Absorpcijski spekter metilenskega modrila in molarna absorptivnost: referenčni pregled z navedenimi pogoji

Spekter metilenskega modrila se zdi preprost, dokler ne poskusite ponovno uporabiti katere od njegovih številčnih vrednosti. En laboratorij navaja molarni ekstinkcijski koeficient blizu 82,000. Drugi navaja 67,000. Tretji navaja več kot 100,000. Vse tri vrednosti lahko pravilno opisujejo njihove meritve, vendar nobena ni univerzalna konstanta tega barvila.

Zmeda nastane zaradi mešanja dveh različnih pojmov. Absorbanca je meritev, opravljena na določeni raztopini v določeni kiveti. Molarna absorptivnost, pogosto zapisana kot epsilon, je parameter v modelu te raztopine. Ko se spremeni asociacijsko stanje metilenskega modrila, se spremeni model in s tem tudi parameter. Koristno je vsak koeficient obravnavati kot vrednost z navedenimi pogoji: številko spremljajo valovna dolžina, topilo, pH ali pufer, temperatura, koncentracijsko območje in dolžina optične poti.

Monomerni pas v razredčeni vodni raztopini

V razredčeni vodni raztopini je prevladujoči pas kationa metilenskega modrila blizu 664 do 665 nm; glede na instrument in izbiro kalibracije se običajno navaja območje od 664 do 668 nm. Ta pas je ustrezna izbira za kvantifikacijo, kadar je raztopina dovolj razredčena, da je večina barvila v monomerni obliki.

Tri vrednosti iz literature kažejo, zakaj so pogoji pomembnejši od same številke. Raziskovalci glin, ki so vodne vzorce ohranjali pod približno 7 mikromolar v kivetah dolžine 1 cm, so pri 665 nm poročali o vrednosti epsilon približno 82,000 M-1 cm-1. Ta vrednost je izjemno dobro dokumentirana kot empirični naklon kalibracijske premice za zelo razredčene vodne vzorce. Poznejša primarna kalibracija v deionizirani vodi, pri kateri so uporabili koncentracije od 2.34 do 37.52 mikromolar in optično pot 1 cm, je pri 665 nm za celotno barvilo dala približno 67,100 M-1 cm-1. Nižji rezultat je pričakovan, ne pa protisloven, saj zgornja polovica tega kalibracijskega območja že vsebuje znaten delež dimera. Tretja vrednost, približno 73,460 M-1 cm-1 pri 664 nm, izhaja iz raziskave pri pH 6.86 in 293 K, v kateri so opazovani spekter razstavili na monomerni in dimerni del, kot je povzeto v nedavnem kritičnem pregledu fotofizike metilenskega modrila. Ta številka predstavlja monomerno komponento, dobljeno z dekonvolucijo, ne pa neposrednega naklona odvisnosti absorbance od koncentracije celotnega barvila.

Praktični sklep: izberite koeficient, katerega pogoji ustrezajo vašim vzorcem, ali pa izvedite lastno kalibracijo. Vrednosti 82,000 ne prenesite v analizo v fosfatnem pufru pri koncentraciji 30 mikromolar ob predpostavki, da linearnost še vedno velja.

Rama pri krajši valovni dolžini je mešanica

Z naraščanjem koncentracije se rama blizu 600 do 615 nm povečuje glede na vrh pri 664 nm. Sodobne raziskave prispevek dimera tipa H običajno umeščajo blizu 605 do 610 nm. Globalna spektralna analiza metilenskega modrila v vodi razloči maksimum dimera pri 607 nm in maksimum višjega agregata pri 600 nm, z monomernima resonančnima komponentama pri 664 in 650 nm. Celotno besedilo je na voljo prek zapisa z odprtim dostopom za PMID 33251415.

Te rame ne smemo označiti kot absorbanco čistega dimera. V istem območju prispeva tudi vibronična struktura monomera, zato je izmerjena višina superpozicija prispevkov. Eno globalno prilagajanje je pokazalo, da model z monomerom in dimerom ni ustrezal celotnemu območju od 1.1 mikromolar do 3.4 milimolar, medtem ko je dodatek tetramera dal najboljše prileganje; signal tetramera je bil zaznaven že pod 34 mikromolar. Jakosti prilagojenih komponent so bile velike: približno 107,800 M-1 cm-1 pri 664 nm za glavno monomerno komponento, približno 101,400 za dimer pri 607 nm in približno 138,500 za tetramer pri 600 nm, v nepufrani deionizirani vodi z natrijevim kloridom od 0 do 0.15 M in pri temperaturah od 282 do 333 K. To so komponente, razločene z modelom, zato jih ne smemo uporabiti namesto empiričnega naklona po Beer-Lambertovem zakonu.

Moč dimerizacije je bila neposredno kvantificirana. Pri pH 6.86 in 293 K je ena raziskava določila dimerizacijsko konstanto blizu 3,900 M-1. Ta velikost pojasnjuje, zakaj se delovna raztopina s koncentracijo 5 mikromolar obnaša skoraj linearno, osnovna raztopina s koncentracijo 50 mikromolar pa ne. Pri razvoju metode je koristno preverjati razmerje med absorbanco blizu 610 nm in absorbanco blizu 665 nm. Ko to razmerje narašča s koncentracijo, epsilon pri 664 nm ne opisuje več ene nespremenljive zvrsti.

V koncentracijskem območju, v katerem prevladuje en par medsebojno pretvarjajočih se zvrsti, imajo lahko spektri skupno izosbestično točko, ki je bila v vodnih serijah eksperimentalno opažena blizu 625 nm. Jasna, nepremična točka je skladna s prisotnostjo dveh prevladujočih zvrsti. Ko se točka z naraščanjem koncentracije premakne ali izgine, to obravnavajte kot opozorilo na prisotnost višjih agregatov ali premikajočih se ravnotežij, ne kot napako instrumenta.

Topilo, pH in temperatura premikajo spekter

Voda spodbuja asociacijo. Dodatek dimetil sulfoksida zavira dimerizacijo, premakne absorpcijske in fluorescenčne maksimume proti daljšim valovnim dolžinam ter približno štirikrat poveča kvantni izkoristek fluorescence, kot navaja raziskava vpliva topila na metilensko modrilo v vodi in mešanicah z DMSO, indeksirana kot PMID 30933781. Ta raziskava vodne spektre obravnava kot ravnotežje med monomerom in dimerom, z monomerno absorbanco blizu 650 do 670 nm in dimerno absorbanco blizu 580 do 615 nm, ter iz spektrov pri 293.15 K izpelje dimerizacijske konstante.

Alkoholi spreminjajo tako položaj kot navidezno jakost, vendar agregacije ne odpravijo. V eni primarni primerjavi pri koncentraciji 31.3 mikromolar in sobni temperaturi, objavljeni v raziskavi vpliva topila na metilensko modrilo, je bil maksimum pri daljši valovni dolžini v vodi pri 665 nm, v metanolu pa pri 655 nm; navidezni vrednosti za celotno raztopino sta bili približno 37,100 v vodi in 60,800 v metanolu. Ločena validacija v absolutnem etanolu pri 298 K je dala maksimum pri 655 nm z vrednostjo epsilon blizu 68,000.

Običajne spremembe pH premaknejo spekter manj, kot predvidevajo številni protokoli. Zgoraj navedeni kritični pregled poroča, da je od približno pH 2 do pH 12 maksimum ostal blizu 665 nm, pri čemer so bile do pH 11 spremembe jakosti le majhne. Vrsta pufra in ionska moč lahko vplivata na rezultate prav toliko kot nazivni pH, zato zabeležite dejanski pufer in sol, ne le odčitka pH-metra. Močno kisli ali močno alkalni pogoji so poseben primer, saj se lahko barvilo kemično spremeni, namesto da bi šlo za reverzibilno asociacijo. Tudi temperatura in sol premikata ravnotežje, zato so v raziskavi v vodi iz leta 2020 namerno spreminjali oba dejavnika.

Merjenje, pri katerem vrednost ostane veljavna

Kvantitativno delo temelji na Beer-Lambertovi zvezi, po kateri je absorbanca enaka zmnožku epsilon, koncentracije in dolžine optične poti, ter na dokazu, da linearno območje v vaših pogojih dejansko velja.

Za delo pri nizkih mikromolarnih koncentracijah uporabite kiveto dolžine 1 cm. Pri vrednosti epsilon blizu 82,000 daje koncentracija 5 mikromolar absorbanco blizu 0.41, koncentracija 10 mikromolar pa približno 0.82. Za merjenje, osredotočeno na monomer v vodi brez dodatkov, je varneje ostati pri približno 5 do 7 mikromolar ali pod tem območjem, kot pa kalibracijo razširiti globoko v območje več deset mikromolar. Pri koncentriranih osnovnih raztopinah skrajšajte optično pot, namesto da sprejmete absorbanco, ki je precej nad 1.

Za slepi vzorec uporabite enako matrico: enako kakovost vode, enak delež sotopila, enak pufer in soli, vendar brez barvila. Kalibracijske raztopine pripravite v isti matrici in pri isti temperaturi. Med razvojem posnemite celotno vidno območje, po možnosti približno od 550 do 750 nm, namesto da merite le pri eni valovni dolžini. Spremljajte obliko, ne le višine. Če zaporedno redčenje spremeni normirano obliko, je sistem kemijsko odvisen od koncentracije. Stabilen maksimum in stabilno razmerje absorbanc pri 610 in 665 nm sta močnejši dokaz za sprejemljivo območje kot zgolj visok R na kvadrat.

Dokumentirajte obliko reagenta. Komercialni material je lahko brezvodni metiltioninijev klorid ali hidrat, na primer trihidrat, zato mora molska masa, uporabljena pri izračunih za osnovno raztopino, ustrezati dejanski vsebini steklenice. Že ta korak pojasni del neskladij med nazivnimi molarnimi koncentracijami v različnih laboratorijih. Podobna doslednost je potrebna, kadar se rezultati uporabljajo pri izračunih kvantitativnih analiz, kadar spektri podpirajo preverjanje stabilnosti formulacije in kadar profili nečistoč zahtevajo pregled čistosti in specifikacij.

Povzetek z navedenimi pogoji

To tabelo uporabite kot začetno predlogo za laboratorijski zapis, ne kot vir medsebojno zamenljivih konstant.

Valovna dolžina absorbance metilenskega modrila je torej kratek odgovor z dolgo opombo. Navedite vrh, ki ste ga izmerili, v raztopini, ki ste jo merili, pri koncentraciji, ki ste jo merili. Tako preprečite, da bi se ena vrednost blizu 664 nm za razredčeno vodno raztopino spremenila v napačno univerzalno konstanto.