Metilensko modrilo in Bartonella: laboratorijske ugotovitve in omejitve kliničnih dokazov

Gojitvena posoda in bolnik imata skupno besedo, okužba, ne pa tudi istega pojma. V posodi okužba pomeni število kolonij na agarju. Pri bolniku pomeni bakterije v celicah in žilah, zdravila, ki prehajajo skozi kri in tkiva, ter imunski sistem, ki opravlja del dela. Če to dvoje zamenjamo, začne izstopajoč laboratorijski rezultat delovati kot način zdravljenja. Če ju ločimo, isti rezultat ostane to, kar je: razlog za naslednji poskus.

Prav to razlikovanje je osrednja naloga tega pregleda metilenskega modrila in bakterij Bartonella. Dve laboratorijski raziskavi iste raziskovalne skupine sta preizkusili metilensko modrilo proti bakteriji Bartonella henselae v stanjih brez rasti. Obe sta poročali o močnem delovanju v steklenih in plastičnih posodah. Nobena ni vključevala preizkušanja pri ljudeh.

Zakaj raziskovalci preizkušajo stacionarno fazo

Večina preizkusov antibiotikov uporablja rastoče celice. Ta model izpusti zahtevnejši primer: celice, ki so se prenehale deliti in prenašajo zdravila, ki ubijejo njihove rastoče sorodnice.

Bakterije Bartonella lahko vztrajajo v telesu, tudi znotraj eritrocitov in endotelijskih celic. Skupina je zato raziskala, katera odobrena zdravila lahko ubijejo B. henselae po prehodu v stacionarno fazo. Nizka MIC pri rastočih celicah ni napovedovala uničenja celic v stacionarni fazi. Rifampicin je imel zelo nizko MIC, vendar je slabo uničeval stacionarne celice, medtem ko so jih spojine z višjimi vrednostmi MIC dobro uničevale. Bralci, ki želijo splošno metodo za branje takšnih člankov, jo bodo našli v vodniku za branje raziskav o metilenskem modrilu.

Prvo presejanje: Li in sodelavci, 2019

Presejanje v stacionarni fazi iz leta 2019 v reviji Antibiotics je uporabilo en sam sev, B. henselae JK53, gojen v Schneiderjevem gojišču z 10 odstotki fetalnega govejega seruma pri 37 C in 5 odstotkih CO2. Enodnevne kulture so vsebovale večinoma razpršene celice, ki so se delile. Petdnevne kulture s približno 10 na 8. potenco enot, ki tvorijo kolonije, na mL so obravnavali kot stacionarno fazo; vsebovale so vidne agregate.

Pri preizkusu so uporabili SYBR Green I s propidijevim jodidom, umerjen z mešanicami živih celic in celic, uničenih z izopropanolom. Ker je metilensko modrilo močno obarvano, so pozitivne rezultate potrdili z mikroskopijo in nato s štetjem kolonij na krvnem agarju, kar je strožje končno merilo.

Med 1,581 odobrenimi zdravili pri koncentraciji 50 mikromolarov je metilensko modrilo po meritvi s čitalnikom mikrotitrskih plošč ohranilo 16 odstotkov živih celic, po mikroskopiji pa 25 odstotkov. Pri daptomicinu je bil delež 21 odstotkov, pri več azolih 22 do 27 odstotkov, pri gentamicinu 32 odstotkov, pri eritromicinu 66 odstotkov in pri ciprofloksacinu 74 odstotkov. Pirvinijev pamoat je bil po meritvi s čitalnikom videti učinkovitejši, vendar ga zaradi lastne fluorescence ni bilo mogoče oceniti z mikroskopijo.

Pri rastoči B. henselae je bila MIC metilenskega modrila 0.08 do 0.16 mikrograma na mL. Pri petdnevnih stacionarnih celicah in koncentraciji 5 mikrogramov na mL po enem dnevu izpostavljenosti ni bilo več zaznavnih kolonij, kar se je ujemalo z daptomicinom in pirvinijevim pamoatom pri njunih preizkušenih koncentracijah. Ločen poskus časovnega poteka uničevanja je uporabil 10 mikrogramov na mL. To so laboratorijske koncentracije izpostavljenosti, ne odmerki, in članek jih tako tudi opredeljuje. Navedena najvišja koncentracija v človeški plazmi, približno 3.9 mikrograma na mL, se v članku pojavi zgolj kot širši kontekst. Pregled farmakokinetike metilenskega modrila pojasnjuje, zakaj plazemske koncentracije ne moremo razlagati kot tkivne koncentracije.

Članek izrecno navaja dve omejitvi. Ni bilo modela biofilma niti preizkušanja kombinacij z metilenskim modrilom. Petdnevni agregati so bili skupki v stacionarni tekoči kulturi, ne validiran poskus z biofilmom. Avtorji so pozvali k raziskavam na živalih, raziskavam kombinacij in biofilmov ter preizkušanju pri drugih vrstah rodu Bartonella.

Kombinacije in celice iz biofilma: Zheng in sodelavci, 2020

Nadaljevalna raziskava iz leta 2020 v reviji BMC Microbiology je ohranila isti sev in gojišče, vendar je prešla na šestdnevne stacionarne kulture ter dodala dve stvari, ki ju prvi članek ni vseboval: kombinacije dveh zdravil in model celic iz biofilma.

Pri posameznih zdravilih z enotno koncentracijo 5 mikrogramov na mL in 24-urno izpostavljenostjo je po uporabi metilenskega modrila ostalo 3.2 krat 10 na 4. potenco enot, ki tvorijo kolonije, na mL, v primerjavi s približno 2.8 krat 10 na 10. potenco v kontroli. Ciprofloksacin, gentamicin in nitrofurantoin so na isti časovni točki pustili manj kolonij. To se razlikuje od rezultata iz leta 2019, ko pri isti nazivni koncentraciji po enem dnevu ni bilo zaznavnih kolonij. Starost kulture, gostota in ravnanje z njo so se razlikovali, zato je bilo uničevanje ponovljivo po smeri učinka, ne pa enako po obsegu. Ta razlika med poskusi je eden od razlogov, zakaj standardna preverjanja varnosti in medsebojnega delovanja ločujejo laboratorijsko moč delovanja od kliničnega učinka.

Presejanje kombinacij je najpogosteje citirani del. Koncentracija vsake sestavine je bila določena na 5 mikrogramov na mL. Tako pri azitromicinu z metilenskim modrilom kot pri rifampicinu z metilenskim modrilom po 24 urah ni bilo zaznavnih kolonij iz stacionarne faze. Enako je veljalo za obe kombinaciji s ciprofloksacinom; med 25 preizkušenimi kombinacijami so tak rezultat dosegle le te štiri. Formalne analize sinergije niso izvedli, zato je pravilen izraz kombinacija z delovanjem v teh pogojih, ne dokazana sinergija.

Poskus z biofilmom je preizkušal celice, pridobljene iz mladega razgrajenega biofilma, ne prodiranja v neokrnjen zrel biofilm. Kulture so gojili pet dni, jih razredčili in prenesli v plošče z vdolbinicami za nadaljnjih pet dni, nastanek biofilma potrdili z barvanjem s kristal vijoličnim ter ga nato pred izpostavitvijo zdravilom postrgali. Pri 5 mikrogramih na mL je samo metilensko modrilo do dneva 6 zmanjšalo število na 2.3 krat 10 na 2. potenco, kar je bilo med najboljšimi rezultati posameznih učinkovin, vendar ne nič. Obe kombinaciji z metilenskim modrilom sta do dneva 6 dosegli nič, prav tako obe kombinaciji s ciprofloksacinom.

Avtorji so opozorili na iste omejitve, ki bi jih opazil pozoren bralec: mlad postrgan biofilm namesto starega neokrnjenega biofilma, ena priročna koncentracija za vsa zdravila namesto realistične najvišje koncentracije za vsako zdravilo, le izbrane kombinacije z azitromicinom ali rifampicinom, en sev, brez živali in brez bolnikov. Poznejše raziskave kombinacij treh zdravil so bile predlagane, ne pa predstavljene.

Primerjava zasnove raziskav

Tabela je strnjen prikaz bistva tega članka. Vse levo od zadnjega stolpca je delo s kulturami. Nič iz nobenega od obeh člankov ne sodi v zadnji stolpec.

Bartonella ni Borrelia

Oba članka omenjata Borrelia burgdorferi, spiroheto, ki povzroča lymsko boreliozo, ker je preizkus z barvili izviral iz predhodnih raziskav stacionarne faze bakterij Borrelia v istem laboratoriju, kjer sta tudi metilensko modrilo in daptomicin pokazala delovanje. Ta zgodovina je koristen kontekst in pogost vir napak.

Noben poskus v nobenem od člankov o bakterijah Bartonella ne preizkuša bakterij Borrelia neposredno ob bakterijah Bartonella. Organizmi se razlikujejo, gojišča se razlikujejo, koncentracije se razlikujejo, domnevni učinek metilenskega modrila na membrano bakterij Bartonella pa je bil naveden kot domneva, ki zahteva dodatne raziskave. Rezultatov ne smemo prenašati med vrstami in noben članek ne podpira širokih trditev o parazitih. Primerjava perzistentnih celic bakterij Borrelia in Bartonella zato ločuje literaturo o obeh.

Zakaj rezultatov kultur ni mogoče pretvoriti v protokol

Zanimanje za iskanje protokola z metilenskim modrilom za bakterije Bartonella je razumljivo. Prav ta članka kažeta, zakaj je treba ta izraz obravnavati kot opozorilni znak, ne kot nakupovalni seznam.

Prvič, 5 mikrogramov na mL v vdolbinici ni predpis za zdravljenje. Ta koncentracija ne zajema absorpcije, porazdelitve, vezave na beljakovine, prodiranja v celice ali prenašanja zdravila. Avtorji so jo izbrali kot približno povprečje najvišjih koncentracij antibiotikov in navedli, da bi morale prihodnje raziskave vsako zdravilo uporabiti pri njegovi realistični koncentraciji.

Drugič, nič kolonij pomeni, da v teh pogojih zasejanja ni kolonij, ne pa sterilnega tkiva. Perzistentne celice, znotrajcelične bakterije in omejitve vzorčenja ostajajo zunaj dosega agarne plošče.

Tretjič, kombinacije, ki sterilizirajo vdolbinico, lahko v telesu odpovedo ali škodujejo. Azitromicin z metilenskim modrilom in rifampicin z metilenskim modrilom sta laboratorijski kombinaciji pri laboratorijskih izpostavljenostih. Brez farmakokinetičnih podatkov pri živalih in nadzorovanih podatkov pri ljudeh ni določenega odmerka, trajanja ali razmerja med koristjo in tveganjem. Kdor razmišlja o možnostih, naj se o njih pogovori z zdravnikom in preveri, kdaj uporaba metilenskega modrila zahteva zdravniški nadzor, preden iz podatkov iz gojitvenih posod izpelje kakršen koli sklep.

Ozek sklep, ki ga članka podpirata, je naslednji: metilensko modrilo ima ponovljivo delovanje proti nerastoči B. henselae JK53 in vitro, tudi v laboratorijskih kombinacijah dveh zdravil, pri čemer najmočnejši rezultati za kombinacije in celice iz biofilma izvirajo iz raziskave iz leta 2020. Vse drugo, tudi vprašanje, ali je to delovanje pomembno za bartonelozo pri ljudeh, ostaja nepreizkušeno.