Methylene blue oo loo adeegsado midabaynta DNA iyo RNA: adeegsiyada jellada iyo xuubabka

Arday ayaa sameeya kala-soocidda jel agarose ah, ku midabeeya methylene blue, mana arko wax halka uu filayay xarriiq dhalaalaysa. Qaybta ku xigta, cilmi-baare heerka ka dambeeya doktor-nimada ah ayaa isla dhalada buluugga ah ku midabeeya xuub Northern ah, wuxuuna saddex daqiiqo gudahood helaa xarriiqyo ribosoom oo cad. Ardaygu wuxuu ku soo gunaanadaa in jelku fashilmay. Jelku ma fashilmin. Labada hawlood way kala duwanaayeen, isla midabkuna wuxuu uga jawaabaa xasaasiyad kala duwan, midab asal oo kala duwan, iyo xeerar kala duwan oo ku saabsan waxa xiga.

Midabaynta DNA ee methylene blue iyo midabaynta RNA ee methylene blue waxay wadaagaan kiimiko, balse ujeeddo ma wadaagaan. Jelka dhexdiisa, midabku wuxuu muujinayaa inta asiidh nukliyeer ah ee ku jirta shabakad daloolo leh. Xuubka dushiisa, wuxuu muujinayaa in wareejintu shaqaysay iyo in marinnada si isku dheellitiran loo raray. Marka kala duwanaantaas la fahmo, habraacyada, xuduudaha ogaanshaha, iyo xaddidaadaha iswaafajintu way caddaadaan.

Jawaabta kooban

Methylene blue waa midab fidsan oo leh danab togan, kuna xirma asiidhyada nukliyeerka si aan ahayn isku-xidh kovalent ah oo dib looga furfuri karo. Wuxuu taas ku sameeyaa isku-dar ah soojiidashada korontada ee fosfaytka, dhexgalka lammaanayaasha saldhigyada, iyo ku-xidhashada jeexda yar. Furfuristaas suurtagalka ahi waa ujeeddada. Xarriiqa waa la midabayn karaa, waxaa lagu arki karaa iftiinka muuqda, waa la diiwaangelin karaa, dabadeed midabka waa laga saari karaa ama waa la nadiifin karaa si loogu adeegsado klonayn, isku-lammaanin, ama baaritaan kale oo probe ah.

Midabaynta jelka agarose ee DNA laba-xarigle ah iyadoo la adeegsanayo methylene blue, habka caadiga ah ee degdegga ahi waa 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) oo biyo ku jira, qiyaastii 15 daqiiqo oo midabayn ah iyo qiyaastii 15 daqiiqo oo midabka biyo looga saaro, laguna eego sanduuq iftiin cad. Xuubabka, habka caadiga ah ee Northern blot waa 0.02 ilaa 0.04 percent oo midab ah oo ku jira sodium acetate u dhow pH 5.2, dhowr daqiiqo oo midabayn ah ka dib wareejinta iyo ku-xajinta, dabadeed biyo ku raacin iyo midabka oo si buuxda looga saaro ka hor isku-lammaaninta. Xasaasiyaddu waa xaddidan tahay: tobannaan ilaa boqollaal nanogram halkii xarriiq jel ah marka xaaladuhu wanaagsan yihiin, hagayaasha taxaddarka lehna waxay sheegaan 0.5 ilaa 1 microgram. Taasi waxay dhowr darajo oo tobanle ah ka sarraysaa xadka ogaanshaha ethidium bromide iyo midabada SYBR. Xuubabka ma laha hal xad ogaansho oo waxtar leh oo ku saabsan transcript gaar ah, sababtoo ah midabku inta badan wuxuu muujinayaa RNA-ga ribosoomka ee badan iyo wadarta walxaha la raray. Ha ku beddelin midkoodna xal kaabis ah oo tafaariiq ahaan loo iibiyo. Hababka la xaqiijiyey waxay ku salaysan yihiin midab heer falanqayn ah, xalal dheellitireyaal si qeexan loo diyaariyey, iyo maarayn aan RNase lahayn marka RNA ku lug leeyahay.

Sida ku-xidhashadu u shaqayso, iyo halka ay marin-habaabiso

Qaabka waxtarka leh wuxuu leeyahay saddex qaybood. Marka hore, nidaamka giraannada ee danabka togan leh waxaa soo jiita laf-dhabarta fosfaytka ee danabka taban leh. Daraasadaha spectroscopic-ku waxay muujinayaan in qaybtan soojiidashada korontadu ku badan tahay marka milixdu yar tahay, halka qaabaynta iyo firfircoonida molikuyuulladu ay dhexgalka iyo ku-xidhashada jeexda yar u aqoonsadaan qaabab deggan oo DNA laba-xarigle ah, sida lagu soo koobay daraasad spectroscopic ah oo ku saabsan ku-xidhashada methylene blue ee DNA. Marka labaad, waxaa jira xoogaa doorbidid GC ah, iyadoo qaabayntu doorbidayso kala-dambaynta CpG iyo GpC, tijaabooyinkuna ay sheegeen ku-xidhasho doorbidan oo ku wajahan qaababka laba-xarigle ee GC ku badan yahay, sida ku cad shaqada ku saabsan doorbididda dhexgalka methylene blue, balse qaababka laba-xarigle ee AT sidoo kale way ku xirmaan. Midabaynta caadiga ahi gaar uma aha taxane gaar ah. Marka saddexaad, DNA hal-xarigle ah iyo RNA waxay inta badan ku xirmaan soojiidashada korontada iyo isdulsaarka saldhigyada la gaari karo iyo qaybaha laba-xarigle ah, taas oo sababta in xoogga midabayntu ku kala duwanaado dhererka, taxanaha, iyo qaab-dhismeedka labaad.

Laba arrimood ayaa taas ka dhasha. Maadaama ku-xidhashadu aanay kovalent ahayn, midabku wuu ka baxaa marka la dhaqo. Xarriiqa polyacrylamide si degdeg ah ayay u libdhaan haddii aan si ula kac ah loo xajin, waxaana jira nooc gaar ah oo xajin joogto ah sameeya sababta oo ah midabaynta caadiga ahi waa ku-meelgaar, sida ay Soto iyo Draper uga sharxeen jellada PAGE. Maadaama midabku yahay walax kicisa falcelin marka iftiin ku dhaco, iftiin xooggan oo muddo dheer lagu saaro DNA midabaysan iyadoo ogsijiin jirto wuxuu oksaydhayn karaa guanine, ugu dambaynna wuxuu jeexi karaa xarigyada. Habkan waxaa lagu faahfaahiyey shaqada ku saabsan oksaydhaynta guanine ee uu methylene blue iftiinka ku kiciyo. Ku-eegidda iftiin cad muddo kooban waxay ka fogaanaysaa dhaawaca UV ee si fiican loo yaqaan ee habraacyada caadiga ah ee ethidium bromide, faa'iidadaasna waa dhab marka walxaha loo soo saaro adeegsi dambe. Iftiinka muuqda wuu ka dabacsan yahay, balse waxyeello la'aan ma aha. Iftiiminta gaabi marka DNA la klonayn doono. Kiimikada iftiinka ee ballaadhan ee ka dambaysa taxaddarkaas, eeg labada waddo ee kiimikada iftiinka ee methylene blue. Lammaanaha redox iyo xaaladaha danabka ee sharxaya sababta qaabka oksaydhaysani u xirmo halka qaabka la dhimay aanu u xirmayn, eeg kiimikada qaab-dhismeedka iyo sifooyinka methylene blue.

Hawsha koowaad: midabaynta gudaha jellada

Midabaynta jelku waxay ka jawaabtaa hal su'aal: xarriiqan ma ku jiraa asiidh nukliyeer ah oo ku filan in isha lagu arko. DNA laba-xarigle ah oo agarose ku jira ayaa ah xaaladda sida ugu fiican loo daraaseeyey. Habkii asalka ahaa ee midabaynta jelka methylene blue ee Flores iyo asxaabtiisa wuxuu xaqiijiyey habraaca degdegga ah ee 0.02 percent ee agarose 1 percent ah, wuxuuna muujiyey soo-saarid iyo klonayn guul leh ka dib. Isla habraaca alaab-qeybiyaha ayaa ku qoran bogga badeecadda methylene blue ee IBI Scientific, kaas oo dhinac-dhinac u taxaya habka xuubka ee 0.04 percent iyo nooca jelka ee degdegga ah.

Habraaca la fulinayo:

1. Kala-soocidda jelka u samee si caadi ah. Midabee ka dib electrophoresis, ee ha midabayn inta uu socdo, haddii aan wareejinta ama tayada kala-soocidda lagu xaqiijin hab wax laga beddelay.
2. Ku dhex rid methylene blue 0.02 percent w/v ah oo ku jira biyo la miiray, adigoo si tartiib ah u dhaqdhaqaajinaya, qiyaastii 15 daqiiqo.
3. Midabka kaga saar biyo dhowr jeer la beddelo, qiyaastii 15 daqiiqo guud ahaan, ilaa midabka asalka ah ee shabakaddu yaraado oo xarriiqa kala muuqdaan.
4. Isla markiiba ku sawir qalab iftiin cad bixiya.

Agarose iyo polyacrylamide si kala duwan ayay u dhaqmaan. Agarose wuxuu midabka ku hayaa shabakadda, sidaas darteed midab-ka-saaristu waa tallaabada gaabiska ah. Jellada polyacrylamide ee dhuuban si degdeg ah ayay u midabaysmaan, balse sidoo kale si degdeg ah ayay midabka u lumiyaan, taas oo caawisa jarista walxaha loo diyaarinayo adeegsi dambe, laakiin waxyeellaysa diiwaannada la kaydinayo. Oligonucleotides la sameeyey oo ku jira polyacrylamide waxaa lagu ogaan karaa isla habka 0.02 percent muddo 20 ilaa 30 daqiiqo ah, iyadoo marar badan biyo lagu dhaqo, lana raacayo hababka PAGE ee la dejiyey ee qaabka Current Protocols. Noocyo aad loo khafiifiyey oo ku dhow 0.0002 percent kuna jira TBE khafiif ah ayaa laga soo sheegay oligos loo diyaarinayo adeegsi dambe muddo dhowr saacadood ah, balse caddayntoodu way ka liidataa.

Kala duwanaanta DNA iyo RNA waa muhiim. DNA laba-xarigle ah wuxuu bixiyaa ku-xidhashada qaabaysan ee ugu xooggan. RNA iyo DNA hal-xarigle ah way midabaysmaan, balse si ka daciifsan oo aan si fudud loo saadaalin karin. Jellada RNA ee agarose formaldehyde leh, shaybaarrada badankoodu waxay ka boodaan midabaynta buluugga ah ee gudaha jelka, marka horena RNA waxay u wareejiyaan xuub, dabadeed halkaas ayay ku midabeeyaan. Tallaabadaas waxay calaamad jel oo daciif ah ku beddeshaa calaamad xuub oo ka cad iyo diiwaan rarista ah.

Hawsha labaad: midabaynta xuubabka

Midabaynta xuubku waxay ka jawaabtaa su'aal kale: wareejintu ma shaqaysay, marinnadana ma la isbarbar dhigi karaa. Adeegsiga caadiga ahi waa midabaynta Northern blot ee Herrin iyo Schmidt ee midabka dib looga saari karo. Asal ahaan waxay ahayd 0.04 percent oo midab ah oo ku jira 50 mM sodium acetate oo pH 5.0 ah, muddo 2 ilaa 3 daqiiqo ah, dabadeed biyo lagu raaciyo. Midabka waxaa laga saari karaa SDS khafiif ah oo SSPE ku jira ka hor isku-lammaaninta.

Nooca casriga ah ee aadka loo isticmaalo wuxuu u socdaa sidan:

1. RNA ama DNA qaab-dhismeedkiisii laga furfuray u wareeji nylon ama nitrocellulose, dabadeed ku xaji isku-xidhid UV ama kululayn si muunaddu aanay u lumin inta la midabaynayo.
2. Ikhtiyaari balse caadi ah: xuubka ku qoy acetic acid 5 percent ah qiyaastii 15 daqiiqo.
3. Ku midabee 5 ilaa 10 daqiiqo methylene blue 0.02 ilaa 0.04 percent ah oo ku jira 0.3 ilaa 0.5 M sodium acetate u dhow pH 5.2.
4. Ku raaci oo midabka kaga saar biyo muddo 5 ilaa 15 daqiiqo ah, diiwaangeli, dabadeed ka saar midabka hadhay ka hor isku-lammaaninta.

Nylon danab togan leh ayaa ugu badan shaqada Northern. Nitrocellulose sidoo kale wuxuu ku shaqeeyaa isla habraaca acetic acid iyo acetate. Sawirka waxaa loo adeegsadaa xaqiijinta wareejinta, isbarbardhigga xarriiqa 28S iyo 18S (ama 23S iyo 16S ee RNA bakteeriyada), calaamadinta taxanayaasha cabbirka iyo halbeegyada, iyo haynta diiwaan qiyaas ah oo isu-dheellitirka wadarta RNA ah. Hababka Northern ee la daabacay waxay cabbiraan xarriiqa ribosoomka ee midabaysan si loo hubiyo rarista, oo ay ku jirto shaqo cilmiga caanaha ah oo adeegsatay xarriiqa ribosoomka ee methylene blue loogu sameeyey isu-dheellitir. Xuubabka Southern isla sidaas ayaa loo arki karaa, balse midabku aad ayuu uga hirgalay hubinta rarista iyo wareejinta Northern. DNA-ga Southern-na waa la furfuraa ka hor wareejinta, sidaas darteed tirooyinka xasaasiyadda jelka si toos ah uguma shaqeeyaan.

Xuduudaha ogaanshaha iyo midabka asalka ah: halka buluuggu ku liito

Isbarbardhigga hoose si ula kac ah ayuu u yahay qiyaas. Waxqabadka midabku wuxuu ku xiran yahay boqolleyda jelka, ballaca xarriiqda, qalabka aragga, iyo sida nidaamsan ee midabka looga saaro. Tiro kasta u qaado qiyaas darajo tobanle ah, ee ha u qaadan qeexid go'an.

Xakamaynta midabka asalka ah ayaa go'aamisa in calaamadda xaddidan la adeegsan karo iyo in kale. Midabka aan ku xirnayn walxaha aad buu u muuqdaa, sidaas darteed kala-soocidda muuqaalka waxay ka timaaddaa ka saarista midabka aan ku xirnayn iyadoo aan laga siibin midabka ku xiran. Midab ka xoog badan dhif ayuu xasaasiyadda kordhiyaa. Inta badan wuxuu kordhiyaa waqtiga midab-ka-saarista. Samee taxane khafiifin ah adigoo isticmaalaya isla jelka, xuubka, iyo kamaradda, kuna shaqee keliya inta cufnaanta muuqaalka ee la isu geeyey ay weli saami la tahay qaddarka la geliyey. Methylene blue wuxuu taageeraa isu-dheellitirka rarista ee qiyaas-tireed ah. Ma aha baaritaan tiro-koob sax ah oo leh baaxad cabbir oo ballaadhan, sababtoo ah awoodda xuubka, waxtarka wareejinta, buuxsanaanta, iyo midab-ka-saaristu way ku kala duwan yihiin marinnada.

Xaddidaadaha iswaafajinta: waxa sii shaqeeya ka dib midabaynta

Klonayn ka dib midabaynta buluugga ah waa la muujiyey. Flores iyo asxaabtiisu waxay jareen xarriiqyo agarose oo midabaysan, DNA-gii ayay soo saareen, dabadeed isku xireen oo geliyeen unugyo. Waxay sheegeen klonayn ka wanaagsan tii ka dambaysay ethidium bromide iyo UV. Sababta u badan waa dhaawac iftiin oo yar, ee ma aha faa'iido ka timid midabka laftiisa. Ku-haynta iftiinka cad gaabi, DNA-ga la soo saarayna mari nadiifinta caadiga ah ee soo-saarista jelka.

PCR iyo taxane-akhrisku waxay leeyihiin caddayn ka kooban. Midabka hadhay wuxuu ku xirmaa asiidhyada nukliyeerka, sidaas darteed midabka ka saar oo nadiifi ka hor tallaabooyinka ensaymyada. DNA si habboon looga sifeeyey jel buluug ah waxaa la filayaa inuu shaqeeyo, balse inta midab ee hadhay ee ay u dulqaadan karaan polymerases kala duwan iyo kiimikooyinka taxane-akhrisku si fiican looma cabbirin. Ha u qaadan inay u dulqaadanayaan.

Isku-lammaaninta blot-ku way la jaanqaadaysaa marka kala-horraynta si adag loo raaco: wareeji, ku xaji, midabee, diiwaangeli, midabka ka saar, isku-lammaani. Kala-horrayntaas waa naqshadda Herrin iyo Schmidt. Midabaynta ka hor wareejinta, ama ka boodista midab-ka-saaristu, waa hab ka duwan oo u baahan xaqiijin u gaar ah. Ka dib marka midabka laga saaro, ka-saarista probe-ka iyo dib-u-baarista probe kale ee caadiga ahi si caadi ah ayay u socdaan. Midabaynta heerka unugga ee isla qoyska midabkan iyo sababta habka lakabyada la xajiyey aanu ugu shaqayn hababka unugyada nool, eeg atlaska midabaynta mikroskoobka.

Jarista xarriiqa waxay u shaqaysaa agarose loo diyaarinayo adeegsi dambe iyo oligos PAGE ah oo lagu helay buluugga, haddii laga fogaado nooca xajinta joogtada ah. Soo-saarista koronto ka dib midab-ka-saaristu kiimiko ahaan waa macquul walax si dib looga furfuri karo u xirmaysa, balse xogta xakamaysan ee wax-soo-saarka ee si gaar ah methylene blue ugu saabsan way yar tahay. Ka saar milixda ama walxaha soo daadi ka dib soo-saarista.

Khaladaadka soo noqnoqda

Xarriiqyada jelka ee daciifka ahi badanaa waxay ka dhigan yihiin in cufka walaxdu aad ugu yar yahay midab lagu arko midabkiisa, gaar ahaan bartilmaameedyada gaaban ee hal-xarigle ah ama RNA. Rar qaddar badan, isticmaal midab cusub, dheeree midabaynta ka hor inta aanad xoogga kordhin, oo midab-ka-saarista jooji waqti ka horreeya. Jel gebi ahaan buluug ah oo aan xarriiqa laga kala arki karin badanaa wuxuu ka dhigan yahay midabayn xad-dhaaf ah ama biyaha oo aan ku filan loo beddelin. Xarriiqa PAGE ee libdhaya waa kiimiko la filayo, ee ma aha midabayn fashilantay. Si degdeg ah u sawir. Midabka asalka ah ee xuubka oo aan sinnayn wuxuu tilmaamayaa laablaab, xumbo, faro ku haray, dhaqdhaqaajin aan sinnayn, ama wareejin aan meel kasta gaadhin. Ha u fasiran rarid aan sinnayn adigoon haysan hubin isku-lammaanin ah. Qaab ribosoom oo daciif ah oo kala firdhan wuxuu tilmaami karaa burbur, balse sidoo kale wareejin aan dhamaystirnayn, wadarta RNA oo aad u yar (marinnada caadiga ahi waxay qaadaan dhowr ilaa tobannaan microgram), ama midab-ka-saaris xad-dhaaf ah. Midabku wuxuu muujinayaa RNA-ga ribosoomka ee badan. Ma muujinayo transcript gaar ah. Shaqadaas probe-ka ayaa leh.

Badbaadada iyo maaraynta iyada oo aan la buunbuunin

Methylene blue wuu ka fudud yahay ethidium bromide dhinaca maaraynta, balse waxyeello la'aan ma aha. Xaashida xogta badbaadada ee hadda jirta ee MilliporeSigma waxay midabka u kala saartaa sunnaan degdeg ah oo afka laga qaato oo Category 4 ah, oo waxyeello leh haddii la liqo. Waxaa la farayaa in loo tuuro waddo qashin oo la oggolaaday, sida ku cad SDS-ka methylene blue ee Sigma-Aldrich. Ethidium bromide wuxuu leeyahay digniino ka xoog badan oo ku saabsan waxyeellada walxaha hidde-sideyaasha, oo ay ku jiraan saameyn laga shakisan yahay oo ku saabsan unugyada taranka, sida ku cad SDS-ka ethidium bromide ee Sigma-Aldrich. Jelladiisa iyo xalalkiisana badanaa gooni ayaa loogu saaraa qashin kiimiko oo khatar ah, sida lagu sheegay hagaha midabada asiidhyada nukliyeerka ee Thermo Fisher. Labadaba u raac SDS-ka iyo xeerarka hay'adda. Midabka qalalan si adag u xir oo engegan ku hay, dib u isticmaal midabka shaqada keliya sida habraacu oggol yahay, xuubabka midabaysan iyagoo qalalan ku kaydi inta u dhexaysa waraaqaha shaandhada, jelladana sawir ka hor inta xarriiqa aanay ku kala firdhin.

Xusuusnow weedha miiska shaybaarka. Jelladu waxay tijaabiyaan in rarid badan lagu arki karo iftiin cad. Xuubabku waxay tijaabiyaan wareejinta iyo rarista ka hor inta probe-ku aanu qaban shaqada xasaasiga ah. Hal midab ayaa labadaba u adeegaya, isagoo leh xasaasiyad xaddidan, ku-xidhasho dib looga furfuri karo, iyo kala-horrayn hawleed oo adag.