آرٽيڪل
نيو ميٿيلين بلو ۽ ريٽيڪيولوسائيٽ رنگڻ: هڪ الڳ رنگ ۽ زنده خلين وارو طريقو
هڪ شاگرد ريٽيڪيولوسائيٽن جي ڳڻپ جي تياري ڪري ٿو، ميٿيلين بلو گهرائي ٿو، ان کي رت سان ملائي ٿو، ۽ لڳ ڀڳ ڪجهه به نٿو ڏسي. سندس هڪ هم جماعت نيو ميٿيلين بلو جو ليبل لڳل بوتل استعمال ڪري ٿو ۽ ڪجهه ڳاڙهن خلين اندر چٽا نيرا ڌاڳا ڏسي ٿو. پهريون شاگرد سمجهي ٿو ته ٻي بوتل وڌيڪ تازي يا وڌيڪ ڳاڙهي آهي. انهن مان ڪا به ڳالهه ناهي. ان ۾ هڪ مختلف ماليڪيول آهي.
هن شعبي ۾ گهڻي ڀاڱي مونجهاري جي پٺيان اها ئي تصوراتي غلطي آهي. نالي مان لڳي ٿو ته نيو ميٿيلين بلو، ميٿيلين بلو جي ڪا بهتر ڪيل کيپ آهي. ڪيميائي جوڙجڪ ڪجهه ٻيو ٻڌائي ٿي. نيو ميٿيلين بلو N هڪ الڳ فينوٿائيازِين رنگ آهي، جنهن جو پنهنجو Colour Index نمبر، پنهنجو متبادل گروپن جو نمونو، ۽ رت جي علم ۾ پنهنجو معياري ڪردار آهي. جڏهن اهو فرق واضح ٿي وڃي ٿو، ته باقي طريقو به سولو ٿي پوي ٿو: رنگڻ وقت خليا زنده ڇو هجڻ گهرجن، ڪهڙي خليي کي ريٽيڪيولوسائيٽ ڳڻجي، هائنز جسمن جي جاءِ ڪٿي آهي، ۽ برليئنٽ ڪريسل بلو ڪڏهن استعمال ٿئي ٿو.
مختصر جواب
نيو ميٿيلين بلو N، رت جي علم ۾ استعمال ٿيندڙ ريجنٽ، عام طور تي نيو ميٿيلين بلو جي PubChem رڪارڊ ۾ Basic Blue 24، C.I. 52030، CAS 1934-16-3، فارمولا C18H22ClN3S طور سڃاتو وڃي ٿو. عام ميٿيلين بلو پنهنجي PubChem رڪارڊ ۾ ميٿائلٿائونينيم ڪلورائيڊ، Basic Blue 9، C.I. 52015، CAS 61-73-4، فارمولا C16H18ClN3S آهي. جوڙجڪ جي لحاظ کان، نيو ميٿيلين بلو ۾ رنگ تي ٻه ميٿائل گروپ ۽ ايٿائل امينو پاسيريون زنجيرون آهن، جڏهن ته ميٿيلين بلو ۾ ڊاءِ ميٿائل امينو گروپ آهن. اهو فرق رنگڻ جي رويي کي بدلائي ٿو. رت جي علم جا ڪتاب عام ميٿيلين بلو کي ريٽيڪيولوسائيٽ رنگڻ لاءِ نسبتاً ڪمزور رنگ، ۽ نيو ميٿيلين بلو کي وڌيڪ گهرو ۽ هڪجهڙو رنگ ڏيندڙ بيان ڪن ٿا؛ هن ڀيٽ جو خلاصو ScienceDirect جي نيو ميٿيلين بلو بابت موضوع ۾ ڏنل آهي.
ها، نيو ميٿيلين بلو هڪ سوپراوائيٽل رنگ آهي. سوپراوائيٽل رنگڻ جو مطلب جسم مان ڪڍڻ کان پوءِ ۽ فڪسيشن کان اڳ زنده خلين کي رنگڻ آهي، جيئن NCBI جي سوپراوائيٽل رنگڻ جي اصولن واري جائزي ۾ بيان ڪيل آهي. نيو ميٿيلين بلو ۽ برليئنٽ ڪريسل بلو ٻئي هن زمري ۾ اچن ٿا، ۽ CLSI جو ريٽيڪيولوسائيٽ معيار نيو ميٿيلين بلو کي واضح طور سوپراوائيٽل رنگ طور شامل ڪري ٿو. شاگرد ڪڏهن ڪڏهن هن کي فڪس ڪيل فلمن جي Romanowsky رنگڻ سان گڏ سمجهن ٿا. هتي اهو ذهني تصور ڪم نٿو ڪري. پهرين فڪس ڪرڻ سان طريقو ڪم ڪرڻ ڇڏي ڏئي ٿو.
ويجهن رنگن جي نالن تي نظر رکندڙ پڙهندڙن لاءِ، ميٿائل بلو بمقابله ميٿيلين بلو هڪ اينائني ٽرائي ايرائل ميٿين رنگ ۽ ڪيٽائني فينوٿائيازِين خاندان جي وچ ۾ هڪ ٻيو، وڌيڪ وڏو مونجهارو واضح ڪري ٿو. ليبارٽري ۾ رنگڻ جو مجموعي جائزو سوپراوائيٽل ڪم کي فڪس ڪيل فلمن جي طريقن سان گڏ بيان ڪري ٿو، ۽ رت جي خلين جي شڪل ۽ بناوت واري رهنمائي ڏيکاري ٿي ته ريٽيڪيولوسائيٽن جو جائزو وسيع تفريقي ڳڻپ ۾ ڪٿي اچي ٿو.
| ريجنٽ | سڃاڻپ | C.I. / CAS | ريٽيڪيولوسائيٽ جي ڪم ۾ ڪردار |
|---|---|---|---|
| نيو ميٿيلين بلو N | ايٿائل امينو، رنگ تي ڊاءِ ميٿائل گروپن وارو فينوٿائيازِين | C.I. 52030 (Basic Blue 24)؛ ڪلورائيڊ لاءِ CAS 1934-16-3 | معياري دستي سوپراوائيٽل رنگ، ڀيٽ لاءِ ترجيحي معيار |
| عام ميٿيلين بلو | بِس(ڊاءِ ميٿائل امينو) فينوٿائيازِين (ميٿائلٿائونينيم ڪلورائيڊ) | C.I. 52015 (Basic Blue 9)؛ CAS 61-73-4 | ريٽيڪيولوسائيٽ رنگڻ لاءِ ڪمزور رنگ، متبادل ناهي |
| برليئنٽ ڪريسل بلو | آڪزازِين رنگ، فراهم ڪندڙ موجب فارموليشن بدلجي ٿي | C.I. 51010؛ لوڻ جي صورت موجب CAS 81029-05-2 يا 10127-36-3 | قابل قبول سوپراوائيٽل رنگ، گهٽ هڪجهڙو، هم آهنگ ڪيل ڀيٽي معيار ناهي |
ڪيٽلاگ بابت هڪ احتياط: نيو ميٿيلين بلو جي زنڪ ڪلورائيڊ واري ٻٽي لوڻ جي هڪ الڳ صورت CAS 6586-05-6 تحت موجود آهي. تنهنڪري طريقن واري حصي ۾ رڳو عام نالو نه، پر لوڻ جي صورت ۽ فراهم ڪندڙ جو نالو به ڄاڻائڻ گهرجي.
سوپراوائيٽل رنگڻ اصل ۾ ڇا ڪري ٿو
ريٽيڪيولوسائيٽ هڪ نوجوان ڳاڙهو خليو آهي، جنهن پنهنجو مرڪز وڃائي ڇڏيو آهي پر ان ۾ رائبوسومل RNA جا باقيات موجود آهن. اڻ رنگيل آلي تياري ۾ اهو RNA نظر نٿو اچي. سوپراوائيٽل رنگ زنده خليي ۾ داخل ٿي ان RNA کي رسوب يا گڏ ڪري نيرن داڻن ۽ ڌاڳن ۾ بدلائي ٿو؛ اهو ئي ڄاري ۽ ڌاڳن جهڙو مادو آهي جيڪو آئل اِمرشن هيٺ نظر اچي ٿو. تنهنڪري اها ڄاري رنگڻ جي پيداوار آهي، ڪو اڳواٽ ٺهيل ڍانچو ناهي جيڪو رنگ جو منتظر هجي. انهيءَ ڪري پروٽوڪول جا متغير، جهڙوڪ رنگ جو ارتڪاز، بفر، رت ۽ رنگ جو تناسب، گرمي پد ۽ وقت، رنگ جي نالي جيترا ئي اهم آهن.
عملي نتيجو اهو آهي ته عملن جي ترتيب سختيءَ سان برقرار رکجي: پهرين رت، جنهن ۾ رت ڄمڻ کان روڪيندڙ مادو شامل هجي، رنگ سان ملايو، انڪيوبيٽ ڪريو، پوءِ فلمون ٺاهيو ۽ انهن کي فڪس ڪرڻ يا اضافي رنگ لڳائڻ کان سواءِ جاچيو. رنگڻ کان اڳ فڪسيشن ڪرڻ، يا اهڙو اضافي رنگ لڳائڻ جيڪو هلڪن ڌاڳن کي لڪائي ڇڏي، ان معلومات کي ختم ڪري ٿو جنهن تي ڳڻپ ڀاڙي ٿي.
نيو ميٿيلين بلو سان ريٽيڪيولوسائيٽ جو عملي پروٽوڪول
ڪا هڪ عالمگير فارموليشن ناهي، تنهنڪري استعمال ڪيل فارموليشن رپورٽ ڪريو. ٽي دستاويز ٿيل صورتون هن فرق جي حد ڏيکارين ٿيون.
روايتي Brecher قسم جي طريقي ۾ پوٽاشيم آڪسيليٽ سان لڳ ڀڳ 0.5 سيڪڙو نيو ميٿيلين بلو استعمال ٿئي ٿو، جنهن کي چڱيءَ طرح ملايل EDTA رت سان برابر مقدارن ۾ ملائي ڪمري جي گرمي پد تي لڳ ڀڳ 10 کان 15 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو وڃي ٿو. نرميءَ سان ٻيهر ملائڻ کان پوءِ، پچر نما پتليون فلمون تيار ڪري، هوا ۾ سڪائي، فڪس ڪرڻ کان سواءِ 100x آئل آبجيڪٽو هيٺ جاچيون وڃن ٿيون. ريٽيڪيولوسائيٽ ڳڻڻ جو NCBI طريقو هن ڪم جي ترتيب ۽ ان سان استعمال ٿيندڙ ڳڻپ واري فريم کي بيان ڪري ٿو.
Dacie ۽ Lewis واري صورت ۾ سائٽريٽ سالين ۾ 1.0 سيڪڙو نيو ميٿيلين بلو استعمال ٿئي ٿو، ان کي رت جي 2 کان 4 مقدارن سان ملايو وڃي ٿو ۽ فلم ٺاهڻ کان اڳ 37 C تي 15 کان 20 منٽن تائين رکيو وڃي ٿو. CLSI H44 طريقي جي هڪ تازي هم آهنگي واري عملدرآمد ۾ pH 7.4 تي فاسفيٽ بفر ٿيل سالين ۾ وڌيڪ هلڪو، 0.1 سيڪڙو محلول استعمال ڪيو ويو، جنهن کي 20 C تي 10 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو ۽ فڪسيشن نه ڪئي وئي، جيئن 2026 جي NMB هم آهنگي واري مطالعي ۾ رپورٽ ٿيل آهي.
ڳڻپ جا اصول سڀني صورتن ۾ ساڳيا آهن. ڪنهن خليي کي ريٽيڪيولوسائيٽ تڏهن ڳڻيو جڏهن ان ۾ گهٽ ۾ گهٽ ٻه الڳ نيرا رنگيل داڻا يا ڌاڳن جا ٽڪرا هجن؛ اهڙيءَ طرح رنگ جي اڪيلي جمع ٿيل ذرڙي کي خارج ڪيو وڃي ٿو. معمول جي ڪم ۾ گهٽ ۾ گهٽ 1,000 ڳاڙها خليا ڳڻيو ۽ ريٽيڪيولوسائيٽن کي سيڪڙي طور رپورٽ ڪريو. گهٽ سيڪڙن تي شمارياتي اعتبار لاءِ وڌيڪ خليا گهربل آهن. CLSI H44 طريقي جي هڪ جائزي موجب، ريٽيڪيولوسائيٽن جو تناسب لڳ ڀڳ 1 سيڪڙو هجي ته ڳڻپ جي تبديلي کي 5 سيڪڙو تائين آڻڻ لاءِ لڳ ڀڳ 4,400 خليا گهربل آهن، جيئن De Gruyter تي CLSI H44 جي جائزي ۾ ڄاڻايل آهي. Miller اک واري ڊسڪ وڏي ڳڻپ کي عملي بڻائي ٿي. رنگ کي فلٽر ڪريو يا تازو تيار ڪريو، ڇو ته رسوب، خليي اندر داڻيدار جزن جهڙو نظر اچي ٿو.
ساڳي تياري ۾ هائنز جسم
ساڳي سوپراوائيٽل فلم هائنز جسم به ڏيکاري سگهي ٿي، جيڪي بچيل RNA بدران آڪسائيڊ ٿيل ۽ پنهنجي اصل بناوت وڃايل هيموگلوبن جا گڏ ٿيل مجموعا آهن. نيو ميٿيلين بلو جي تيارين ۾ اهي گول جسمن طور نظر اچن ٿا، اڪثر هڪ اڪيلي جسم جي صورت ۾ ۽ جھليءَ جي ويجهو، ۽ ڄاري ۽ ڌاڳن جهڙي مادي کان هلڪو نيرو رنگ وٺن ٿا. فڪسيشن ۽ اضافي رنگڻ دوران اهي چڱيءَ طرح برقرار نٿا رهن، تنهنڪري اڻ فڪس ڪيل فلم جاچيو. هڪ تازي پروٽوڪول ۾ EDTA رت جا 20 مائڪروليٽر، 1 سيڪڙو نيو ميٿيلين بلو جي 20 مائڪروليٽرن سان ملائي 15 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيا ويا، ۽ 250 ڳاڙهن رت جي خلين مان هائنز جسم رکندڙ خلين جي ڳڻپ ڪئي وئي، جيئن اهو طريقو رپورٽ ڪندڙ PMC مطالعي ۾ ڏنل آهي.
ٻه فرق غلط پڙهڻ کان بچائين ٿا. پهريون، ميٿائل وائلٽ ۽ ڪرسٽل وائلٽ، نيو ميٿيلين بلو کان وڌيڪ شدت سان هائنز جسمن کي رنگين ٿا، جيئن ScienceDirect جي هائنز جسم واري موضوع ۾ ڄاڻايل آهي. نيو ميٿيلين بلو تڏهن آسان چونڊ آهي جڏهن ريٽيڪيولوسائيٽن ۽ هائنز جسمن جو گڏ جائزو وٺڻو هجي؛ اهو خاص هائنز جسمن لاءِ سڀ کان طاقتور رنگ ناهي. ٻيو، الفا ٿيليسيميا ٽريٽ ۾ HbH جا اندروني جزا سوپراوائيٽل رنگڻ کان پوءِ سڄي خليي ۾ ڪيترائي سنها نقطا پيدا ڪن ٿا، جڏهن ته روايتي هائنز جسم گهٽ، وڏا ۽ اڪثر جھليءَ سان لاڳاپيل هوندا آهن. جمع ٿيل رنگ ٽيون مشابهت رکندڙ عنصر آهي: اهو خلين جي فوڪل سطح کان ٻاهر هوندو آهي ۽ مختلف نظاري وارن حصن ۾ بدلجندو آهي.
برليئنٽ ڪريسل بلو بمقابله نيو ميٿيلين بلو
ٻئي رنگ ريٽيڪيولوسائيٽن لاءِ سوپراوائيٽل رنگ آهن، پر معياربندي انهن مان هڪ کي ترجيح ڏئي ٿي. CLSI H44-A2 ريٽيڪيولوسائيٽ طريقو، جيڪو رت جي علم ۾ معياربندي لاءِ بين الاقوامي ڪائونسل سان گڏ تيار ڪيو ويو ۽ CLSI H44 معيار واري صفحي تي درج آهي، EDTA رت کي نيو ميٿيلين بلو سان رنگڻ کي دستي ڀيٽي طريقي طور مقرر ڪري ٿو. رت جي علم جي روايتي تعليم به ظاهري نتيجي بابت متفق آهي: نيو ميٿيلين بلو ڌاڳن کي وڌيڪ گهرو ۽ وڌيڪ هڪجهڙو رنگ ڏئي ٿو، جڏهن ته برليئنٽ ڪريسل بلو ۾ کيپن ۽ نمونن جي وچ ۾ وڌيڪ فرق هوندو آهي.
ان حيثيت سان هڪ وضاحت ضروري آهي. ICSH جي تجزياتي اوزار جي جائزي واري رهنمائي نيو ميٿيلين بلو سان دستي خوردبيني جاچ کي حوالي واري ڀيٽي طريقي طور قبول ڪري ٿي، پر ان کي ذاتي فيصلي تي ٻڌل ۽ نسبتاً گهٽ درست قرار ڏئي ٿي؛ جتي فلو سائٽوميٽري جا حوالي وارا طريقا موجود هجن، اتي انهن کي ترجيح ڏني وڃي ٿي. 100 نمونن جي 2022 واري ڀيٽ ۾ استعمال ٿيل تجزياتي اوزار جي نتيجن جي ڀيٽ ۾ برليئنٽ ڪريسل بلو سان نيو ميٿيلين بلو جي ڀيٽ ۾ گهٽ منظم انحراف مليو، جيئن رنگڻ جي طريقن جي PMC ڀيٽ ۾ رپورٽ ٿيل آهي. شاگردن لاءِ قابل دفاع خلاصو هي آهي: نيو ميٿيلين بلو کي معياري دستي ڀيٽي معيار طور استعمال ڪريو، ڪنهن به مقامي برليئنٽ ڪريسل بلو طريقي جي تصديق ان سان يا خودڪار طريقي سان ڀيٽ ڪري ڪريو، ۽ ٻنهي حالتن ۾ دستي خوردبيني جاچ مان نتيجن ۾ وڌيڪ پکڙاءُ جي اميد رکو. پراڻي معياربندي واري ادب ۾ صاف ڪيل Azure B کي به ڪيميائي لحاظ کان وڌيڪ خالص متبادل طور تجويز ڪيو ويو هو، ڇاڪاڻ ته واپاري رنگن جون کيپون مختلف هونديون هيون، جيئن Azure B بابت Marshall جي مطالعي ۾ ڏنل آهي؛ انهيءَ مان واضح ٿئي ٿو ته ريجنٽ جو گريڊ اڃا به طريقن جي بحثن ۾ ڇو اچي ٿو.
عام غلطين کان بچڻ
گهڻي ڀاڱي ناڪام تيارين جو سبب چار غلطيون آهن. نيو ميٿيلين بلو N بدران عام ميٿيلين بلو گهرائڻ سان رنگڻ ڪيميائي سببن ڪري ڪمزور ٿئي ٿو، نه ته ٽيڪنڪ جي ڪري. پڙهڻ کان اڳ فڪس ڪرڻ يا اضافي رنگ لڳائڻ سوپراوائيٽل اشارو ختم ڪري ٿو. رنگ جي رسوب کي داڻن طور ڳڻڻ نتيجو وڌائي ٿو، جنهن کان ٻن داڻن وارو اصول ۽ فلٽر ڪيل رنگ بچائين ٿا. ريٽيڪيولوسائيٽن جا سيڪڙا گهٽ هئڻ وقت تمام ٿورا خليا ڳڻڻ سان اهڙو انگ ملي ٿو جيڪو ڏسڻ ۾ درست لڳي ٿو، پر جنهن جون اعتماد جون حدون وسيع هونديون آهن. هر غلطيءَ جي ساڳي نشاني آهي: خوردبيني جاچ ڪندڙ ان ڳالهه لاءِ خوردبين کي الزام ڏئي ٿو، جنهن جو فيصلو ريجنٽ واري مرحلي ۾ ئي ٿي چڪو هو.