Métilén bulao jeung autofagi: AMPK, mTOR, jeung ékspérimén neuronal

Bayangkeun anjeun ngalakukeun ékspérimén sél, nambahan métilén bulao, tuluy ningali pita protéin anu disebut LC3-II beuki poék dina blot anjeun. Bisa jadi anjeun hayang langsung ngumumkeun yén sanyawa éta "ngaronjatkeun autofagi" tuluy neruskeun kana hal séjén. Tafsiran éta masih kénéh prématur. Pita LC3-II anu leuwih poék bisa hartina sél nyieun leuwih loba vésikel beberesih, atawa bisa hartina vésikel numpuk lantaran léngkah miceun eusina macét. Dua tafsiran éta nunjuk kana arah anu sabalikna, sarta literatur métilén bulao dina neuron ngandung conto bukti pikeun duanana. Artikel ieu ngajelaskeun naon anu sabenerna diukur, uji demi uji.

Makroautofagi, wangun anu ditalungtik di dieu, nyaéta konsép daur ulang bahan sél sacara masal. Kantong mémbran anu disebut fagofor tumuwuh ngurilingan protéin jeung organél anu geus ruksak, nutup jadi autofagosom, ngahiji jeung lisosom, tuluy muatanana diuraikeun sarta dileupaskeun pikeun dipaké deui. Neuron gumantung kana prosés rutin ieu lantaran henteu ngabagi diri sarta henteu bisa ngurangan proporsi bagian anu ruksak ku cara ngabagi diri. Lamun daur ulang macét, runtah numpuk. Lamun prosésna jalan, sél meunangkeun deui bahan pangwangun nalika ngalaman strés.

Naon anu ditunjukkeun ku hiji ékspérimén hipokampus

Studi utama ngeunaan induksi ngagunakeun sél hipokampus beurit HT22 anu dibéré strés ku cara dikurangan sérumna salila 24 jam, hiji kaayaan anu ngaleungitkeun faktor tumuwuh jeung sinyal trofik sarta memicu boh apoptosis boh autofagi. Para panalungtik ngalaporkeun yén métilén bulao ngurangan maotna sél gumantung kana dosis, sarta panyalindungan ieu dibarengan ku tanda-tanda makroautofagi.

Runtuyan panandana spésifik. Pewarnaan LC3B anu sumebar robah sebaranana jadi titik-titik di sabudeureun inti sél, dimimitian dina kira-kira 20 nM métilén bulao, kalayan réspon LC3-I jeung LC3-II pangkuatna deukeut 1 μM. Boh LC3B-I boh LC3B-II ngaronjat gumantung kana dosis jeung waktu. Anu penting, tim éta ngalakukeun hiji léngkah saluareun blot LC3 statis. Maranéhna nambahan 10 μM klorokuin, anu ngahalangan pangberesan ku lisosom, sarta manggihan LC3-II anu leuwih luhur ditambah p62 anu stabil dina sél anu dibéré métilén bulao. Pola éta ngarojong prosés ngaganti jeung nguraikeun bahan anu gumantung kana lisosom, lain saukur panumpukan. Maranéhna ogé némbongkeun yén klorokuin sawaréh ngabalikeun pangaruh anti-apoptotik, anu ngahubungkeun panyalindungan éta jeung jalur autofagi sarta lisosom dina modél ieu.

Hasil ngeunaan sinyal téh bagian anu pangmindengna dicutat sacara salah. Sinyal AMPK, anu diukur tina AMPK anu difosforilasi jeung target hilirna, ACC anu difosforilasi, ngaronjat dina 12 jeung 24 jam gumantung kana dosis. Inhibitor AMPK Compound C, anu dibéré dina 20 μM salila 4 jam pamungkas, ngurangan boh fosforilasi ACC boh aktivasi LC3. Sabalikna, mTOR anu difosforilasi henteu némbongkeun suprési anu bisa dideteksi. Jadi, dina sél hipokampus anu ngalaman strés, papanggihanna nyaéta induksi anu patali jeung AMPK ngaliwatan jalur anu katingalina henteu gumantung kana mTOR. Pola anu sarua kapanggih dina beurit hirup, nalika perlakuan métilén bulao ngainduksi pananda makroautofagi dina kortéks jeung hipokampus.

Induksi lain fluks anu réngsé

Di dieu bédana konsép jadi pohara penting. Induksi hartina mékanisme di hulu nyieun leuwih loba autofagosom. Fluks hartina muatan ngaliwatan sakabéh jalur: pangurungan, pamatarangan, fusi jeung lisosom, degradasi, daur ulang. Unggal paningkatan LC3-II ngan ukur ngarojong klaim induksi nepi ka uji fluks mastikeun sésa lalampahanana.

Uji fluks baku ngukur LC3-II kalayan jeung tanpa blokade lisosom singget, saperti bafilomycin A1 atawa klorokuin. Lamun perlakuan éta bener-bener ngagancangkeun produksi, ngahalangan panguraian kuduna ngajadikeun LC3-II leuwih luhur deui. Reporter tandem mCherry-GFP-LC3 nambahan sudut pandang kadua: struktur mancarkeun warna konéng saméméh fusi jeung lisosom sarta ngan warna beureum sanggeus kaasaman mareuman sinyal GFP, jadi leuwih loba titik anu ngan beureum ngarojong kamajuan kana autolisosom asam. Turunna protéin p62 bisa nguatkeun bukti pergantian muatan, kalayan catetan yén transkripsi p62 sorangan ngaréspon strés sarta kudu dipariksa dina tingkat mRNA.

Daptar pariksa di handap ngahubungkeun unggal uji anu dipaké dina literatur ieu jeung naon anu diukur sarta naon anu henteu bisa dibuktikeun ku éta uji waé. Pamaca bisa ngagunakeun deui ieu daptar pikeun sagala klaim makroautofagi ka hareup, kaasup argumén ngeunaan puasa jeung umur panjang anu ngagunakeun pananda ieu.

Perhatikeun hiji jebakan istilah anu diantisipasi ku tabél ieu. ACC anu difosforilasi nyaéta wangun anu aktivitas énzimatikna dihambat. Paningkatanana némbongkeun kaluaran AMPK, lain aktivasi ACC.

Frasa "inhibisi makroautofagi ngaleungitkeun neuroprotéksi" ogé kudu dijelaskeun kalayan sarua taliti. Dina modél HT22, éta hartina ngaganggu jalur autofagi jeung lisosom ngaleungitkeun kaunggulan kalangsungan hirup anu dibéré métilén bulao dina kaayaan kakurangan sérum. Ieu ngarojong yén autofagi diperlukeun atawa nyumbang kana pangaruh éta dina wadah kultur. Ieu henteu netepkeun autofagi minangka hiji-hijina mékanisme panyalindungan sanyawa éta, henteu ngabuktikeun yén klorokuin gawé ngan ngaliwatan autofagi, sarta manipulasi génétik ATG5, ATG7, atawa ULK1 bakal diperlukeun pikeun nguatkeun klaim sabab-akibat.

Dua jalur kana mékanisme anu sarua

Péta anu disederhanakeun bisa ngabantu. Strés énérgi ngaronjatkeun AMPK, AMPK ngaktifkeun kompléks ULK1, sarta autofagi dimimitian. Faktor tumuwuh jeung zat gizi ngaronjatkeun mTORC1, mTORC1 ngahambat ULK1, sarta autofagi tetep henteu aktip. Di hilir ULK1, kompléks Beclin-1 jeung VPS34 ngamimitian kabentukna fagofor, LC3-I ngalaman lipidasi jadi LC3-II, autofagosom nutup, ngahiji jeung lisosom, sarta muatan diuraikeun bari p62 ogé ngalaman pergantian.

Diagram éta nempatkeun unggal papanggihan métilén bulao dina péta ieu: hasil hipokampus gigireun cabang AMPK, hasil progenitor gigireun cabang mTOR.

Cara ningali ieu ngajelaskeun bédana anu siga pasalia jeung studi Xie anu kadua. Dina sél progenitor neural beurit anu keur proliférasi, ékspérimén anu misah manggihan yén 5 μM métilén bulao ngahambat proliférasi sarta ngadorong kaayaan reureuh, kalayan sél positip Ki67 ngurangan dina poé 1 jeung 3, sedengkeun diferensiasi neuronal anu geus ditangtukeun arahna tetep henteu kaganggu. Di dinya mékanismena lumangsung ngaliwatan suprési sinyal mTOR: nguranganana mTOR total jeung mTOR anu difosforilasi, dibarengan ku éksprési p70S6K jeung 4EBP1 anu leuwih handap, ditambah pangaturan turun siklin E1, B1, D1, jeung D2. Fénotipe anu dominan nyaéta kaayaan reureuh progenitor, anu ku panulis dihubungkeun jeung senéséns anu ditunda, lain nyalametkeun sél hipokampus anu ngalaman strés.

Teu aya kontradiksi antara dua makalah éta. AMPK jeung mTOR mangrupa pangintegrasi anu sénsitip kana kontéks, lain saklar anu tetep. Sél mirip neuron anu ngalaman strés bisa ngalibetkeun AMPK tanpa inhibisi mTOR anu bisa diukur, sedengkeun progenitor anu didorong ku mitogén bisa ngaréspon sanyawa anu sarua ku cara ngalambatkeun mékanisme tumuwuh anu gumantung kana mTOR. Jinis sél, kontéks strés, konséntrasi, jeung waktu pangukuran nangtukeun cabang mana anu dominan. Éta ogé sababna pangaruh métilén bulao kana énérgi mitokondria jeung rédoks kudu diasupkeun kana gambaran anu sarua: sakumaha dijelaskeun ku hiji tinjauan mékanisme neuroprotéksi, sanyawa éta boga peran minangka pamawa éléktron alternatif, ngalibetkeun sinyal antioksidan jeung anti-apoptotik, ngahambat MAO jeung NOS, sarta patali jeung pembaruan mitokondria ngaliwatan biogénésis jeung autofagi. Autofagi téh salah sahiji cabang tina profil anu boga rupa-rupa pangaruh, lain sakabéh caritana.

Naon anu henteu ditunjukkeun ku ékspérimén

Kakurangan sérum ngamodélkeun strés trofik jeung métabolik dina wadah kultur. Ieu henteu ngamodélkeun puasa dina sakabéh organisme: glukosa, asam amino, jeung uyah tetep aya dina médium dasar, sarta euweuh paripolah dahar. Konséntrasi kultur ti 20 nM nepi ka 5 μM henteu bisa dirobah jadi dosis manusa ku itungan aritmatika, lantaran nyerepna zat, pabeungkeutan kana protéin, kaayaan rédoks, métabolisme, akumulasi dina jaringan, jeung lilana paparan kabéhanana béda.

Can aya uji dina manusa anu dirancang pikeun némbongkeun fluks autofagi anu diinduksi ku métilén bulao dina pasién. Bukti mékanisme masih mangrupa panalungtikan sél, ex vivo, jeung sato, sarta tinjauan masih ngajelaskeun bukti pikeun larapna sacara klinis minangka bukti awal. Jadi, studi ieu henteu némbongkeun yén métilén bulao ngahasilkeun deui pangaruh puasa, manjangkeun umur manusa ngaliwatan autofagi, atawa ngaréngsékeun fluks autofagi dina uteuk manusa. Klaim ngeunaan nirukeun puasa jeung umur panjang merlukeun bukti klinis sorangan, sarta uji métilén bulao dina manusa pikeun indikasi séjén henteu jadi uji autofagi ngan lantaran aya patalina. Panalungtikan ngeunaan modél strés zat gizi jeung umur panjang kudu dibaca bari tetep merhatikeun wates éta.

Pikeun makalah salajengna anu anjeun baca, larapkeun daptar pariksa sacara runtuy. Kahiji, tanyakeun cabang mana anu robah: AMPK, mTOR, atawa taya duanana. Tuluy tanyakeun naha hasil LC3 dibarengan ku uji fluks atawa nangtung sorangan. Sanggeus éta, pariksa naha ngahalangan jalur éta ngaleungitkeun mangpaatna, sarta ku métode naon. Studi anu ngajawab tiluanana geus boga dasar pikeun klaim mékanisme anu kuat. Studi anu ngan ngajawab anu kahiji ukur némbongkeun sinyal idin, sarta sésa lalampahanana can dipétakeun.