari ngaleungitkeun mémbran plasma, sitosol, jeung arsitéktur jaringan. Éta anu dileungitkeun téh memang tujuanana: substrat, ADP, inhibitor, jeung konséntrasi zat warna ditangtukeun sacara pasti, sangkan hiji jalur bisa diidéntifikasi. Balukarna nyaéta leungitna suplai substrat alami, sinyalisasi, jeung kabutuhan énergi.

Sél anu diperméabilisasi ngajaga mitokondria dina sabagian gedé arsitéktur sélna, bari ngidinan substrat éksogén jeung ADP ngaliwatan mémbran plasma anu geus dibuka. Ieu alat anu pas pikeun nangtukeun gangguan jalur substrat dina kontéks sél. Perméabilisasi anu kaleuleuwihi ngaruksak mémbran luar, sarta régulasi sitosolik kabawa kaluar.

Sél gembleng ngajaga sagalana: panghalang mémbran plasma, zat pangréduksi sitosolik, transport substrat éndogén, jaringan mitokondria, jeung kabutuhan ATP. Ieu pangdeukeutna kana fisiologi sarta pangjauhna tina katerangan mékanisme, lantaran asupna zat warna, réduksi, jeung panyimpenanana kabéh mangaruhan paparan éféktif mitokondria.

Studi TEGDMA ngahaja ngagunakeun katilu tingkat éta: mitokondria otak anu diisolasi pikeun nguji pamulihan oksidasi jeung poténsial ku zat warna; sél punca pulpa huntu anu diperméabilisasi utamana pikeun nangtukeun yén gangguanna aya dina oksidasi substrat anu patali jeung Kompleks I; sarta sél punca gembleng pikeun ngukur pangaruh fisiologis neto zat warna 2 uM kana konsumsi oksigén anu diteken. Pikeun nu maca anu ngabandingkeun hasil pangukuran mitokondria dina rupa-rupa préparat, tulisan pendamping ngeunaan kumaha métilén biru mindahkeun éléktron ngaliwatan ranté réspirasi méré latar tukang jalurna, sarta pituduh maca studi réspirasi métilén biru ngabahas logika dosis jeung inhibitor.

Kontrol anu diperlukeun ku zat warna aktif rédoks

Zat anu ngalakukeun siklus rédoks merlukeun daptar kontrol anu leuwih panjang tibatan inhibitor biasa, lantaran réaksi kimia zat warna wungkul bisa nyarupaan prosés biologis.

Pikeun réspirométri, paké rohangan anu ngan ngandung larutan panyangga pikeun mariksa parobahan dasar pangukuran, rohangan larutan panyangga ditambah zat warna tanpa bahan biologis, zat warna ditambah sagala zat pangréduksi ékstrasélular anu aya dina uji, sarta rotenon ditambah antimisin dina ahir pikeun nangtukeun konsumsi oksigén non-mitokondria dina sél gembleng. Catet yén zat warna anu geus diréduksi ngalaman oksidasi deui ku mindahkeun éléktron ka oksigén pikeun ngabentuk hidrogén péroksida. Ku kituna, blangko zat warna wungkul tanpa donor éléktron bakal ngira-ngira teuing handap konsumsi oksigén tanpa sél anu muncul nalika NADH atawa NADPH geus aya.

Pikeun hidrogén péroksida, leuwih hadé maké Amplex UltraRed anu dikalibrasi ditambah péroksidase lobak tibatan zat warna DCFDA anu teu séléktif, verifikasi ku katalase, sarta uji gumantungna kana cahaya, lantaran zat warna ieu mangrupa fotosensitiser. Studi mitokondria otak manggihan yén beban péroksida naék leuwih ti opat kali lipet ngan dina zat warna 100 nM, bari éliminasina ngalambat. Péroksida kabentuk langsung ku zat warna anu diréduksi tanpa zat antara superoksida. Rincian pilihan probe jeung kontrol cahaya aya dina tulisan pendamping ngeunaan ngukur spésiés oksigén réaktif dina ékspérimén zat warna, sarta patarosan anu leuwih lega ngeunaan iraha péroksida jadi sinyal atawa jadi beban dibahas babarengan jeung kasaimbangan rédoks sélular jeung klaim antioksidan.

Pikeun klaim ngeunaan jalur, uji duanana situs inhibitor Kompleks III: antimisin A dina situs Qi jeung miksotiazol dina situs Qo, ditambah titik ahir Kompleks IV maké sianida. Studi otak mencit anu leuwih tiheula ngalaporkeun yén zat warna mulihkeun réspirasi anu dipeungpeuk ku rotenon, tapi henteu anu dipeungpeuk ku antimisin. Sedengkeun studi tilu spésiés anu leuwih anyar manggihan pamulihan sabagian kalayan duanana inhibitor sarta bukti réduksi langsung sitokrom c. Anggap jalur alternatif éta saluyu jeung data anu leuwih anyar, lain minangka perkara anu geus pasti, lantaran konséntrasi zat warna, situs inhibitor, kaayaan substrat, jeung distribusi zat warna kabéh ngarobah jalur anu katitén.

Matriks pilihan uji

Paké tabél ieu pikeun milih pangukuran dumasar kana patarosan, lain sabalikna.

Klaim anu sahenteuna bisa ngayakinkeun kudu nguji konséntrasi zat warna anu sarua, 100 nM, 300 nM, 1 uM, jeung 2 uM, pikeun fluks oksigén dina kaayaan bocor, ADP, oligomisin, jeung zat pamegat gandéngan; laju sintésis ATP; poténsial mémbran anu hadéna maké dua probe; sarta pelepasan péroksida anu dikalibrasi kalayan kontrol katalase jeung kontrol tanpa sél. Laporkeun sakumpulan hasil anu silih patali: fluks oksigén ditambah laju ATP ditambah ATP per oksigén ditambah poténsial ditambah péroksida. Salah sahiji angka éta, lamun nyalira, ngan ukur pangukuran anu can boga harti anu écés.