ලිපිය
මෙතිලීන් බ්ලූ මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවලට ඇති කරන බලපෑම් මැනීම: ඔක්සිජන්, ATP සහ පටල විභවය
විද්‍යාගාරයක් ශ්වසනය දුර්වල වූ මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවලට මෙතිලීන් බ්ලූ එකතු කර, ඔක්සිජන් පරිභෝජනය ඉහළ යන බව නිරීක්ෂණය කරන්නේ යැයි සිතන්න. ලිවීමට ස්වභාවිකව සිතෙන වාක්‍යය නම් සායම මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ක්‍රියාකාරීත්වය යථා තත්ත්වයට පත් කළ බවයි. එම වාක්‍යය වැරදි විය හැකිය. ඔක්සිජන් ප්‍රවාහය, ATP සංස්ලේෂණය සහ පටල විභවය යනු එකිනෙකට වෙනස් සංකල්ප තුනකි. උපස්ථ කිරීම, සමමුහුර්ත කිරීම සහ බෙදාගැනීම එකම වලාකුළු ෆෝල්ඩරයක් භාවිත කරන ආකාරයටම ඒවා එකම ඉන්ද්‍රයිකාව බෙදාගනියි: එකිනෙකට සම්බන්ධ වුවත්, වෙනස් නීතිවලට යටත් වේ. එකක් අනෙක ලෙස වරදවා වටහාගතහොත්, සෑම මිනුමක්ම තාක්ෂණිකව නිවැරදි වුවද අර්ථකථනය අසාර්ථක වේ.
මෙතිලීන් බ්ලූ මෙම ව්‍යාකූලතාව ඇති වීමට ඉඩ වැඩි කරන්නේ එය මනින පද්ධතියටම සහභාගි වන නිසාය. එය මාර්ගයේ පෙර අවස්ථාවක ඉලෙක්ට්‍රෝන භාරගෙන පසු අවස්ථාවක ඒවා ලබාදෙන ඔක්සිකරණ-ඔක්සිහරණ චක්‍රීයකි; ශක්තිමත් තත්ත්වයේ පවතින මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවල රැස්වන මේදයට නැඹුරු කැටායනයකි; එමෙන්ම සාමාන්‍ය සංවේදක භාවිත කරන ආලෝක කලාපවලම ආලෝකය අවශෝෂණය කර විමෝචනය කරන තද නිල් සංයෝගයකි. එක් මිනුම් ප්‍රතිඵලයකින් පමණක් මේ සියල්ල හසුරුවාගත නොහැකිය. බුඩාපෙස්ට් මයිටොකොන්ඩ්‍රියා අධ්‍යයන පුරා පෙන්වා ඇති විශ්වාසදායක රටාව වන්නේ ඔක්සිජන් ප්‍රවාහය, ATP සංස්ලේෂණ වේගය, පටල විභවය සහ හයිඩ්‍රජන් පෙරොක්සයිඩ් මුදාහැරීම එකට මැනීමත්, සෑම පියවරකදීම සායමට විශේෂිත පාලක පරීක්ෂණ යෙදීමත් ය.
ශ්වසනමිතිය මනින්නේ ඔක්සිජන් ප්‍රවාහය මිස ශක්ති නිමැවුම නොවේ
Oroboros Oxygraph හෝ Seahorse බාහිර සෛලීය ප්‍රවාහ විශ්ලේෂකය භාවිත කරන අධි-විභේදන ශ්වසනමිතිය වාර්තා කරන්නේ එක් දෙයක් පමණි: ඔක්සිජන් කොපමණ වේගයෙන් ඔක්සිහරණය වන්නේද යන්නයි. එක් ඉලෙක්ට්‍රෝනයකට ප්‍රෝටෝන කීයක් පොම්ප කළේද, අනුක්‍රමණයේ කොපමණ ප්‍රමාණයක් රැකගත්තේද, නැතහොත් ATP සින්තේස් එය භාවිත කළේද යන්න එය වාර්තා නොකරයි.
භාවිත කරන පද වැදගත්ය. හුදකලා කළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවල, ADP නොමැති උපස්තරය කාන්දුවට සම්බන්ධ ශ්වසනය ලබාදෙයි; සංතෘප්ත ADP සහිත උපස්තරය ඔක්සිකාරක පොස්පොරයිලීකරණ ධාරිතාව ලබාදෙයි; විසංයෝජකයක් අනුක්‍රමයෙන් එකතු කිරීම උපරිම ඉලෙක්ට්‍රෝන හුවමාරු ධාරිතාව ලබාදෙයි. අඛණ්ඩ සෛලවල Seahorse මගින් මනින අනුරූප අගයන් වන්නේ මූලික ශ්වසනය, ඔලිගොමයිසින්වලට සංවේදී ATP-සම්බන්ධ ශ්වසනය, ප්‍රෝටෝන කාන්දුව, FCCP මගින් නිර්ණය කරන උපරිම ශ්වසනය සහ රොටෙනෝන් හා ඇන්ටිමයිසින්වලට ප්‍රතිරෝධී, මයිටොකොන්ඩ්‍රියා නොවන ඔක්සිජන් පරිභෝජනයයි. Agilent Mito Stress Test රාමුව පැහැදිලි කරන පරිදි, Seahorse ප්‍රතිඵල State 3 සහ State 4 ලෙස හැඳින්වීම, එම නියැදි සැකසුමෙන් තහවුරු කළ නොහැකි නිරවද්‍යතාවක් ඒවාට ආරෝපණය කිරීමකි.
වැඩි ඔක්සිජන් යනු වැඩි ශක්තිය යන සහජ සම්බන්ධය මෙතිලීන් බ්ලූ බිඳ දමයි. හුදකලා කළ මොළයේ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා අධ්‍යයනයට අනුව, හුදකලා කළ ගිනියා ඌරු මොළයේ මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවල 100 nM සිට 1 uM දක්වා සායම, ග්ලූටමේට් හා මැලේට්, සක්සිනේට් සහ ඇල්ෆා-ග්ලිසරොපොස්පේට් උපස්තර සමඟ විවේක තත්ත්වයේ ඔක්සිජන් පරිභෝජනය ඉහළ නැංවීය. ඇල්ෆා-ග්ලිසරොපොස්පේට් සමඟ එම වැඩිවීම දළ වශයෙන් සියයට 64ක් විය. එහෙත් සෞඛ්‍ය සම්පන්න මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවල ADP මගින් උත්තේජනය කළ ශ්වසනයේ සැලකිය යුතු වෙනසක් නොවීය. කාන්දුව වැඩි වූ අතර ADP මගින් උත්තේජනය කළ ප්‍රවාහය නොවෙනස්ව පැවති නිසා, ගණනය කරන ශ්වසන පාලන අනුපාතය පහළ යයි. එම පහළ යාමෙන් සායම මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවලට හානි කළ බව අදහස් නොවේ. එයින් අදහස් වන්නේ සායම සාමාන්‍ය ශ්වසනයට අමතරව ඔක්සිජන් පරිභෝජනය කරන ඔක්සිකරණ-ඔක්සිහරණ චක්‍රයක් එකතු කළ බවයි. වැඩිවීම පමණක් වාර්තා කරන මෙතිලීන් බ්ලූ ඔක්සිජන් පරිභෝජන පරීක්ෂණයක් සැබෑ රසායනික ක්‍රියාවලියක් මැන ඇති නමුත් ශක්ති සංරක්ෂණය ගැන කිසිවක් පවසා නැත.
යථා තත්ත්වයට පත්කිරීමේ පරීක්ෂණවලින්ද එම පරතරය වඩා විශාල පරිමාණයකින් පෙන්වයි. සංකීර්ණ I අවහිර කළ විට ඔක්සිජන් ප්‍රවාහය දළ වශයෙන් තුන් ගුණයකින් යථා තත්ත්වයට පැමිණි අතර ATP සංස්ලේෂණය යථා තත්ත්වයට පැමිණියේ දළ වශයෙන් 1.5 ගුණයකින් පමණි. වැඩි ඔක්සිජන් ප්‍රමාණයක් ඉලෙක්ට්‍රෝඩය වෙත ළඟා විය. එයින් අඩු කොටසක් ATP සෑදීමට දායක විය. ඔක්සිකාරක පොස්පොරයිලීකරණය වැඩිදියුණු වූ බවට කරන ඕනෑම ප්‍රකාශයකට ATP පිළිබඳ දත්තද අවශ්‍යය. වඩාත් සුදුසු වන්නේ හරය සඳහා භාවිත කළ සම්මුතිය සඳහන් කරමින්, ඔක්සිජන් ඒකකයකට ATP අනුපාතයක් ලෙස එය දැක්වීමයි.
ATP පරීක්ෂණ මනින්නේ සංස්ලේෂණ වේගයයි; ATP ප්‍රමාණය එයට ආදේශ කළ නොහැකිය
ATP පරීක්ෂණයක් වෙනත් ප්‍රශ්නයකට පිළිතුරු දෙයි: ඒකක කාලයකට කොපමණ ATP නිපදවන්නේද යන්නයි. මිනිත්තු ගණනක් පුරා නිරීක්ෂණය කරන කණාමැදිරි ලුසිෆරේස් දීප්තිය හෝ 340 nm දී කියවන, හෙක්සොකයිනේස් හා ග්ලූකෝස්-6-පොස්පේට් ඩීහයිඩ්‍රොජිනේස් යුගලනය කළ පරීක්ෂණයක් වැනි කාලය අනුව වෙනස්වීමේ මිනුමකින් වේගයක් ලැබේ. එක් අවසාන ලක්ෂ්‍යයකදී කරන සමස්ත ATP මිනුමකින් ලැබෙන්නේ පවතින ප්‍රමාණයයි. එය සංස්ලේෂණයෙන් පරිභෝජනය අඩු කළ ප්‍රතිඵලය පිළිබිඹු කරන අතර, තනිව ගත් විට ඔක්සිකාරක පොස්පොරයිලීකරණය ගැන ලබාදෙන්නේ ඉතා සුළු තොරතුරකි.
බුඩාපෙස්ට් කණ්ඩායම ඇඩිනිලේට් කයිනේස් මර්දනය කරමින් යුගලනය කළ එන්සයිම ක්‍රමය භාවිත කළ අතර, 1 සිට 2 uM දක්වා මෙතිලීන් බ්ලූ රොටෙනෝන් යෙදූ සහ ඇන්ටිමයිසින් යෙදූ මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවල ATP නිෂ්පාදනය මඳ වශයෙන් නමුත් සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි කළ බව සොයාගත්තේය. එය සැබෑ යථා තත්ත්වයට පත්වීමකි; එහෙත් අර්ධ යථා තත්ත්වයට පත්වීමකි. TEGDMA විෂකාරීත්ව අධ්‍යයනය වෙනත් ආකෘතියකදීද එවැනිම පිළිතුරකට පැමිණියේය: 5 mM දන්ත මොනෝමරයක් වන TEGDMA, සංකීර්ණ I සමඟ සම්බන්ධ ශ්වසනය දළ වශයෙන් ප්‍රවාහ ඒකක 286 සිට 28 දක්වා පහත හෙළූ අතර, 2 uM සායම එය දළ වශයෙන් 86 දක්වා යථා තත්ත්වයට පත් කළේය.
වර්ණවත් ඔක්සිකරණ-ඔක්සිහරණ සංයෝගයක් සමඟ පාලක පරීක්ෂණ දෙකක් අනිවාර්යය. පළමුව, මනින ATP සංස්ලේෂණයෙන් කොපමණ ප්‍රමාණයක් ATP සින්තේස් මත රඳා පවතීද යන්න තහවුරු කිරීමට ඔලිගොමයිසින් යොදන්න. දෙවනුව, දන්නා ATP ප්‍රමාණයක්, සම්පූර්ණ ප්‍රතික්‍රියාකාරක කට්ටලය සහ භාවිත කළ සායම් සාන්ද්‍රණ එලෙසම යොදා, සෛල රහිත එකතු-කර-නැවත-මැනීමේ පරීක්ෂණයක් සිදු කරන්න. අවම වශයෙන් 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM සහ 2 uM ඇතුළත් කරන්න. සායමට විමෝචනය වන ආලෝකය අවශෝෂණය කිරීම, සංඥා වාර්තාක එන්සයිමය නිෂේධනය කිරීම හෝ ප්‍රතික්‍රියාකාරකවල ඔක්සිකරණ-ඔක්සිහරණ රසායනය වෙනස් කිරීම කළ හැකිය. සාමාන්‍ය ලුසිෆරේස් පරීක්ෂණ මාර්ගෝපදේශ නිර්දේශ කරන්නේ හරියටම මෙම වර්ගයේ මැදිහත්වීම් හඳුනාගැනීමට ජෛව රසායනික ප්‍රතිපරීක්ෂණ යෙදීමයි. ප්‍රතිදීප්ති නිවීම සාමාන්‍යයෙන් වැඩි සාන්ද්‍රණවලදී තදබල වන නිසා 1 uM හි කෘත්‍රිම මිනුම් බලපෑම් නැතැයි නොසිතන්න.
පටල විභව සංවේදක මනින්නේ සායම් ව්‍යාප්තිය මිස ප්‍රවාහය නොවේ
Safranine O, TMRM සහ TMRE, rhodamine 123 සහ JC-1 යන සියල්ල පටල හරහා ගමන් කළ හැකි කැටායන වේ. ඒවා විද්‍යුත් රසායනික සමතුලිතතාව අනුව ඍණ ආරෝපිත මැට්‍රික්සයේ රැස්වේ. එබැවින් සමස්ත ප්‍රතිදීප්තිය, සංවේදකය පිහිටා ඇති ස්ථානය හරහා විභවය වක්‍රව වාර්තා කරයි. ඒ කිසිවක් ATP හෝ ඉලෙක්ට්‍රෝන ප්‍රවාහය මනින්නේ නැත.
සෑම සංවේදකයකටම වඩාත් ගැළපෙන නියැදි සැකසුමක් තිබේ. Safranine O හුදකලා කළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා සහ පාරගම්‍ය කළ සෛල සඳහා සුදුසුය. එය සාමාන්‍යයෙන් 2 uM ආසන්න සාන්ද්‍රණයකින්, 495 nm ආසන්න උත්තේජනයකින් සහ 585 nm ආසන්න විමෝචනයකින් භාවිත වේ. එය ක්‍රියා කරන්නේ අවශෝෂණය වීමෙන් සමස්ත ප්‍රතිදීප්තිය වෙනස් වන ප්‍රතිදීප්ති නිවීමේ තත්ත්වයකය. TMRM සහ TMRE අඛණ්ඩ සෛලවලට සුදුසු වන්නේ අඩු නැනෝමෝලීය සාන්ද්‍රණයකින්, ප්‍රතිදීප්ති නිවීම නොවන ආකාරයකින් යෙදූ විටය. එහිදී ධ්‍රැවහරණය සායම මුදාහරින අතර මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ප්‍රතිදීප්තිය පහළ යයි; වැඩි සාන්ද්‍රණයකින් යෙදූ විට ස්වයං-ප්‍රතිදීප්ති නිවීම හරහා සංඥාවේ දිශාව ප්‍රතිවිරුද්ධ විය හැකිය. JC-1 පහසු කොළ-රතු අනුපාතයක් ලබාදෙන නමුත් එය යෙදූ ප්‍රමාණය සහ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ස්කන්ධය මත රඳා පවතී. එබැවින් ප්‍රමාණාත්මක වැඩ සඳහා එය ප්‍රවේශමෙන් පාලනය කළ TMRM ට වඩා දුර්වලය. මෙම වාසි සහ සීමා බහුලව භාවිත වන මයිටොකොන්ඩ්‍රියා පටල විභව සංවේදක පිළිබඳ සමාලෝචනයක සාරාංශ කර ඇත.
මෙතිලීන් බ්ලූ මිනුම් සඳහා භාවිත කරන සාන්ද්‍රණවලදීම ප්‍රකාශීය බාධා ඇති කරයි. 600 සිට 665 nm ආසන්නයේ එහි අවශෝෂණ කලාප රතු සංවේදක විමෝචනය සමඟ අතිච්ඡාදනය වේ. එබැවින් අභ්‍යන්තර පෙරහන් බලපෑම්, ප්‍රතිදීප්ති නිවීම සහ උත්තේජන ආලෝකය අවශෝෂණය කිරීම යන සියල්ල සිදුවිය හැකිය. සායමද මේදයට නැඹුරු දෙවන කැටායනයක් වන අතර, මනින විභවය අනුව එහිම ව්‍යාප්තිය වෙනස් වේ. මෙයට ආරක්ෂාව වන්නේ අතිරේක ස්වාධීන මිනුම් සහ හිස් පාලක පරීක්ෂණයි: සංවේදකය පමණක්, සායම පමණක්, සංවේදකය සමඟ එක් එක් සායම් සාන්ද්‍රණය, ශූන්‍ය යොමුව ලෙස FCCP සමඟ සම්පූර්ණ ධ්‍රැවහරණය සහ, හැකි නම්, ප්‍රකාශීය වශයෙන් වෙනස් දෙවන සංවේදකයක්. සංකීර්ණ III මඟහැරීමේ අධ්‍යයනය මෙම පූර්වාදර්ශය ස්ථාපිත කළේ ඇන්ටිමයිසින් සහ මයික්සොතියාසෝල් මගින් නිෂේධනය කිරීමෙන් පසු safranine O සහ TMRM දෙකම භාවිත කර පටල විභවය යථා තත්ත්වයට පත්වීම නැවත පරීක්ෂා කර, එකම ගුණාත්මක යථා තත්ත්වයට පත්වීම ලබාගැනීමෙනි. එක් ප්‍රකාශීය වාර්තාකයක් ඉඟියකි. ස්වාධීන වාර්තාක දෙකක් සාක්ෂියකි.
නියැදි සැකසුම් තුනක්, වෙනස් ප්‍රශ්න තුනක්
හුදකලා කළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා, පාරගම්‍ය කළ සෛල සහ අඛණ්ඩ සෛල යනු එක් පරීක්ෂණයක හුවමාරු කළ හැකි සංවේදීතා සැකසුම් නොවේ. ඒවා වෙනස් ක්‍රියාකාරී මූලධර්ම සහිත වෙනස් සංකල්ප වේ.
හුදකලා කළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ඉලෙක්ට්‍රෝන ප්‍රවාහන දාමය, අභ්‍යන්තර පටලය සහ මැට්‍රික්සයේ ක්‍රියාකාරී පද්ධතිය රඳවාගන්නා අතර ප්ලාස්මා පටලය, සයිටොසෝලය සහ ජාල ව්‍යුහය ඉවත් කරයි. එම ඉවත් කිරීමම මෙහි අරමුණයි: උපස්තර, ADP, නිෂේධක සහ සායම් සාන්ද්‍රණ නිශ්චිතව නිර්ණය කරන නිසා ක්‍රියාමාර්ගයක් හඳුනාගත හැකිය. එහි අවාසිය වන්නේ ස්වභාවික උපස්තර සැපයුම, සංඥාකරණය සහ ඉල්ලුම අහිමි වීමයි.
පාරගම්‍ය කළ සෛල, විවෘත කළ ප්ලාස්මා පටලය හරහා බාහිරින් ලබාදෙන උපස්තර සහ ADP ඇතුළට යාමට ඉඩ දෙන අතරම, මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ඒවායේ සෛලීය ව්‍යුහයේ බොහෝ කොටස් තුළ රඳවාගනියි. සෛලීය සන්දර්භයක් තුළ උපස්තර-ක්‍රියාමාර්ග දෝෂයක් හඳුනාගැනීමට සුදුසු මෙවලම ඒවාය. අධික ලෙස පාරගම්‍ය කිරීම බාහිර පටලයට හානි කරන අතර සයිටොසෝලීය නියාමනය සේදී ඉවත් වේ.
අඛණ්ඩ සෛල සියල්ල රඳවාගනියි: ප්ලාස්මා පටල බාධකය, සයිටොසෝලීය ඔක්සිහාරක, අභ්‍යන්තරජ උපස්තර ප්‍රවාහනය, මයිටොකොන්ඩ්‍රියා ජාලය සහ ATP ඉල්ලුම. ඒවා කායික ක්‍රියාකාරීත්වයට වඩාත් සමීප වන අතර යාන්ත්‍රණය හඳුනාගැනීමෙන් වඩාත් දුරස් වේ. මන්ද සායම අවශෝෂණය වීම, ඔක්සිහරණය වීම සහ වෙන්කර රඳවාගැනීම යන සියල්ල මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවලට සැබවින්ම නිරාවරණය වන සායම් ප්‍රමාණය හැඩගස්වන බැවිනි.
TEGDMA අධ්‍යයනය මෙම මට්ටම් තුනම හිතාමතා භාවිත කළේය: සායම මගින් ඔක්සිකරණය සහ විභවය යථා තත්ත්වයට පත්කිරීම සඳහා හුදකලා කළ මොළයේ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා; දෝෂය ප්‍රධාන වශයෙන් සංකීර්ණ I සමඟ සම්බන්ධ උපස්තර ඔක්සිකරණයට අදාළ බව හඳුනාගැනීම සඳහා පාරගම්‍ය කළ දන්ත පල්ප ප්‍රාථමික සෛල; සහ අඩාල කළ ඔක්සිජන් පරිභෝජනය මත 2 uM සායමේ සමස්ත කායික බලපෑම සඳහා අඛණ්ඩ ප්‍රාථමික සෛල. විවිධ නියැදි සැකසුම් අතර මයිටොකොන්ඩ්‍රියා මිනුම් ප්‍රතිඵල සසඳන පාඨකයන්ට, මෙතිලීන් බ්ලූ ශ්වසන දාමය හරහා ඉලෙක්ට්‍රෝන ගෙනයන ආකාරය පිළිබඳ සහායක විස්තර ලිපිය ක්‍රියාමාර්ගයේ පසුබිම ලබාදෙන අතර, මෙතිලීන් බ්ලූ ශ්වසන අධ්‍යයන කියවීමේ මාර්ගෝපදේශය යෙදූ ප්‍රමාණය සහ නිෂේධක භාවිතයේ තර්කනය ආවරණය කරයි.
ඔක්සිකරණ-ඔක්සිහරණ ක්‍රියාකාරී සායමකට අවශ්‍ය පාලක පරීක්ෂණ
ඔක්සිකරණ-ඔක්සිහරණ චක්‍රීයකට සාමාන්‍ය නිෂේධකයකට වඩා දිගු පාලක පරීක්ෂණ ලැයිස්තුවක් අවශ්‍යය. මන්ද සායම පමණක් ඇති විට සිදුවන රසායනික ක්‍රියා ජෛව ක්‍රියා ලෙස පෙනිය හැකි බැවිනි.
ශ්වසනමිතිය සඳහා, මිනුම් අපගමනය පරීක්ෂා කිරීමට බෆරය පමණක් සහිත කුටියක්, ජෛව ද්‍රව්‍ය නොමැතිව බෆරය හා සායම සහිත කුටියක්, සායම සමඟ පරීක්ෂණයේ පවතින ඕනෑම බාහිර සෛලීය ඔක්සිහාරකයක් සහ, අඛණ්ඩ සෛලවල මයිටොකොන්ඩ්‍රියා නොවන ඔක්සිජන් පරිභෝජනය නිර්ණය කිරීමට අවසානයේ රොටෙනෝන් හා ඇන්ටිමයිසින් යොදන්න. ඔක්සිහරණය වූ සායම ඔක්සිජන් වෙත ඉලෙක්ට්‍රෝන මාරු කර හයිඩ්‍රජන් පෙරොක්සයිඩ් සෑදීමෙන් නැවත ඔක්සිකරණය වන බව සලකන්න. එබැවින් ඉලෙක්ට්‍රෝන දායකයක් නොමැති, සායම පමණක් සහිත හිස් පාලකයක්, NADH හෝ NADPH තිබෙන විට ඇතිවන සෛල රහිත ඔක්සිජන් පරිභෝජනය අවතක්සේරු කරයි.
හයිඩ්‍රජන් පෙරොක්සයිඩ් සඳහා, තෝරාගැනීමක් නොකරන DCFDA සායම්වලට වඩා ක්‍රමාංකනය කළ Amplex UltraRed සහ horseradish peroxidase භාවිත කිරීමට ප්‍රමුඛත්වය දෙන්න; කැටලේස් සමඟ තහවුරු කරන්න; සායම ප්‍රකාශ සංවේදීකාරකයක් බැවින් ආලෝකය මත රඳාපවතින බව පරීක්ෂා කරන්න. මොළයේ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා අධ්‍යයනයෙන් සොයාගත්තේ 100 nM සායමකදී පමණක් වුවද පෙරොක්සයිඩ් බර සිව් ගුණයකට වඩා වැඩි වූ අතර එය ඉවත් කිරීම මන්දගාමී වූ බවයි. පෙරොක්සයිඩ් සුපර්ඔක්සයිඩ් අතරමැදියක් නොමැතිව ඔක්සිහරණය වූ සායමෙන් සෘජුවම සෑදී තිබුණි. සංවේදක තේරීම සහ ආලෝක පාලක පරීක්ෂණ පිළිබඳ විස්තර සායම් පරීක්ෂණවල ප්‍රතික්‍රියාශීලී ඔක්සිජන් විශේෂ මැනීම පිළිබඳ සහායක ලිපියේ ඇතුළත් වන අතර, පෙරොක්සයිඩ් සංඥාවක් ලෙස ක්‍රියා කරන්නේ කවදාද, බරක් බවට පත්වන්නේ කවදාද යන පුළුල් ප්‍රශ්නය සෛලීය ඔක්සිකරණ-ඔක්සිහරණ සමතුලිතතාව සහ ප්‍රතිඔක්සිකාරක ප්‍රකාශ සමඟ ආවරණය කර ඇත.
ක්‍රියාමාර්ග පිළිබඳ ප්‍රකාශ සඳහා, සංකීර්ණ III නිෂේධක ස්ථාන දෙකම පරීක්ෂා කරන්න: Qi ස්ථානයේ ඇන්ටිමයිසින් A සහ Qo ස්ථානයේ මයික්සොතියාසෝල්; එයට අමතරව සයනයිඩ් සමඟ සංකීර්ණ IV අවසාන ලක්ෂ්‍යයක්ද යොදන්න. පෙර සිදු කළ මී මොළයේ අධ්‍යයනයක් රොටෙනෝන් මගින් අවහිර කළ ශ්වසනය සායමෙන් යථා තත්ත්වයට පත් වූ නමුත් ඇන්ටිමයිසින් මගින් අවහිර කළ ශ්වසනය එසේ නොවූ බව වාර්තා කළේය. පසුව සිදු කළ සත්ත්ව විශේෂ තුනක අධ්‍යයනයෙන් නිෂේධක දෙකම සමඟ අර්ධ යථා තත්ත්වයට පත්වීමක් සහ සයිටොක්‍රෝම් c සෘජුව ඔක්සිහරණය වීමේ සාක්ෂි සොයාගන්නා ලදී. සායම් සාන්ද්‍රණය, නිෂේධක ස්ථානය, උපස්තර තත්ත්වය සහ සායම් ව්‍යාප්තිය යන සියල්ල නිරීක්ෂණය කරන මාර්ගය වෙනස් කරන බැවින්, මෙම මඟහැරීම නිශ්චිතව තහවුරු වූවක් ලෙස නොව නව දත්ත සමඟ ගැළපෙන දෙයක් ලෙස සලකන්න.
පරීක්ෂණ තේරීමේ වගුව
මිනුමෙන් ප්‍රශ්නය තෝරාගැනීම වෙනුවට, ප්‍රශ්නයට අනුව මිනුම තෝරාගැනීමට මෙම වගුව භාවිත කරන්න.
| ජෛව විද්‍යාත්මක ප්‍රශ්නය | හොඳම පරීක්ෂණය | නියැදි සැකසුම | ප්‍රධාන පාලක පරීක්ෂණය | පොදු ව්‍යාකූලකාරී සාධකය |
|---|---|---|---|---|
| සායම ඉලෙක්ට්‍රෝන ප්‍රවාහය යථා තත්ත්වයට පත් කරයිද? | නිර්ණය කළ උපස්තර සහ නිෂේධක ක්‍රමවේදයක් සමඟ Oroboros හෝ Seahorse ඔක්සිජන් පරිභෝජන මිනුම | ක්‍රියාමාර්ග සිතියම්ගත කිරීමට හුදකලා කළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා; සමස්ත බලපෑම සඳහා අඛණ්ඩ සෛල | සායම පමණක් සහිත ඔක්සිජන් හිස් පාලකය; අවසානයේ රොටෙනෝන් හා ඇන්ටිමයිසින් | ඔක්සිකරණ-ඔක්සිහරණ චක්‍රීකරණය ATP නොසාදා ඔක්සිජන් පරිභෝජනය කරයි |
| සායම ATP සංස්ලේෂණය යථා තත්ත්වයට පත් කරයිද? | කාලය අනුව ATP සංස්ලේෂණ වේගය, ලුසිෆරේස් හෝ යුගලනය කළ එන්සයිම පරීක්ෂණය | හුදකලා කළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා හෝ පාලිත පාරගම්‍ය කළ සෛල | ඔලිගොමයිසින්; දන්නා ATP ප්‍රමාණයක් හා සායම සමඟ එකතු-කර-නැවත-මැනීමේ පරීක්ෂණය | වාර්තාක නිෂේධනය සහ ප්‍රකාශීය දුර්වල වීම; පවතින ප්‍රමාණය වේගය ලෙස වරදවා වටහාගැනීම |
| යථා තත්ත්වයට පත්වීම ශක්තිමය වශයෙන් කාර්යක්ෂමද? | සමාන්තර ඔක්සිජන් ප්‍රවාහය හා ATP වේගය; ඔක්සිජන් ඒකකයකට ATP වාර්තා කරන්න | හුදකලා කළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා හෝ පාරගම්‍ය කළ සෛල | මිනුම් දෙකෙහිම එකම උපස්තර සහ ADP | සායමෙන් ඔක්සිජන් වෙතත් එතැනින් පෙරොක්සයිඩ් වෙතත් යන ප්‍රවාහය හරය වැඩි කරයි |
| සායම පටල විභවය යථා තත්ත්වයට පත් කරයිද? | හුදකලා කළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවල Safranine O; සෛලවල අඩු ප්‍රමාණයකින් යෙදූ TMRM; හැකි විට දෙවන සංවේදකයක් | නියැදි සැකසුමට සංවේදකය ගළපන්න | FCCP මගින් සම්පූර්ණ ධ්‍රැවහරණය; සායම පමණක් සහිත වර්ණාවලි ස්කෑනය | 600 සිට 665 nm ආසන්නයේ අවශෝෂණය සහ ප්‍රතිදීප්ති නිවීම; වෙනස් වන සායම් ව්‍යාප්තිය |
| දෝෂය සංකීර්ණ I හිද? | ග්ලූටමේට් හා මැලේට් හෝ පයිරුවේට් හා මැලේට්, සක්සිනේට් සමඟ සසඳන ශ්වසනමිතිය | හුදකලා කළ හෝ පාරගම්‍ය කළ නියැදි | රොටෙනෝන් යොමුව; සක්සිනේට් සැසඳීම | සායම විකල්ප මාර්ගයක් සපයන බැවින්, සංකීර්ණ I මඟහැර තිබුණත් එහි ක්‍රියාකාරීත්වය යථා තත්ත්වයට පත් වී ඇතැයි මිනුමෙන් පෙනිය හැකිය |
| දෝෂය සංකීර්ණ III හිද? | ඇන්ටිමයිසින් A සහ මයික්සොතියාසෝල් වෙන වෙනම යොදා කරන ශ්වසනමිතිය, සමාන්තරව විභවයද මැනීම | හුදකලා කළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියා | Qi සහ Qo ස්ථාන නිෂේධක දෙකම; සංකීර්ණ IV අවසාන ලක්ෂ්‍යය | සායමේ ඔක්සිකරණ-ඔක්සිහරණ තත්ත්වය සහ මැදිරි අතර ව්‍යාප්තිය මාර්ගය තීරණය කරයි |
| සායම පෙරොක්සයිඩ් බර වැඩි කරයිද? | ක්‍රමාංකනය කළ Amplex UltraRed හා පෙරොක්සිඩේස්; සෛලවල ස්වාධීන වෙනස් ක්‍රමයක සංවේදකයක් | අසන ප්‍රශ්නයට ගළපන්න | කැටලේස්; පෙරොක්සිඩේස් රහිත පාලකය; අඳුර හා ආලෝකය සසඳන පාලකය | සායමම ඔක්සිකරණ-ඔක්සිහරණ චක්‍රීකරණයට ලක් වන අතර පෙරොක්සයිඩ් සෑදීම ප්‍රකාශ සංවේදීකරණය කරයි |
ඒත්තු ගැන්වෙන ප්‍රකාශයක් සඳහා අවම අවශ්‍යතාව වන්නේ 100 nM, 300 nM, 1 uM සහ 2 uM යන එකම සායම් සාන්ද්‍රණ භාවිත කර, කාන්දුව, ADP, ඔලිගොමයිසින් සහ විසංයෝජක තත්ත්ව යටතේ ඔක්සිජන් ප්‍රවාහය; ATP සංස්ලේෂණ වේගය; වඩාත් සුදුසු ලෙස සංවේදක දෙකක් සමඟ පටල විභවය; සහ කැටලේස් හා සෛල රහිත පාලක සහිත ක්‍රමාංකනය කළ පෙරොක්සයිඩ් මුදාහැරීම මැනීමයි. සම්බන්ධිත කට්ටලය වාර්තා කරන්න: ඔක්සිජන් ප්‍රවාහය, ATP වේගය, ඔක්සිජන් ඒකකයකට ATP, විභවය සහ පෙරොක්සයිඩ්. එම අගයන්ගෙන් ඕනෑම එකක් තනිව ගත් විට එය අර්ථයක් සොයන මිනුමක් පමණි.