Ali večja poraba kisika pomeni več ATP? Spoznanja iz raziskav metilenskega modrila

Izoliran mitohondrij je v komori z gorivom, vendar brez ADP. Kisik porablja počasi. Dodamo ADP in poraba kisika se večkratno poveča. Počakamo, da ADP zmanjka, in poraba kisika se spet zmanjša. Gorivo se ni spremenilo. Spremenila se je le potreba po ATP.

To kratko zaporedje zajema celotno razliko, o kateri govori ta članek. Poraba kisika meri, kako hitro elektroni tečejo po dihalni verigi do kisika. Nastajanje ATP meri, kolikšen del tega pretoka se zajame kot uporabna energija. Oba procesa povezuje vmesni korak, protonski gradient prek notranje mitohondrijske membrane. Vse, kar spremeni tesnost sklopitve med gradientom in sintezo ATP, lahko ta dva izida premakne v različni smeri. Metilensko modrilo je tu poučen primer, saj so pri njem opazili oboje: v nekaterih pripravkih poveča porabo kisika skupaj z ATP, v drugih pa poveča porabo kisika, medtem ko ATP ostane nespremenjen ali se zmanjša.

Bralci, ki želijo najprej širši pregled prenosa elektronov, lahko začnejo z razlago, kako metilensko modrilo prenaša elektrone po dihalni verigi. Tisti, ki želijo spoznati izrazje zgodnjih poskusov s kisikom, pa lahko preberejo, kaj so prve meritve dihanja dejansko pokazale.

Dihanje, ATP in gradient med njima

Elektroni iz NADH in FADH2 vstopijo v verigo pri kompleksih I in II, potujejo prek kompleksa III do citokroma c, nato pa prek kompleksa IV do kisika. Energija, ki se sprosti pri kompleksih I, III in IV, črpa protone iz matriksa v medmembranski prostor. Ta ločitev naboja in razlika v kislosti ustvarjata protonsko gonilno silo, katere električni del, membranski potencial, je običajno prevladujoč.

ATP-sintaza omogoča protonom, da tečejo nazaj v matriks, in sproščeno energijo uporabi za združevanje ADP in fosfata v ATP. Zaporedje je torej:

poraba kisika, nato črpanje protonov, nato gradient, nato sinteza ATP.

Zaplet je v tem, da se protoni lahko vračajo tudi po drugih poteh. Vsako vračanje, ki obide ATP-sintazo, je uhajanje protonov. Zaradi uhajanja mora veriga iste protone znova črpati, da ohranja stalen membranski potencial, kar porablja več kisika, ne da bi nastalo več ATP. Dovolj močno uhajanje pomeni razklopitev: poraba kisika naraste, medtem ko ATP ostane nespremenjen ali se zmanjša, izgubljena energija pa se sprosti kot toplota.

Stanje 3, stanje 4 in razmerje dihalne kontrole

Klasično izrazje za te procese izvira iz raziskav izoliranih mitohondrijev. Stanje 3 je dihanje ob prisotnosti substrata in ADP: ATP-sintaza zmanjšuje gradient, membranski potencial upade, veriga pospeši delovanje, da ga ponovno vzpostavi, poraba kisika pa je velika, ker nastaja ATP. Stanje 4 je dihanje, potem ko ADP zmanjka: ATP-sintaza miruje, gradient naraste, visok membranski potencial ovira nadaljnje črpanje, poraba kisika pa pade na raven, potrebno za nadomeščanje uhajanja.

Razmerje dihalne kontrole, stanje 3 deljeno s stanjem 4, zato kaže, kako tesno je pripravek sklopljen. Visoko razmerje pomeni, da ADP močno uravnava dihanje. Padanje razmerja ob naraščanju dihanja v stanju 4 pomeni, da uhajanje prevzema glavno vlogo. S tega vidika postanejo spodnji rezultati z metilenskim modrilom razumljivi.

Vredno si je zapomniti en miselni model. Visok membranski potencial upočasni verigo. Zmanjševanje potenciala jo pospeši. Veriga se odziva na to, kako težavno je postalo črpanje, ne neposredno na to, ali nastaja ATP.

Ko se izida spreminjata skupaj

Najjasnejši primer sklopitve prihaja iz raziskave izoliranih mitohondrijev iz možganov morskih prašičkov z blokiranimi dihalnimi kompleksi. Pri 100 nanomolarnih do 1 mikromolarni koncentraciji metilenskega modrila se je poraba kisika v mirovanju povečala ob glutamatu skupaj z malatom, sukcinatu ali glicerofosfatu kot gorivu, dihanje, spodbujeno z ADP, pa je ostalo nespremenjeno. V mitohondrijih z zastrupljenim kompleksom I ali kompleksom III je barvilo zmerno povečalo nastajanje ATP, obnovilo membranski potencial in izboljšalo privzem kalcija. Predlagana pot je bližnjica: barvilo sprejme elektrone pred mestom blokade in jih preda citokromu c, s čimer obide poškodovani kompleks.

Drugi primer sočasnega povečanja uporablja povsem drug vir ATP. V izoliranih možganskih mitohondrijih z zavrto ATP-sintazo je metilensko modrilo še vedno spodbujalo dihanje pri vseh preizkušenih substratih. Toda sinteza ATP se je povečala le ob alfa-ketoglutaratu in glutamatu, substratih, iz katerih nastaja sukcinil CoA. Ko je oligomicin blokiral ATP-sintazo, je dodatni ATP nastal s fosforilacijo na ravni substrata, ki jo v ciklu citronske kisline katalizira sukcinil CoA-ligaza, ne pa z oksidativno fosforilacijo. Barvilo je obnovilo tudi membranski potencial, ko sta bila kompleks I in ATP-sintaza zavrta hkrati. Tu sta se poraba kisika in ATP povečala skupaj, vendar le tam, kjer je substrat omogočal drugo pot nastajanja ATP. Ob sukcinatu ali malatu se je dihanje povečalo brez dodatnega ATP. Isto barvilo, ista komora, drugo gorivo, drugačen odgovor.

Ko se izida razideta

Tudi primeri razhajanja so objavljeni in prav tako poučni. V raziskavi izoliranih mitohondrijev iz podganjih jeter iz leta 1997 je metilensko modrilo pospešilo dihanje v stanju 4 v tesno sklopljenih mitohondrijih, ki so kot substrat uporabljali sukcinat, kar je znižalo razmerje dihalne kontrole. Učinek je bil opazen že pri 0.5 mikromolarni koncentraciji in močan pri 5 mikromolarni koncentraciji, ki je blizu plazemskim ravnem po 100 miligramskem intravenskem bolusu. Pri 5 mikromolarni koncentraciji so mitohondriji tudi nabreknili, vendar se je motnja sklopitve najprej pojavila pri nižjih koncentracijah. To podpira razlago, da je uhajanje nastopilo pred strukturno poškodbo in ni bilo njena posledica. V razklopljenih mitohondrijih je barvilo spodbujalo dihanje na način, ki je bil odvisen od koncentracije in je dosegel nasičenje. Poraba kisika se je povečala v obeh pripravkih. Sinteza ATP na enoto porabljenega kisika pa ne. To je šolski primer razklopitve in prenosa elektronov v isti molekuli.

Najizrazitejše razhajanje prihaja iz mrežnice. Pri miših s pomanjkanjem AIF in fotoreceptorskih celicah, obdelanih z rotenonom, je metilensko modrilo ohranilo debelino mrežnice, označevalce fotoreceptorjev in mitohondrijsko strukturo, znižalo razmerje med NADH in NAD ter umirilo stresne poti, vključno z odzivom na nezvite beljakovine in mitofagijo. To je doseglo, ne da bi odpravilo primanjkljaj ATP. Zaščita brez obnovljene preskrbe z energijo pomeni, da je korist izhajala iz redoks ravnovesja in celovitosti mitohondrijev, ne iz dodatnega ATP. Kdor bi preživetje tkiva enačil z obnovljenim nastajanjem energije, bi ta poskus povsem napačno razumel.

Raziskave možganskih mitohondrijev temu pregledu dodajajo tudi ceno. Iste nizke koncentracije, ki so izboljšale bioenergetiko, so v vseh preizkušenih pogojih povečale tudi nastajanje vodikovega peroksida in upočasnile njegovo odstranjevanje, kar so izmerili z umerjenim testom Amplex in ne z nespecifičnim barvilom. Več ATP in več oksidanta sta prišla v paru.

Praktičen kontrolni seznam za branje

Štiri vprašanja ločijo sklopljen rezultat od razklopljenega.

Prvič, kateri izid so dejansko merili. Sama poraba kisika ne more pokazati količine ATP. Sinteza ATP, membranski potencial in razmerje dihalne kontrole dodajo vsak svoj podatek, ki ga kisikova elektroda ne more zaznati. Vodnik za branje trditev iz raziskav metilenskega modrila podrobno pojasnjuje to dosledno razlikovanje med merjenimi izidi.

Drugič, kateri substrat je oskrboval mitohondrije. Rezultat s sukcinil CoA kaže, da lahko izbira goriva odloči, ali se dodatno dihanje sploh lahko pretvori v dodatni ATP.

Tretjič, katero koncentracijo so uporabili. Metilensko modrilo v nanomolarnih do nizkih mikromolarnih koncentracijah je v možganskih mitohondrijih prineslo zmerne bioenergetske izboljšave ob večjem nastajanju oksidanta; pri pol mikromolarni koncentraciji in več je v jetrnih mitohondrijih slabšalo sklopitev; pri 5 mikromolarni koncentraciji se je pridružilo še nabrekanje. Koncentracija je del mehanizma, ne postranska podrobnost.

Četrtič, v katerem modelu so dobili rezultat. Izolirani mitohondriji razkrivajo povezave med procesi, neokrnjene celice in tkiva pa dodajo še transport, redukcijo v brezbarvno obliko in konkurenčne poti, ki sprejemajo elektrone. Laboratorijsko delo z odmerjanjem, vključno s tem, kako koncentracija in protokol oblikujeta učinke metilenskega modrila, je most med številkami iz komore in kakršno koli trditvijo o človeku.

Poraba kisika kaže pretok elektronov. ATP kaže, kolikšen del tega pretoka je bil zajet. Metilensko modrilo lahko spremeni enega ali drugega, zgornji poskusi pa kažejo vse štiri kombinacije: oba narasteta, dihanje naraste le tam, kjer substrat to omogoča, dihanje naraste ob slabšanju sklopitve in tkivo se ohrani, medtem ko ATP ostane nespremenjen. Številka na kisikovi elektrodi je začetek razlage, ne njen konec.