EMB agar v primerjavi z MacConkey agarjem: izbira in interpretacija gojišč

Študent isti vzorec vode zaseje na dve plošči. Na eni se pojavijo temne kolonije z zelenim kovinskim sijajem. Na drugi se pojavijo živo rožnate kolonije z motnim halojem. Obe plošči sta bili inokulirani iz iste epruvete, inkubirani druga ob drugi in odčitani ob isti uri. Študent vpraša, katera plošča je pravilna.

Pravilni sta obe. Odgovarjata na različni vprašanji. Zmeda nastane, ko obe gojišči obravnavamo kot medsebojno zamenljiva presejalna testa za črevesne bakterije. Imata skupen namen: selekcionirati po Gramu negativne enterične organizme ter ločiti fermentatorje laktoze od nefermentatorjev, vendar ta namen uresničujeta z različno kemijo in različno vizualno logiko. Ko razumete oba osnovna koncepta, postaneta izbira plošče in odčitavanje kolonij rutinska.

Kratek odgovor

EMB agar uporablja dve barvili, eozin Y in metilensko modrilo, ki opravljata dvojno nalogo: zavirata rast po Gramu pozitivnih bakterij in se ob močnih producentih kisline obarjata, zaradi česar nastanejo temne kolonije, pri Escherichia coli klasično s kovinsko zelenim sijajem. MacConkey agar naloge loči: žolčne soli skupaj s kristalno vijoličnim zavirajo po Gramu pozitivne bakterije, laktoza omogoča fermentacijo, nevtralno rdečilo pa pokaže nastanek kisline kot rožnate ali rdeče kolonije. Če je cilj izrazit domnevni prikaz E. coli, ima EMB svoje mesto. Če je cilj jasno ločevanje rožnatih fermentatorjev laktoze od brezbarvnih nefermentatorjev, zlasti pri postopkih z blatom ali urinom, je MacConkey običajno enostavnejši za odčitavanje. Nobena plošča organizma ne identificira samo po barvi.

EMB: barvila, ki hkrati selekcionirajo in kažejo rezultat

Koncept EMB združuje selekcijo in indikacijo v istih molekulah. Protokol ASM za agar z eozinom in metilenskim modrilom opisuje EMB kot selektivno in diferencialno gojišče, pri katerem par barvil zavira številne po Gramu pozitivne organizme, fermentacija laktoze pa spodbuja privzem in obarjanje barvil. Standardna Levineova formulacija vsebuje pepton, laktozo, fosfat, eozin Y, metilensko modrilo in agar, kot je navedeno v metodi FDA BAM za Levineov EMB agar. Upoštevajte, da so starejši recepti za EMB včasih poleg laktoze vsebovali tudi saharozo, medtem ko Levineov EMB vsebuje laktozo brez saharoze, zato zabeležite, katero formulacijo uporablja vaš laboratorij.

Odčitavanje EMB pomeni opazovanje obnašanja barvil. Intenzivna fermentacija laktoze ustvari dovolj kisline, da povzroči izrazito obarjanje barvil, zaradi česar imajo kolonije E. coli temna modročrna središča in v klasičnem primeru pri odbiti svetlobi kovinsko zelen sijaj. Šibkejši fermentatorji, kot sta Enterobacter in Klebsiella, običajno rastejo kot rožnate do vijolične mukoidne kolonije brez tega sijaja. Nefermentatorji, kot so Salmonella, Shigella in Proteus, praviloma rastejo kot brezbarvne ali prosojne kolonije, ker ne povzročijo hitrega nastanka kisline, ki sproži obarjanje barvil. Po Gramu pozitivni organizmi so običajno zavrti, vendar je stopnja zaviranja različna ter je odvisna od seva in izdelka. Podrobna kemija priprave barvil, vključno z razlogom, zakaj se metilensko modrilo sploh obnaša kot kationsko barvilo, sodi v ločeno razpravo o formulacijah barvil, širši mikroskopski kontekst pa je predstavljen v atlasu metod barvanja. Ta članek se osredotoča na izbiro plošč in njihovo odčitavanje.

Zgornja slika je ponazoritev. Prikazuje pričakovano vizualno logiko: na EMB temne kolonije s sijajem, rožnate mukoidne tipe in blede tipe, na MacConkey pa rožnate v primerjavi z bledimi tipi. Uporabite jo za učenje vzorca, nato pa vsako presojo potrdite s fotografiranimi kontrolami in navodili za točno določeno gojišče, ki ga uporabljate na delovni mizi.

MacConkey: ločene naloge, preprostejše vizualno pravilo

Koncept MacConkey vsako nalogo dodeli ločeni sestavini. Protokol ASM za MacConkey agar uporablja enako opredelitev selektivnega in diferencialnega gojišča, metoda FDA BAM za MacConkey agar pa navaja njegove funkcionalne sestavine: peptone, laktozo, žolčne soli, sol, nevtralno rdečilo, kristalno vijolično in agar. Žolčne soli skupaj s kristalno vijoličnim selekcionirajo proti po Gramu pozitivnim organizmom. Laktoza zagotavlja substrat za fermentacijo. Nevtralno rdečilo deluje kot indikator pH in na mestih nastajanja kisline postane rožnato do rdeče, pri močnih fermentatorjih pa se lahko okoli kolonij oborijo tudi žolčne soli.

Pravilo odčitavanja je namenoma preprosto: rožnata pomeni fermentator laktoze, brezbarvna ali bleda pa nefermentator. E. coli je videti rožnata do rdeča, pogosto s halojem oborjenih žolčnih soli. Klebsiella in Enterobacter sta rožnata in zaradi svojih kapsul pogosto mukoidna. Salmonella, Shigella, Proteus in številne druge po Gramu negativne paličaste bakterije so videti brezbarvne. V učnih laboratorijih je pomembna tudi dodatna prednost: žolčne soli običajno zmanjšajo rojenje bakterij Proteus, zato je na MacConkey agarju lažje pridobiti izolirane kolonije kot na neselektivnih gojiščih, čeprav zaviranje ni popolno in obstajajo različice brez soli, kadar je nadzor rojenja prednostna naloga.

Molekularni razlog za takšno obnašanje barvil izhaja iz naboja in strukture. Metilensko modrilo je kationsko fenotiazinsko barvilo, katerega struktura in lastnosti pojasnjujejo njegovo afiniteto do kislih bakterijskih površin; ista afiniteta deluje tudi pri njegovem obarjanju v kislih območjih na EMB.

Primerjava na prvi pogled

Tabelo uporabljajte kot postopek odločanja. Kadar mora vaja študentom prikazati gradient intenzivnosti fermentacije z enim izrazitim skrajnim rezultatom, je primeren EMB. Kadar vaja zahteva hitro binarno razvrstitev pred biokemijsko potrditvijo, je primeren MacConkey.

Katero gojišče za kateri vzorec

Pri vajah z vodo, namenjenih domnevnemu prepoznavanju fekalnih koliformov ali E. coli, je EMB privlačen zaradi vizualno značilnega sijaja. MacConkey je prav tako primeren za enterične po Gramu negativne bakterije in se je zgodovinsko uporabljal pri preiskavah vode, vendar nobena od teh plošč ne nadomešča predpisane regulativne metode za vodo, ki lahko glede na test določa gojišča, kot sta modificirani mTEC ali MI. Preverite metodo, ki jo mora vaš laboratorij upoštevati.

Za ločevanje fermentatorjev od nefermentatorjev pri vzorcih blata je MacConkey na splošno uporabnejši od obeh. Pri praktični obdelavi blata za Salmonella ali Shigella se običajno dodajo bolj selektivna enterična gojišča, kot sta XLD ali Hektoen enteric, namesto da bi se uporabljal samo MacConkey.

Pri učnih vajah z urinom, ki posnemajo klinični potek dela, MacConkey kombinirajte s krvnim agarjem. MacConkey omogoča zgodnje razvrščanje po Gramu negativnih organizmov, krvni agar pa omogoča rast organizmov, ki jih MacConkey zavira. Ta kombinacija je standardno opisana v kliničnih postopkih za pripravo urinokultur.

Za poučevanje samega koncepta uporabite obe gojišči. EMB pokaže, da je intenzivnost fermentacije pomembna in da lahko ena molekula opravlja dve vlogi. MacConkey pokaže modularno zasnovo: selektor, substrat in indikator so ločeni. Študenti, ki znano E. coli, znano Klebsiella aerogenes in znano Salmonella zasejejo drugo ob drugi na obe gojišči, le redko znova zamenjajo njuno logiko.

Pasti pri odčitavanju, ki se ponavljajo vsak semester

Najpogostejša napaka je identifikacija samo na podlagi barve. Rožnata kolonija na MacConkey agarju je lahko E. coli, Klebsiella, Enterobacter ali drug fermentator. Brezbarvna kolonija je lahko Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas ali drug nefermentator. Barva je presejalni fenotip, ki usmerja nadaljnje potrditveno delo, kot so barvanje po Gramu, test oksidaze, biokemijski paneli ali instrumentalna identifikacija, ne pa ime vrste.

Druga napaka je pretirano sklepanje iz odsotnosti sijaja. Nekatere prave kolonije E. coli, zlasti izolirane, na EMB ustvarijo malo ali nič kovinskega sijaja. Odsotnost sijaja ne izključuje E. coli, njegova prisotnost pa je ne dokazuje. Sijaj obravnavajte kot domnevni namig.

Tretja napaka je primerjanje plošč različnih starosti. Pozni fermentatorji laktoze lahko po daljši inkubaciji na MacConkey agarju postanejo rožnati, kar zabriše jasno ločnico med fermentatorji in nefermentatorji. Odčitajte ob uri, ki jo določa laboratorij, in skupaj z rezultatom zabeležite čas inkubacije.

Četrta napaka je obravnavanje mešane rasti kot enega organizma. Rožnata kolonija poleg brezbarvne predstavlja dva fenotipa, ne vmesnega. Izberite dobro izolirane kolonije in vsak morfotip obdelajte ločeno. Mukoidna tekstura ustvarja podobno past: tako Klebsiella kot Enterobacter sta lahko videti mukoidno, zato sama kapsula nikoli ne določi imena. Organizem, ki so ga nekoč poučevali kot Enterobacter aerogenes, je zdaj razvrščen kot Klebsiella aerogenes, kar pojasnjuje navidezno neskladje med starejšimi preglednicami in novejšimi oznakami.

Kontrole in sklepno pravilo

Pri vsakem postopku uporabite fotografirane ali sveže kontrole: E. coli za reakcijo močnega fermentatorja, Klebsiella aerogenes za mukoidno fermentacijo brez klasičnega sijaja, sev Salmonella za brezbarvno reakcijo nefermentatorja in Staphylococcus aureus za potrditev zaviranja po Gramu pozitivnih organizmov na vašem konkretnem izdelku. Številke sevov in merila sprejemljivosti uskladite z navodili proizvajalca, saj se selektivnost spreminja glede na vsebnost žolča, kristalno vijoličnega in barvil.

Pri delu za laboratorijsko mizo si zapomnite en stavek. EMB uporablja barvila, ki hkrati selekcionirajo in kažejo rezultat, kar omogoča izrazit signal E. coli za ceno bolj subtilnega odčitavanja. MacConkey loči selekcijo od prikaza rezultata, kar omogoča preprosto razvrščanje na rožnate in blede kolonije za ceno manj podrobnosti o fermentaciji. Izberite gojišče, katerega koncept ustreza vprašanju, barvo potrdite z ustreznimi testi in plošči ne bosta več tekmovali, temveč se bosta dopolnjevali.