Cabbiridda saamaynta buluugga methylene ee mitokondriyada: ogsijiin, ATP, iyo danabka xuubka

Ka soo qaad in shaybaar uu buluugga methylene ku daro mitokondriyo neefsashadoodu liidato, dabadeedna arko isticmaalka ogsijiinta oo kordha. Weedha sida dabiiciga ah loo qori lahaa waa in dheehu soo celiyey shaqada mitokondriyada. Weedhaasi waxay noqon kartaa mid khaldan. Qulqulka ogsijiinta, samaysanka ATP, iyo danabka xuubku waa saddex fikradood oo kala duwan. Waxay wadaagaan isla xubinta yar ee unugga, sida kaydinta nuqulka, isku-waafajinta, iyo wadaagistu u wadaagaan isla galka daruurta: way xiriiraan, laakiin xeerar kala duwan ayaa maamula. Haddii mid lagu khaldo mid kale, fasiraaddu way fashilantaa, xitaa marka cabbir kasta farsamo ahaan sax yahay.

Buluugga methylene wuxuu jahawareerkan ka dhigaa mid u badan inuu dhaco, sababtoo ah wuxuu ka qaybqaataa nidaamka uu cabbirayo. Waa walax wareegta falcelinnada redox oo elektaroonno ka aqbasha qaybaha hore, kuna deeqda qaybaha dambe; waa katayoon dufan-jecel oo ku urura mitokondriyada tamarta leh; sidoo kalena waa iskudhis buluug aad u daran leh oo nuuga kana sii daaya iftiin isla aagagga hirarka ee walxaha tilmaamaha caadiga ah. Hal cabbir ma qaadi karo culayskaas. Habka lagu kalsoonaan karo, ee lagu muujiyey daraasadaha mitokondriyada ee Budapest, waa in la cabbiro qulqulka ogsijiinta iyo heerka samaysanka ATP iyo danabka xuubka iyo sii-daynta haydarojiin peroksaydh, iyadoo tallaabo kasta la adeegsanayo xakamayno gaar u ah dheeha.

Cabbiridda neefsashadu waxay cabbirtaa qulqulka ogsijiinta, ma aha wax-soo-saarka tamarta

Cabbiridda neefsashada ee xallinta sare leh, ha lagu sameeyo Oroboros Oxygraph ama falanqeeyaha qulqulka ka baxsan unugga ee Seahorse, waxay sheegtaa hal shay: xawaaraha ogsijiintu u helayso elektaroonnada. Ma sheegto inta borotoon ee la bamgareeyey elektaroon kasta, inta farqiga xoogga la ilaaliyey, ama in ensaymka ATP synthase uu adeegsaday iyo in kale.

Eraybixintu waa muhiim. Mitokondriyada la go’doomiyey, walaxda la farsameeyo oo aan ADP lahayn waxay keentaa neefsashada daadashada; walaxdaas oo leh ADP ku filan heer buuxin ah waxay muujisaa awoodda fosforaylaynta oksaydhaysan; qiyaas-kordhinta kala-gooyaha isku-xidhka waxay muujisaa awoodda ugu badan ee gudbinta elektaroonnada. Unugyada aan la furin, cabbirrada Seahorse ee u dhigma waa neefsashada aasaasiga ah, neefsashada ku xiran ATP ee u nugul oligomycin, daadashada borotoonnada, neefsashada ugu badan ee FCCP qeexo, iyo isticmaalka ogsijiinta ee aan ka iman mitokondriyada oo u adkaysta rotenone iyo antimycin. In natiijooyinka Seahorse loogu yeero Xaaladda 3 iyo Xaaladda 4 waxay siinaysaa saxnaan aanu diyaarinta muunaddu taageerayn, sida qaab-dhismeedka Agilent Mito Stress Test uu caddeeyo.

Buluugga methylene wuxuu jebinayaa xiriirka la iska filayo ee u dhexeeya ogsijiin badan iyo tamar badan. Mitokondriyada maskaxda doofaarka Guinea ee la go’doomiyey, dheeh ah 100 nM ilaa 1 uM wuxuu kordhiyey isticmaalka ogsijiinta xilliga nasashada marka la isticmaalay glutamate iyo malate, succinate, iyo alpha-glycerophosphate, iyadoo kororku qiyaastii ahaa 64 boqolkiiba marka alpha-glycerophosphate la isticmaalay; haddana neefsashada ay ADP kiciso ee mitokondriyada caafimaadka qaba asal ahaan isma beddelin, sida ku cad daraasadda mitokondriyada maskaxda ee la go’doomiyey. Maadaama daadashadu korodhay halka qulqulka ay ADP kiciso aanu isbeddelin, saamiga xakamaynta neefsashada ee la xisaabiyey wuu hoos u dhacayaa. Hoos-u-dhacaasi macnihiisu ma aha in dheehu waxyeelleeyey mitokondriyada. Wuxuu ka dhigan yahay in dheehu neefsashada caadiga ah ku daray wareeg redox oo isticmaala ogsijiin. Baaritaanka isticmaalka ogsijiinta ee buluugga methylene oo keliya soo sheega kororka wuxuu cabbiray kimistari dhab ah, laakiin waxba kama sheegin ilaalinta tamarta.

Tijaabooyinka soo-celintu waxay muujinayaan isla farqigaas oo baaxad weyn leh. Markii Kakan I la xannibay, qulqulka ogsijiintu wuxuu soo kabtay qiyaastii saddex-laab, halka samaysanka ATP uu soo kabtay oo keliya qiyaastii 1.5-laab. Ogsijiin badan ayaa gaadhay elektaroodka. Qayb yar oo ka mid ah ayaa wax ka tartay soo saaridda ATP. Sheegasho kasta oo ku saabsan hagaagga fosforaylaynta oksaydhaysan waxay u baahan tahay dhinaca ATP ee xisaabta, waxaana habboon in loo muujiyo saamiga ATP halkii ogsijiin, iyadoo la caddeeyo habka loo qeexay hooseeyaha saamiga.

Baaritaannada ATP waxay cabbiraan heerka samaysanka, oo aan qadarku beddeli karin

Baaritaanka ATP wuxuu ka jawaabaa su’aal kale: intee ATP ah ayaa la soo saaraa halkii halbeeg waqti. Cabbir isbeddelka waqti ku salaysan, ha noqdo iftiinka ensaymka luciferase ee duqsiga iftiima oo daqiiqado lala socdo ama baaritaan isku-xiran oo hexokinase iyo glucose-6-phosphate dehydrogenase ah oo lagu akhriyo 340 nm, wuxuu bixiyaa heer. Hal cabbir oo wadarta ATP ah oo laga qaado barta dhammaadka wuxuu bixiyaa qadar, kaas oo ka tarjumaya samaysanka laga jaray isticmaalka, keligiina wax yar ka sheegaya fosforaylaynta oksaydhaysan.

Kooxda Budapest waxay adeegsatay habka ensaymyada isku-xiran iyadoo adenylate kinase la xakameeyey, waxayna ogaatay in buluugga methylene oo ah 1 ilaa 2 uM uu wax-soo-saarka ATP si yar balse muhiim ah uga kordhiyey mitokondriyada lagu daweeyey rotenone iyo kuwa lagu daweeyey antimycin. Taasi waa soo-celin dhab ah, waana mid qayb ahaan ah. Daraasadda sunnimada TEGDMA waxay qaab tijaabo oo kale ku gaadhay jawaab la mid ah: 5 mM oo monomeerka ilkaha TEGDMA ah ayaa neefsashada ku xiran Kakan I ka dhigay mid ka soo dhacda qiyaastii 286 ilaa 28 halbeeg oo qulqul ah, halka 2 uM oo dheeh ahi dib ugu soo celiyey qiyaastii 86.

Laba tijaabo oo xakamayn ah lagama maarmaan ayay yihiin marka la adeegsanayo iskudhis redox oo midab leh. Marka hore, isticmaal oligomycin si loo ogaado inta ka mid ah samaysanka ATP ee la cabbiray ee ku tiirsan ATP synthase. Marka labaad, samee tijaabo soo-kabashada wax lagu daray oo aan unugyo lahayn, adigoo adeegsanaya ATP qaddarkiisa la yaqaan, dhammaan walxaha falcelinta, iyo isla ururrada dheeha ee la isticmaalay, ugu yaraan 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, iyo 2 uM. Dheehu wuxuu nuugi karaa iftiinka la sii daayo, xannibi karaa ensaymka tilmaamaha, ama beddeli karaa kimistariga redox ee walxaha falcelinta; hagidda guud ee baaritaanka luciferase waxay ku talinaysaa baaritaanno bayokimiko oo lid-hubin ah si gaar ah faragelinta noocan ah loogu ogaado. Ha u qaadan in 1 uM aanu lahayn raad-cabbireed been ah sababta oo ah daminta iftiinku badanaa way ka sii daran tahay ururrada sare.

Walxaha tilmaama danabka xuubku waxay cabbiraan qaybinta dheeha, ma aha qulqulka

Safranine O, TMRM iyo TMRE, rhodamine 123, iyo JC-1 dhammaantood waa katayoonno ka gudbi kara xuubka. Waxay ku ururaan maatrikska danabka taban leh iyadoo la raacayo dheellitirka elektarookimikaad, sidaas darteed iftiinka fluorescence ee guud wuxuu si dadban u sheegaa danabka isagoo ku salaysan halka walaxda tilmaamuhu taal. Midkoodna ma cabbiro ATP ama qulqulka elektaroonnada.

Walax kasta oo tilmaame ahi waxay leedahay diyaarinta muunad ee ku habboon. Safranine O wuxuu ku habboon yahay mitokondriyada la go’doomiyey iyo unugyada xuubkooda la furay si walxo u dhex maraan, caadi ahaan qiyaastii 2 uM, iyadoo kicinta iftiinku ku dhowdahay 495 nm, sii-dayntuna ku dhowdahay 585 nm; waxaa lagu shaqaysiiyaa xaalad daminta iftiinka ah oo qaadashada walaxdu beddesho fluorescence-ka guud. TMRM iyo TMRE waxay ku habboon yihiin unugyada aan la furin marka lagu shubo ururro nanomolar oo hooseeya, iyagoo ku jira hab aan damin iftiinka, halkaas oo luminta danabku sii deyso dheeha, fluorescence-ka mitokondriyaduna hoos u dhaco; marka lagu shubo qadar sare, jihada calaamaddu way rogmataa iyadoo dheehu isagu is-damiyo. JC-1 wuxuu bixiyaa saamiga cagaar iyo casaan oo sahlan, laakiin wuxuu ku tiirsan yahay qadarka lagu shubay iyo cufka mitokondriyada, taas oo ka dhigaysa mid shaqada tiro-koobka uga liita TMRM si taxaddar leh loo xakameeyey. Isu-dheellitirradan faa’iidooyinka iyo xaddidaadaha waxaa lagu soo koobay dib-u-eegis si weyn loo isticmaalo oo ku saabsan walxaha tilmaama danabka xuubka mitokondriyada.

Buluugga methylene wuxuu faragelin ku sameeyaa iftiinka isla ururrada lagu shaqeeyo. Aagaggiisa nuugista ee ku dhow 600 ilaa 665 nm waxay ku beegmaan sii-daynta casaanka ee walxaha tilmaamaha, sidaas darteed saamaynta shaandhaynta gudaha, daminta iftiinka, iyo nuugista iftiinka kicinta dhammaantood waa suurtagal. Dheehu sidoo kale waa katayoon labaad oo dufan-jecel, qaybintiisuna waxay la beddelantaa danabka la cabbirayo. Difaacu waa cabbirro dheeraad ah iyo muunado madhan: walaxda tilmaamaha oo keliya, dheeha oo keliya, walaxda tilmaamaha oo lagu daray urur kasta oo dheeha ah, baabi’inta buuxda ee danabka iyadoo FCCP loo adeegsanayo tixraaca eber, iyo haddii ay suurtagal tahay walax labaad oo tilmaame ah oo muuqaal ahaan ka duwan. Daraasadda hareer-maridda Kakan III waxay tusaale u dejisay arrintaas iyadoo ku celisay soo-celinta danabka xuubka iyadoo adeegsanaysa labadaba safranine O iyo TMRM ka dib xannibaadda antimycin iyo myxothiazol, kana heshay soo-kabasho isku nooc ah. Hal walax oo tilmaame iftiin ahi waa tilmaan. Laba walxood oo tilmaame oo madax-bannaan waa caddayn.

Saddex diyaarino, saddex su’aalood oo kala duwan

Mitokondriyada la go’doomiyey, unugyada xuubkooda la furay si walxo u dhex maraan, iyo unugyada aan la furin ma aha heerar dareen-cabbireed oo la isku beddeli karo oo hal baaritaan ah. Waa fikrado kala duwan oo leh mabda’yo hawlgal oo kala duwan.

Mitokondriyada la go’doomiyey waxay ilaaliyaan silsiladda gudbinta elektaroonnada, xuubka gudaha, iyo hababka maatrikska, iyagoo meesha ka saaraya xuubka unugga, cytosol-ka, iyo qaab-dhismeedka shabakadda. Ka-saaristaasi waa ujeeddada: walxaha la farsameeyo, ADP, xannibayaasha, iyo ururrada dheeha si sax ah ayaa loo qeexaa, sidaas darteed waddo gaar ah ayaa la aqoonsan karaa. Khasaaruhu waa luminta sahayda dabiiciga ah ee walxaha la farsameeyo, gudbinta calaamadaha, iyo baahida tamarta.

Unugyada xuubkooda la furay waxay mitokondriyada ku hayaan qayb weyn oo qaab-dhismeedka unugga ah, iyagoo u oggolaanaya walxaha la farsameeyo ee dibadda laga keenay iyo ADP inay ka gudbaan xuubka unugga ee la furay. Waa aaladda ku habboon in cillad ku jirta waddada walax la farsameeyo lagu aqoonsado iyadoo lagu jiro xaaladda unugga. Furitaanka xad-dhaafka ahi wuxuu dhaawacaa xuubka dibadda, waxaana dhaqmaya nidaaminta cytosol-ka.

Unugyada aan la furin waxay ilaaliyaan wax kasta: xannibaadda xuubka unugga, walxaha elektaroonnada bixiya ee cytosol-ka, gudbinta walxaha la farsameeyo ee gudaha ka yimaada, shabakadda mitokondriyada, iyo baahida ATP. Iyaga ayaa ugu dhow xaaladda dabiiciga ah, uguna fog kala-soocidda habka shaqada, sababtoo ah qaadashada dheeha, heliddiisa elektaroonnada, iyo ku xannibiddiisa qaybo gaar ah dhammaantood waxay qaabeeyaan heerka dheeha ee dhab ahaan mitokondriyada gaadha.

Daraasadda TEGDMA waxay si ula kac ah u adeegsatay dhammaan saddexda heer: mitokondriyada maskaxda ee la go’doomiyey si loo baaro soo-celinta oksaydhaynta iyo danabka ee dheeha; unugyada asliga ah ee dhuuxa iligga oo xuubkooda la furay, badanaa si meesha cilladdu ka jirto loogu koobo oksaydhaynta walxaha la farsameeyo ee ku xiran Kakan I; iyo unugyada asliga ah ee aan la furin si loo cabbiro saamaynta saafiga ah ee jireed ee 2 uM oo dheeh ahi ku leeyahay isticmaalka ogsijiinta ee la xakameeyey. Akhristayaasha isbarbar dhigaya cabbirrada mitokondriyada ee diyaarino kala duwan, sharaxaadda wehelisa ee ku saabsan sida buluugga methylene elektaroonnada ugu dhaqaajiyo silsiladda neefsashada waxay bixisaa asalka waddada, halka hagaha akhrinta daraasadaha neefsashada ee buluugga methylene uu sharxayo macquulka qaddarka iyo xannibayaasha.

Xakamaynnada uu dheeh firfircoon oo redox ahi u baahan yahay

Walax wareegta falcelinnada redox waxay u baahan tahay liis xakamayn oo ka dheer kan xannibe caadi ah, sababtoo ah kimistariga dheeha oo keliya ayaa ku dayan kara hababka noolaha.

Cabbiridda neefsashada, isticmaal qol ay ku jirto oo keliya xal xasiliya pH si loo ogaado leexashada cabbirka, qol ay ku jiraan xalkaas iyo dheeha balse aanay ku jirin walxo noole, dheeha oo lagu daray walax kasta oo elektaroonno bixisa oo unugga ka baxsan kuna jirta baaritaanka, iyo rotenone iyo antimycin dhammaadka lagu daro si loo qeexo isticmaalka ogsijiinta ee aan ka iman mitokondriyada ee unugyada aan la furin. Ogow in dheeha elektaroonno helay uu mar kale oksaydhaysmo isagoo elektaroonnada u wareejinaya ogsijiin si uu u sameeyo haydarojiin peroksaydh, sidaas darteed muunad madhan oo dheeh keliya ah oo aan lahayn deeq-bixiye elektaroonno waxay ka yaraysaa qiyaasta isticmaalka ogsijiinta ee aan unugyo lahayn, kaas oo soo baxa marka NADH ama NADPH la heli karo.

Haydarojiin peroksaydh, ka doorbido Amplex UltraRed oo la qiyaas-habeeyey iyo peroxidase-ka horseradish dheehyada DCFDA ee aan xulashada gaar ah lahayn, ku xaqiiji catalase, oo baar ku-tiirsanaanta iftiiminta, maadaama dheehu yahay walax iftiinku kiciyo. Daraasadda mitokondriyada maskaxdu waxay ogaatay in culayska peroksaydhku kordhay in ka badan afar-laab marka dheehu ahaa oo keliya 100 nM, halka ka-saaristiisu gaabis noqotay, iyadoo peroksaydhku si toos ah uga samaysmay dheeha elektaroonno helay oo aan la soo marin superoxide dhexdhexaad ah. Faahfaahinta xulashada walxaha tilmaamaha iyo xakamaynnada iftiinka waxaa lagu sharxay maqaalka wehelka ah ee ku saabsan cabbiridda noocyada ogsijiinta ee falcelinta leh ee tijaabooyinka dheeha, halka su’aasha guud ee ah goorta peroksaydhku u shaqeeyo calaamad ahaan ama culays ahaan lagu sharxay iyada oo ay weheliso dheellitirka redox ee unugga iyo sheegashooyinka ka-hortagga oksaydhaynta.

Sheegashooyinka waddada, baar labada goobood ee xannibayaasha Kakan III: antimycin A oo jooga goobta Qi iyo myxothiazol oo jooga goobta Qo, kuna dar barta dhammaadka Kakan IV oo leh cyanide. Daraasad hore oo maskaxda jiirka ah ayaa soo sheegtay in dheehu soo celiyey neefsashada rotenone xannibay balse aanu soo celin tan antimycin xannibay, halka daraasaddii dambe ee saddexda nooc ee xayawaan ay heshay soo-celin qayb ahaan ah marka labada xannibe la isticmaalay iyo caddayn muujinaysa in cytochrome c si toos ah u helay elektaroonno. Hareer-maridda u arag mid la jaanqaadaysa xogta cusub, halkii aad ka arki lahayd arrin si kama dambays ah loo xaqiijiyey, maadaama ururka dheeha, goobta xannibaha, xaaladda walaxda la farsameeyo, iyo qaybinta dheehu dhammaantood beddelaan waddada la arkayo.

Jadwalka xulashada baaritaanka

Isticmaal jadwalkan si aad cabbirka uga doorato su’aasha, ee ha samayn sida ka soo horjeedda.

Sheegashada ugu yar ee lagu qanci karo waxay isla ururrada dheeha, 100 nM, 300 nM, 1 uM, iyo 2 uM, ku tijaabisaa qulqulka ogsijiinta ee xaaladaha daadashada, ADP, oligomycin, iyo kala-gooyaha isku-xidhka, heerka samaysanka ATP, danabka xuubka iyadoo la doorbidayo laba walxood oo tilmaame ah, iyo sii-daynta peroksaydhka ee la qiyaas-habeeyey iyadoo la adeegsanayo catalase iyo xakamayno aan unugyo lahayn. Soo sheeg cabbirrada isku-xiran: qulqulka ogsijiinta iyo heerka ATP iyo ATP halkii ogsijiin iyo danabka iyo peroksaydhka. Mid kasta oo tirooyinkaas ka mid ah oo keligiis la soo sheego waa cabbir macne raadinaya.