Métilén bulao jeung nitrogén monoksida: NOS, cGMP, jeung sinyal vaskular

Patarosanana kadéngé basajan: naha métilén bulao ngahambat nitrogén monoksida? Di laboratorium, jawabanana kabagi jadi opat patarosan anu misah, sarta masing-masing boga uji ékspérimén anu béda. Kacampurna éta patarosan téh alesan utama tulisan ngeunaan métilén bulao jeung nitrogén monoksida kadéngé yakin tapi samar.

Bayangkeun sinyal nitrogén monoksida minangka ranté anu boga opat mata ranté. Hiji gén ditranskripsi pikeun ngahasilkeun sintase nitrogén monoksida. Énzimna ngarobah arginin jadi nitrogén monoksida. Gasna ngadifusi ka sasaranana saméméh ngaréaksi jeung zat séjén. Guanilat siklase leyur ngadeteksi éta gas sarta ngahasilkeun GMP siklik. Pangaruh métilén bulao dina unggal mata ranté geus dilaporkeun dina publikasi, tapi buktina asalna tina préparat, konséntrasi, jeung isoform anu béda-béda. Hasil dina hiji mata ranté henteu ngabuktikeun ayana pangaruh dina mata ranté séjén.

Ranté baku, dipedar sacara basajan

Dina témbok pembuluh getih, runtuyan bakuna lumangsung kieu. Hiji stimulus mangaruhan sél éndotél. Sintase nitrogén monoksida éndotél, anu disebut eNOS atawa NOS3, ngahasilkeun nitrogén monoksida saeutik dina waktu pondok. Gasna ngadifusi kana sél otot polos di gigireunana, ngabeungkeut hém beusi anu aya dina kaayaan réduksi dina guanilat siklase leyur, sarta ngagancangkeun robahna GTP jadi GMP siklik. GMP siklik ngaktipkeun protéin kinase G, pangaturan kalsium robah, sarta ototna ngendur.

Aya ranté kadua anu kudu tetep dibédakeun. Salila inféksi atawa paparan sitokin, sél ngalakukeun transkripsi pikeun énzim anu béda, nyaéta sintase nitrogén monoksida anu bisa diinduksi atawa iNOS, anu ogé disebut NOS2. Ieu ngahasilkeun fluks nitrogén monoksida anu leuwih gedé sarta leuwih lila tibatan eNOS. Isoform katilu, NOS neuronal atawa nNOS, aya dina kontéks anu béda deui. Lamun hiji makalah nyebut sintase nitrogén monoksida tanpa nangtukeun isoformna, eureun heula sarta pariksa mana anu diukur. Tinjauan ngeunaan kumaha métilén bulao mindahkeun éléktron ogé nepikeun hal anu sarua pikeun sasaran rédoks sacara umum: panganteur éta henteu ngalakukeun nanaon sorangan, sarta pasangan dina unggal tungtungna anu nangtukeun hasilna.

GMP siklik anu diukur ogé mangrupa hasil ukur gabungan, lain uji énzim langsung. Kadarna ngagambarkeun sintésis ku siklase dikurangan panguraian ku fosfodiésterase, utamana PDE5 dina otot polos vaskular. Ku kituna, turunna GMP siklik hartina leuwih saeutik sinyal anu nepi ka detéktor. Éta waé henteu nuduhkeun mata ranté mana anu gagal.

Mata ranté 1: énzim iNOS anu dihasilkeun leuwih saeutik

Dina makrofag mencit anu dirangsang ku lipopolisakarida baktéri, interferon gamma, atawa duanana, métilén bulao nyegah kanaékan protéin iNOS anu dipiharep sarta kuat pisan neken RNA utusan iNOS dina ékspérimén transkripsi makrofag. Bagian anu méré katerangan penting nyaéta hal anu henteu robah. Dégradasi inhibitor I kappa B alpha, fosforilasi NF kappa B jeung STAT1, sarta pindahna éta faktor kana inti sél sabagéan gedé tetep lumangsung. Anu turun nyaéta pangiketanna kana DNA, anu dipastikeun ku imunopresipitasi kromatin anu némbongkeun nguranganana okupansi dina promotor iNOS.

Éta mangrupa pangaruh pangaturan gén di hulu jumlah énzim, lain panghalangan akut kana énzim anu geus aya. Ieu kaasup kana sinyal peradangan, nalika faktor transkripsi kudu ngabeungkeut promotor saméméh protéin muncul. Ieu henteu langsung ngajelaskeun nanaon ngeunaan eNOS konstitutif dina pembuluh anu keur istirahat, sarta kudu dipedar dina kontéks éta.

Mata ranté 2: énzim NOS anu geus aya gawéna leuwih laun

Hiji panalungtikan dina beurit nguji tingkat anu béda. Beurit jalu anu sadar dibéré lipopolisakarida sacara intravena, tuluy tilu jam ti harita dibéré larutan salin atawa métilén bulao dina 3 mg per kg sacara intravena. Kagiatan sintase nitrogén monoksida dina hipotalamus basal médial diukur tina robahna arginin anu dibéré pananda jadi sitrulin dina panalungtikan kagiatan NOS hipotalamus. Strés ditambah larutan salin wungkul ngainduksi sabagian kagiatan anu henteu gumantung kana kalsium, sarta lipopolisakarida ningkatkeunana nepi ka kira-kira sapuluh kali tingkat kontrol. Métilén bulao ngaleungitkeun duanana komponén anu diinduksi. Kagiatan konstitutif anu gumantung kana kalsium henteu robah dina jaringan éta dina dosis jeung titik waktu éta.

Tafsirkeun éta hasil sakumaha anu ditulis: kagiatan tipe iNOS anu diukur diteken dina kaayaan éta. Ieu lain pangukuran éksprési gén, sarta lain bukti séléktivitas permanén pikeun iNOS dibandingkeun jeung eNOS atawa nNOS. Panalungtikan énzim anu dimurnikeun nguatkeun perluna ati-ati. Dina uji langsung sintase nitrogén monoksida anu dimurnikeun, métilén bulao sagemblengna ngahalangan kabentukna sitrulin dina 30 micromolar, kalayan konséntrasi anu ngahambat satengahna kira-kira 5.3 micromolar tanpa superoksida dismutase jeung 9.2 micromolar kalayan éta énzim, sakumaha dilaporkeun dina babandingan NOS jeung guanilat siklase anu dimurnikeun. Hiji panalungtikan misah ngeunaan nNOS anu dimurnikeun nunjukkeun yén oksidasi hém anu kabeungkeut kana énzim aub dina pangaruh éta. Pangajaran praktisna nyaéta hambatan langsung kana NOS mémang aya dina sistem anu diisolasi, tapi hasil hipotalamus henteu bisa dipaké pikeun nyieun klaim umum yén métilén bulao henteu mangaruhan sakabéh NOS konstitutif di mana waé.

Mata ranté 3: nitrogén monoksida leungit saméméh nepi

Bukti anu paling écés yén hal salian ti panghalangan énzim bisa ngajelaskeun turunna GMP siklik asalna tina sél otot polos artéri pulmonal kelenci anu dikultur. Rarancangna ngalangkungan NOS éndogén sagemblengna ku cara langsung nambahkeun donor nitrogén monoksida, tuluy nguji naha métilén bulao masih neken réspon GMP siklik dina panalungtikan superoksida otot polos vaskular.

Tilu donor diuji ti 1 nepi ka 100 micromolar: S nitroso L sistein, natrium nitroprusida, jeung hiji analog stabil anu geus ngalaman déaminasi anu disebut MPANO. Kabéh ningkatkeun GMP siklik kira-kira 1.5 kali nepi ka 12 kali. Métilén bulao dina 10 micromolar ngahambat dua donor kahiji ku 51 nepi ka 100 persén sarta henteu ngarobah réspon MPANO. Lamun métilén bulao ngan saukur ngahalangan situs katalitik siklase, séléktivitas kana donor éta bakal hésé dijelaskeun, sabab tiluanana museur kana énzim hilir anu sarua.

Tilu kontrol tuluy mastikeun yén mékanismena patali jeung superoksida. Kahiji, ngahasilkeun superoksida ékstrasélular ku xantin ditambah xantin oksidase ngahasilkeun pola anu sarua: CYSNO jeung nitroprusida dihalangan, sedengkeun MPANO henteu kapangaruhan. Kadua, métilén bulao ngabalukarkeun produksi superoksida tina sél otot polos anu gumantung kana dosis jeung waktu, diukur ku réduksi sitokrom c. Katilu, superoksida dismutase sagemblengna nyegah hambatan éta, sedengkeun katalase henteu. Ieu nunjukkeun superoksida, lain hidrogén péroksida, minangka spésiés kimia anu langsung nyababkeun pangaruh dina préparat éta.

Vérsi kokultur tina ékspérimén ieu penting dipedar lantaran nangtukeun lokasi pangaruhna. Sél éndotél dina kaca panutup sakedapan dikultur babarengan jeung sél otot polos, sahingga faktor éndotél anu dileupaskeun dina kaayaan basal ningkatkeun GMP siklik otot polos tilu nepi ka dalapan kali. Perlakuan awal ku métilén bulao kana salah sahiji kompartemén ngurangan sinyal éta, sarta superoksida dismutase mulangkeun sabagian pangaruh perlakuan awal kana éndotél. Hartina, métilén bulao henteu kudu mangaruhan bagian jero sél otot polos anu jadi detéktor. Éta bisa nurunkeun sinyal ku cara ngaleungitkeun molekul utusan nalika keur dina perjalanan. Pituduh pikeun maca panalungtikan métilén bulao nganggap ieu minangka aturan umum: sebutkeun kompartemén tempat intervensi lumangsung saméméh nyebutkeun sasaran molekularna.

Nyebut ieu minangka hambatan NOS téh salah. Teu aya léngkah sintase anu diperlukeun sangkan donor bisa jalan, tapi sinyalna tetep turun.

Mata ranté 4: detéktorna sorangan kurang ngaréspon

Pangaruh langsung kana guanilat siklase leyur mémang aya, tapi konséntrasina penting. Dina babandingan énzim anu dimurnikeun anu dicutat di luhur, siklase anu dirangsang ku nitrogén monoksida merlukeun kira-kira 60 micromolar métilén bulao pikeun ngahambat satengahna, dibandingkeun jeung hambatan satengah NOS dina kira-kira 5 nepi ka 9 micromolar. Malah 1 millimolar ngan ngahasilkeun panghalangan maksimal anu parsial. Éta béda kira-kira genep nepi ka sabelas kali. Ku kituna, ékspérimén sél dina konséntrasi micromolar anu handap anu nurunkeun GMP siklik henteu bisa disebut hambatan siklase séléktif ngan dumasar kana angka GMP siklik wungkul.

Panalungtikan rédoks anu leuwih anyar nambahan hiji hal séjén anu kudu diwaspadaan: métilén bulao nganonaktipkeun siklase anu diaktipkeun ku nitrogén monoksida ngaliwatan mékanisme anu béda ti oksidasi basajan beusi hém ku hawa. Jadi, detéktor bisa kaganggu, tapi prosés kimiana can dipastikeun. Bédana konséntrasi ogé hartina pangaruh superoksida jeung NOS kudu dipariksa heula pikeun mastikeun yén lain éta panyababna dina paparan micromolar anu handap. Di dieu ogé kontrol fosfodiésterase perlu diperhatikeun. Lamun panguraian henteu diukur atawa dihalangan, nguranganana akumulasi GMP siklik bisa saluyu jeung sintésis anu leuwih saeutik, dégradasi anu leuwih gancang, atawa duanana.

Naha ieu henteu bisa diringkes jadi hiji klaim ngeunaan tekanan getih

Unggal mata ranté dibuktikeun dina sistem anu béda. Transkripsi makrofag lain kagiatan énzim hipotalamus. Kagiatan hipotalamus sanggeus lipopolisakarida lain tonus éndotél dina kaayaan istirahat. Faktor éndotél anu dileupaskeun sacara basal dina kokultur lain vasodilatasi anu dirangsang ku agonis. Sél artéri pulmonal anu dikultur dina 10 micromolar métilén bulao lain sirkulasi manusa. Ngahijikeun kabéhanana kana pernyataan saperti métilén bulao ningkatkeun tekanan getih ku ngahalangan nitrogén monoksida justru miceun béda-béda anu rék dijaga ku éta kontrol.

Tilu pamariksaan ngajaga pedaran tetep akurat. Kahiji, sebutkeun isoformna: eNOS pikeun tonus vaskular dina kaayaan istirahat, iNOS pikeun fluks peradangan anu diinduksi, nNOS pikeun kontéks neuronal jeung sababaraha kontéks énzim anu dimurnikeun. Kadua, sebutkeun kumaha sinyal nitrogén monoksida ditepikeun: sintésis éndogén, sékrési éndotél basal, atawa donor husus saperti CYSNO, nitroprusida, atawa MPANO, sabab donor anu stabil tahan kana métilén bulao, sedengkeun anu labil henteu. Katilu, sebutkeun konséntrasi jeung kontrol pamulihanana: pamulihan ku superoksida dismutase nunjukkeun kalibetna superoksida, kagagalan katalase nunjukkeun yén hidrogén péroksida lain panyabab dina préparat éta, tiruan pangaruh ku xantin oksidase némbongkeun yén éta mékanisme cukup pikeun ngahasilkeun pangaruh, sarta uji énzim anu dimurnikeun misahkeun pangaruh katalisis langsung tina leungitna sinyal dina perjalanan.

Ringkesanana kieu. Métilén bulao leuwih merenah dipandang minangka zat anu ngaganggu sababaraha titik dina pangiriman sinyal nitrogén monoksida ka GMP siklik, lain minangka panghalang siklase anu séléktif. Gumantung kana préparat jeung konséntrasi, éta bisa ngurangan pangiketan faktor transkripsi iNOS, langsung ngahambat énzim NOS, nurunkeun kasadiaan nitrogén monoksida ngaliwatan produksi superoksida, sarta ngaganggu siklase anu diaktipkeun ku nitrogén monoksida. Peran sinyal GMP siklik dina panalungtikan vaskular jeung babandingan donor nitrogén monoksida anu dipaké dina uji sél masing-masing medar salah sahiji cabang éta kalayan leuwih jéntré, sarta métode anu dipaké pikeun misahkeun pangaruh rédoks tina pangaruh énzim ngajelaskeun naha superoksida dismutase ditambah katalase ditambah kontrol donor stabil remen pisan dipaké dina literatur ieu.

Nilai GMP siklik anu handap sanggeus métilén bulao nunjukkeun aya ranté anu pegat. Ngan kontrol anu bisa nétélakeun mata ranté mana anu pegat.