Métilén biru anyar jeung pewarnaan rétikulosit: zat pewarna anu béda jeung métode sél hirup

Hiji mahasiswa nyiapkeun pangitungan rétikulosit, mesen métilén biru, nyampurkeunana jeung getih, tuluy ampir teu ningali nanaon. Babaturan sakelasna maké botol anu dilabélan métilén biru anyar sarta meunang filamén biru anu écés di jero sabagian sél beureum. Mahasiswa kahiji nganggap eusi botol kadua leuwih anyar atawa leuwih pekat. Duanana lain alesanana. Éta botol ngandung molekul anu béda.

Ieu kasalahan konsép anu jadi dasar kalolobaan kabingungan dina widang ieu. Ngaranna ngagambarkeun saolah-olah métilén biru anyar téh bets métilén biru anu geus disampurnakeun. Tapi kimiana némbongkeun hal anu béda. Métilén biru anyar N nyaéta zat pewarna fénotiazin anu misah, miboga nomer Colour Index sorangan, pola substitusi sorangan, sarta peran baku sorangan dina hématologi. Sanggeus bédana ieu écés, bagian métode séjénna (naha sél kudu hirup nalika diwarnaan, naon anu kaasup rétikulosit, kumaha posisi badan Heinz, jeung iraha krésil biru hérang dipaké) jadi gampang kaharti.

Jawaban singgetna

Métilén biru anyar N, réagén hématologi, umumna diidéntifikasi minangka Basic Blue 24 dina catetan PubChem pikeun métilén biru anyar, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, rumus C18H22ClN3S. Métilén biru biasa nyaéta métiltioninium klorida, Basic Blue 9, dina catetan PubChem-na, C.I. 52015, CAS 61-73-4, rumus C16H18ClN3S. Sacara struktur, métilén biru anyar miboga dua gugus métil dina cingcin jeung ranté samping étilamino dina posisi anu dina métilén biru dieusian ku gugus dimétilamino. Bédana éta ngarobah sipat pewarnaanana. Buku hématologi ngajelaskeun métilén biru biasa minangka zat pewarna rétikulosit anu rélatif kurang hadé, sedengkeun métilén biru anyar méré warna anu leuwih jero jeung leuwih rata, hiji babandingan anu diringkes dina topik ScienceDirect ngeunaan métilén biru anyar.

Enya, métilén biru anyar téh zat pewarna supravital. Pewarnaan supravital hartina ngawarnaan sél hirup sanggeus dikaluarkeun tina awak sarta saméméh fiksasi, sakumaha ditetepkeun dina ulasan NCBI ngeunaan prinsip pewarnaan supravital. Boh métilén biru anyar boh krésil biru hérang kaasup kana kategori ieu, sarta standar rétikulosit CLSI sacara écés ngawengku métilén biru anyar minangka zat pewarna supravital. Mahasiswa sakapeung ngagolongkeun ieu bareng jeung pewarnaan Romanowsky dina hapusan anu geus difiksasi. Cara mikir kitu henteu luyu di dieu. Lamun difiksasi heula, métodena moal jalan.

Pikeun nu maca anu keur ngabandingkeun ngaran zat pewarna anu mirip, métil biru dibandingkeun jeung métilén biru ngabahas kabingungan séjén anu leuwih gedé antara zat pewarna triarilmétana anionik jeung kulawarga fénotiazin kationik. Tinjauan pewarnaan laboratorium nempatkeun pagawéan supravital di antara métode hapusan anu difiksasi, sarta pituduh morfologi sél getih némbongkeun posisi penilaian rétikulosit dina pangitungan diferensial anu leuwih lega.

Hiji hal anu kudu diperhatikeun dina katalog: aya bentuk uyah ganda séng klorida anu misah tina métilén biru anyar kalayan CAS 6586-05-6. Ku kituna, bagian métode kudu nyebutkeun bentuk uyah jeung panyadiana, lain ngan ukur ngaran umumna.

Naon anu sabenerna dilakukeun ku pewarnaan supravital

Rétikulosit nyaéta sél beureum ngora anu geus leungit intina tapi masih ngandung sésa RNA ribosomal. Dina préparat baseuh anu teu diwarnaan, RNA éta teu katingali. Zat pewarna supravital asup kana sél hirup sarta ngendapkeun atawa ngagumpalkeun RNA éta jadi granula jeung filamén biru, nyaéta bahan rétikulofilaméntosa anu katingali dina pangamatan imérsi minyak. Ku kituna, jaringan éta mangrupa hasil pewarnaan, lain rangka anu geus kabentuk sarta ngan ngadagoan warna. Ieu sababna variabel protokol (konsentrasi zat pewarna, panyangga, babandingan getih jeung zat pewarna, suhu, waktu) sarua pentingna jeung ngaran zat pewarna.

Balukar praktisna nyaéta runtuyan léngkah anu kudu dituturkeun sacara ketat: campurkeun heula getih anu geus dibéré antikoagulan jeung zat pewarna, inkubasi, tuluy jieun hapusan sarta pariksa tanpa fiksasi jeung tanpa pewarna tandingan. Fiksasi saméméh pewarnaan, atawa pewarna tandingan anu nutupan filamén samar, ngaleungitkeun informasi anu jadi dasar pangitungan.

Protokol praktis rétikulosit maké métilén biru anyar

Teu aya hiji formulasi anu universal, jadi laporkeun formulasi anu dipaké. Tilu varian anu geus didokuméntasikeun némbongkeun rentangna.

Prosedur klasik tipe Brecher maké kira-kira 0.5 persén métilén biru anyar jeung kalium oksalat, dicampurkeun dina volume anu sarua jeung getih EDTA anu geus dicampur rata, tuluy diinkubasi kira-kira 10 nepi ka 15 menit dina suhu kamar. Sanggeus dicampur deui lalaunan, hapusan ipis wangun baji dijieun, digaringkeun ku hawa, sarta dipariksa tanpa fiksasi maké objéktif minyak 100x. Prosedur NCBI pikeun pangitungan rétikulosit ngajelaskeun alur gawé ieu jeung kerangka pangitungan anu dipaké bareng jeung éta.

Varian Dacie jeung Lewis maké 1.0 persén métilén biru anyar dina larutan uyah sitrat, dicampurkeun jeung 2 nepi ka 4 volume getih sarta disimpen dina 37 C salila 15 nepi ka 20 menit saméméh dijieun hapusan. Palaksanaan harmonisasi anyar pikeun prosedur CLSI H44 maké larutan anu leuwih éncér, nyaéta 0.1 persén dina larutan uyah anu dipanyangga fosfat dina pH 7.4, kalayan inkubasi dina 20 C salila 10 menit jeung tanpa fiksasi, sakumaha dilaporkeun dina studi harmonisasi NMB taun 2026.

Aturan pangitungan sarua dina sakabéh varian. Itung hiji sél minangka rétikulosit lamun ngandung sahenteuna dua granula atawa ruas filamén anu diwarnaan biru sarta misah, sahingga endapan zat pewarna anu nyorangan henteu kaasup. Itung sahenteuna 1,000 sél beureum dina pagawéan rutin sarta laporkeun rétikulosit minangka perséntase. Dina perséntase anu handap, sacara statistik diperlukeun leuwih loba sél. Hiji ulasan métodologi CLSI H44 nyatet yén dina kadar rétikulosit deukeut 1 persén, diperlukeun kira-kira 4,400 sél pikeun nurunkeun variasi pangitungan jadi 5 persén, dina ulasan CLSI H44 di De Gruyter. Cakram okular Miller ngajadikeun pangitungan dina jumlah gedé leuwih praktis. Saring atawa jieun larutan zat pewarna anu anyar, sabab endapanna nyarupaan inklusi granular.

Badan Heinz dina préparat anu sarua

Hapusan supravital anu sarua ogé bisa némbongkeun badan Heinz, nyaéta gumpalan hémoglobin anu geus dioksidasi jeung didénaturasi, lain sésa RNA. Dina préparat métilén biru anyar, éta katingali minangka badan buleud, mindeng nyorangan sarta deukeut mémbran, kalayan warna biru anu leuwih ngora tibatan bahan rétikulofilaméntosa. Éta henteu tahan kana fiksasi jeung pewarnaan tandingan, jadi pariksa hapusan anu teu difiksasi. Hiji protokol anyar anu maké 20 mikroliter getih EDTA jeung 20 mikroliter métilén biru anyar 1 persén sarta inkubasi 15 menit ngitung sél anu positif badan Heinz di antara 250 éritrosit, dina studi PMC anu ngalaporkeun prosedur éta.

Dua bédana nyegah salah tafsir. Kahiji, métil wungu jeung kristal wungu ngawarnaan badan Heinz leuwih kuat tibatan métilén biru anyar, sakumaha dicatet dina topik ScienceDirect ngeunaan badan Heinz. Métilén biru anyar mangrupa pilihan anu praktis lamun rétikulosit jeung badan Heinz ditaksir babarengan, lain zat pewarna husus badan Heinz anu pangkuatna. Kadua, inklusi HbH dina sipat talasémia alfa ngahasilkeun loba titik leutik di sakuliah sél sanggeus pewarnaan supravital, sedengkeun badan Heinz klasik jumlahna leuwih saeutik, leuwih gedé, sarta mindeng patali jeung mémbran. Endapan zat pewarna nyaéta hal katilu anu nyarupaanana: tempatna di luar bidang fokus sél sarta béda-béda antara lapang pandang.

Krésil biru hérang dibandingkeun jeung métilén biru anyar

Duanana mangrupa zat pewarna supravital pikeun rétikulosit, tapi standardisasi leuwih ngautamakeun salah sahijina. Métode rétikulosit CLSI H44-A2, anu dimekarkeun babarengan jeung International Council for Standardization in Haematology sarta didaptarkeun dina kaca standar CLSI H44, netepkeun pewarnaan getih EDTA ku métilén biru anyar minangka métode pangbanding manual. Pangajaran hématologi klasik ogé sapuk ngeunaan tampilanna: métilén biru anyar méré pewarnaan filamén anu leuwih jero jeung leuwih rata, sedengkeun krésil biru hérang leuwih loba variasina antara bets jeung sampel.

Status éta perlu katerangan pangwates. Pituduh ICSH pikeun évaluasi alat analisis narima mikroskopi manual maké métilén biru anyar minangka pendekatan pangbanding rujukan, tapi nyebutkeun yén éta subjektif sarta rélatif kurang présisi, kalayan prosedur rujukan sitométri aliran leuwih diutamakeun lamun aya. Hiji babandingan taun 2022 kana 100 spésimén manggihan bias anu leuwih handap relatif kana alat analisisna nalika maké krésil biru hérang tibatan métilén biru anyar, dilaporkeun dina babandingan métode pewarnaan di PMC. Ringkesan anu bisa dipertanggungjawabkeun pikeun mahasiswa: paké métilén biru anyar minangka pangbanding manual anu dibakukeun, pariksa métode krésil biru hérang lokal naon waé ku ngabandingkeunana jeung éta atawa jeung métode otomatis, sarta antisipasi sebaran hasil anu leuwih lega tina mikroskopi manual dina duanana pilihan. Literatur standardisasi anu leuwih heubeul ogé nganjurkeun Azure B anu dimurnikeun minangka alternatif anu leuwih murni sacara kimia lantaran lot zat pewarna komérsial béda-béda, dina studi Marshall ngeunaan Azure B, anu ngajelaskeun naha tingkat kamurnian réagén masih dibahas dina diskusi métode.

Nyingkahan kasalahan anu ilahar

Opat kasalahan nyababkeun kalolobaan préparat gagal. Mesen métilén biru biasa tinimbang métilén biru anyar N ngahasilkeun pewarnaan anu lemah lantaran kimiana, lain lantaran téknikna. Ngalakukeun fiksasi atawa pewarnaan tandingan saméméh pangamatan ngaleungitkeun sinyal supravital. Ngitung endapan zat pewarna minangka granula ngajadikeun hasil leuwih luhur tibatan sakuduna, anu bisa dicegah ku aturan dua granula jeung zat pewarna anu disaring. Ngitung sél anu saeutik teuing dina perséntase rétikulosit anu handap ngahasilkeun angka anu katingalina présisi tapi miboga wates kapercayaan anu lega. Unggal kasalahan miboga ciri anu sarua: ahli mikroskopi nyalahkeun mikroskop pikeun hasil anu sabenerna geus ditangtukeun dina léngkah réagén.