ميٿيلين بلو سان سادي رنگائي ۽ گرام رنگائي: هر طريقو ڇا ثابت ڪري سگهي ٿو

هڪ شاگرد E. coli جو ليبل لڳل ڪلچر مان سلائيڊ تي هڪ سنهي تهه تيار ڪري ٿو، ان کي هڪ منٽ لاءِ ميٿيلين بلو سان مڪمل ڍڪي ٿو، ڌوئي ٿو ۽ تيل واري عدسي مان ڏسي ٿو. ڏسڻ جي ميدان ۾ نيري رنگ جون لٺ جهڙيون خلائون پکڙيل آهن. ليبارٽري جي رپورٽ ۾ لکيل آهي: "گرام-منفي لٺ جهڙن بيڪٽيريا جي E. coli طور سڃاڻپ ڪئي وئي." مشاهدو درست آهي. پر اها سلائيڊ ان نتيجي لاءِ ڪافي ثبوت نٿي ڏئي.

غلطي فني نه، پر تصوراتي آهي. شاگرد سادي رنگائي کي ائين ورتو ڄڻ اها فرق ڪندڙ آزمائش هجي. سادي رنگائي ۽ گرام رنگائي مختلف سوالن جا جواب ڏين ٿيون، ڇو ته انهن ۾ رنگائي جا مختلف تصور ڪم ڪن ٿا. هڪ پڇي ٿي: ڪهڙي شڪل موجود آهي. ٻي پڇي ٿي: آزمائش هيٺ خلوي ڀت ڪيئن ورتاءُ ڪري ٿي. انهن ٻنهي کي گڏائي ڇڏڻ سان صحيح رنگيل سلائيڊ به بي بنياد رپورٽ جو سبب بڻجي ٿي.

هيءَ ڀيٽ ٻنهي طريقن کي الڳ رکي ٿي، ڏيکاري ٿي ته هر نتيجي جي بنياد تي ڪهڙي دعويٰ ڪري سگهجي ٿي، ۽ شاگردن جي ٻن سڀ کان عام سوالن جا جواب ڏئي ٿي: ڇا ميٿيلين بلو گرام رنگائي ۾ استعمال ٿي سگهي ٿو، ۽ E. coli جي ميٿيلين بلو رنگائي اصل ۾ ڇا ڏيکاري ٿي.

مختصر جواب

ميٿيلين بلو سان سادي رنگائي هر رنگ وٺندڙ خليي کي ساڳيو نيرو رنگ ڏئي ٿي، تنهنڪري اها بناوتي شڪل (لٺيون، گولا، پيچدار شڪليون) ۽ ترتيب (اڪيلو، جوڙن ۾، زنجيرن ۾) ظاهر ڪري ٿي، پر گرام درجي بابت ڪجهه به نٿي ٻڌائي. گرام رنگائي ۾ آيوڊين، رنگ لاهڻ جو مرحلو ۽ مقابلي وارو رنگ شامل هوندا آهن، تنهنڪري اها بيڪٽيريا کي گرام-مثبت (واڱڻائي) ۽ گرام-منفي (گلابي يا ڳاڙهو) گروهن ۾ الڳ ڪري ٿي، ان بنياد تي ته سندن خلوي غلاف رنگ کي ڪيئن برقرار رکن ٿا. ميٿيلين بلو کان پوءِ نيريون لٺيون ڏسڻ جو مطلب آهي ته "لٺ جي شڪل وارا خليا موجود آهن." مڪمل گرام سلسلي کان پوءِ گلابي لٺيون ڏسڻ جو مطلب آهي ته "گرام-منفي لٺ جهڙا بيڪٽيريا موجود آهن." ٻيو بيان وڌيڪ مضبوط آهي، ڇو ته طريقيڪار ۾ هڪ اضافي آزمائش ڪئي وئي هئي.

بيڪٽيريا لاءِ هڪ رنگ استعمال ڪندڙ طريقن جي وسيع خاندان بابت، جنهن سان هي مضمون لاڳاپيل آهي، خوردبيني رنگائي جو ائٽلس ڏسو.

سادي رنگائي: هڪ رنگ، هڪ سوال

ميٿيلين بلو هڪ بنيادي (ڪيٽائوني) رنگ آهي. ان جو رنگين آئن مثبت چارج رکي ٿو ۽ خليي جي منفي چارج وارين بناوتن سان ڳنڍجي ٿو، جن ۾ نيوڪليئڪ تيزاب ۽ مٿاڇري جا تيزابي گروهه شامل آهن، تنهنڪري هلڪي پسمنظر تي خليا نيرا نظر اچن ٿا. OpenStax پنهنجي رنگائي واري باب ۾ هن مثبت رنگائي جي اصول کي بيان ڪري ٿو. رنگ جو ڪيٽائن پاڻ ننڍو، چپٽو فينوٿائيازين آئن آهي، جنهن جو تفصيل ميٿيلين بلو جي ڪيميائي حوالي ۾ ڏنل آهي؛ ڪلورائڊ جو مخالف آئن رنگ ڏيڻ جو ڪم نٿو ڪري.

معياري تدريسي طريقيڪار ڄاڻي واڻي سادو رکيل آهي: سلائيڊ تي سنهي تهه ٺاهيو، هوا ۾ سڪايو، گرميءَ سان چنبڙايو، لڳ ڀڳ 1% پاڻيءَ ۾ حل ٿيل ميٿيلين بلو سان اٽڪل هڪ منٽ لاءِ مڪمل ڍڪيو، پاڻيءَ سان نرميءَ سان ڌوئو، جذب ڪندڙ ڪاغذ سان سڪايو، ۽ تيل ۾ ٻوڙيل عدسي سان جاچيو. LibreTexts جو هڪ تدريسي طريقيڪار بلڪل اهو ئي 1%، هڪ منٽ وارو طريقو ڏئي ٿو، گڏوگڏ ٻڌائي ٿو ته ڪجهه ليبارٽريون وقت وڌائين ٿيون. نه رنگ پڪو ڪندڙ مادو، نه رنگ لاهيندڙ مادو، نه ٻيو رنگ. انهن جو نه هجڻ ئي اهم ڳالهه آهي. رڳو هڪ رنگ ۽ چونڊيل رنگ لاهڻ کان سواءِ، هر اهو خليو جيڪو رنگ سان ڳنڍجي ٿو، آخرڪار ساڳئي رنگ جو ٿئي ٿو.

E. coli سان، متوقع ميدان ۾ نيريون لٺيون (بيسلي) نظر اچن ٿيون، اڪيليون، جوڙن ۾ يا ننڍن گروهن ۾. نيرو رنگ رنگين مادي مان اچي ٿو. لٺ جهڙي شڪل جاندار مان اچي ٿي. پر ٻنهي جو گڏيل ڏيک جاندار جي سڃاڻپ نٿو ڪري، ڇو ته ڪيترين ئي نوعن جي شڪل لٺ جهڙي هوندي آهي ۽ ڪيترائي لٺ جهڙا بيڪٽيريا سادي رنگائي ۾ نيرا ٿيندا آهن. ATCC پنهنجي خرد حياتيات جي ڪلچر گائيڊ ۾ رڳو بناوتي شڪل تائين محدود هجڻ واري ڳالهه واضح ڪري ٿو. صحيح رپورٽ ۾ لکبو: "نيرا بيسلي ڏٺا ويا." شڪل ۽ ترتيب کان اڳتي ڪنهن به ڳالهه لاءِ وڌيڪ ثبوت گهرجن.

گرام رنگائي: چار ريجنٽ، ورتاءَ جي هڪ آزمائش

گرام رنگائي فرق ڪندڙ رنگائي آهي. اها سڀني خلين کي ساڳئي سلسلي مان گذاري ٿي ۽ ڏسي ٿي ته ڪهڙا خليا پهريون رنگ برقرار رکن ٿا ۽ ڪهڙا وڃائين ٿا. American Society for Microbiology جا گرام رنگائي طريقيڪار معياري چئن مرحلن جو ترتيبوار سلسلو بيان ڪن ٿا: ڪرسٽل وايوليٽ (بنيادي رنگ)، گرام آيوڊين (رنگ پڪو ڪندڙ مادو)، الڪوحل يا ايسٽون-الڪوحل (رنگ لاهيندڙ مادو)، پوءِ سافرانن (مقابلي وارو رنگ).

معياري تدريسي نمونو هن فرق کي خلوي غلاف جي بناوت ذريعي سمجهائي ٿو. گرام-مثبت خلين ۾ پيپٽيڊوگلائيڪن جي ٿلهي ڀت هوندي آهي، جيڪا الڪوحل سان ڌوئڻ دوران پاڻي وڃائي ٿي ۽ ڪرسٽل وايوليٽ-آيوڊين مرڪب کي برقرار رکي ٿي. گرام-منفي خلين ۾ پيپٽيڊوگلائيڪن جي سنهي تهه سان گڏ چرٻيءَ سان ڀرپور ٻاهرين جھلي هوندي آهي، جنهن کي رنگ لاهيندڙ مادو ٽوڙي ٿو، تنهنڪري مرڪب ڌوپجي نڪري وڃي ٿو ۽ پوءِ خليا سافرانن جذب ڪن ٿا. NCBI Bookshelf جو گرام رنگائي بابت جائزو خلوي ڀت جي هيءَ وضاحت ڏئي ٿو. ماهر اهو به ٻڌائين ٿا ته مڪمل طبعي ڪيميا رڳو ڀت جي ٿولهه کان وڌيڪ پيچيده آهي، پر ليبارٽري ۾ نتيجي جي تشريح لاءِ ورتاءَ وارو اصول لاڳو رهي ٿو: واڱڻائي جو مطلب رنگ برقرار رهيو، گلابي جو مطلب پهريون رنگ وڃايو ويو ۽ پوءِ مقابلي واري رنگ سان رنگيو ويو.

سمجهاڻي لاءِ پينل. طريقن جي ڀيٽ لاءِ اندازائتا خاڪا، ڪئميرا سان ورتل خوردبيني ڦوٽو نه. منطق سمجهائڻ لاءِ رنگ سادا رکيا ويا آهن: سادي رنگائي ۾ هڪ رنگ، گرام رنگ لاهڻ کان پوءِ ٻه رنگ.

ڇا ميٿيلين بلو گرام رنگائي ۾ استعمال ٿي سگهي ٿو

هن سوال جون ٻه معنائون آهن، ۽ ٻنهي لاءِ مختلف جواب گهرجن.

پهرين معنيٰ: ڇا هڪ ڀيرو ميٿيلين بلو سان مڪمل ڍڪڻ، سڄي گرام سلسلي جي جاءِ وٺي سگهي ٿو. نه. آيوڊين، رنگ لاهيندڙ مادي ۽ مقابلي واري رنگ کان سواءِ ڪو فرق ڪندڙ مرحلو نه هوندو، تنهنڪري ڪنهن به گرام درجي جي آزمائش نه ٿيندي. رڳو ميٿيلين بلو کان پوءِ نيرو ميدان سادي رنگائي جو نتيجو آهي، ڀلي بوتل گرام ريجنٽن جي ڀرسان رکيل هجي. ان کي گرام نتيجي طور درج نه ڪريو.

ٻي معنيٰ: ڇا ميٿيلين بلو مرحلي 4 ۾ مقابلي واري رنگ طور سافرانن جي جاءِ وٺي سگهي ٿو. ڪم جي لحاظ کان اهو بي رنگ ڪيل خلين کي رنگ ڏئي سگهي ٿو، ۽ درسي ڪتاب جي هڪ مشق اهڙي تبديليءَ کان پوءِ واڱڻائي گرام-مثبت خليا ۽ نيرا گرام-منفي خليا ٿيڻ جي اڳڪٿي ڪري ٿي. منطق درست آهي، ڇو ته صحيح نموني بي رنگ ڪيل گرام-منفي خليا لڳ ڀڳ بي رنگ هوندا آهن ۽ ٻيو ڪيٽائوني رنگ جذب ڪندا. پر اهو معياري طريقيڪار ناهي. ASM جا طريقيڪار سافرانن مقرر ڪن ٿا، ۽ ڪجهه مختلف صورتن ۾ بنيادي فوڪسن جهڙا تسليم ٿيل متبادل ڏين ٿا، ميٿيلين بلو نه. هڪ عملي نقصان به آهي: واڱڻائي جي مقابلي ۾ نيرو سڃاڻڻ، واڱڻائي جي مقابلي ۾ گلابي سڃاڻڻ کان وڌيڪ ڏکيو آهي، خاص ڪري نون سکڻ وارن لاءِ ۽ خاص ڪري ڪمزور خوردبيني بلبن هيٺ. درسي ڪم ۽ ڪنهن به اهم نتيجي لاءِ اهو مقابلي وارو رنگ استعمال ڪريو جيڪو توهان جي طريقيڪار ۾ ڄاڻايل هجي، عام طور سافرانن، ۽ ميٿيلين بلو کي مقابلي واري رنگ طور معياري طريقي جي برابر سمجهڻ بدران، مظاهري لاءِ هڪ مختلف صورت سمجهو.

ميٿيلين بلو جي ٻين هڪ-رنگ وارن اختيارن سان ڀيٽ بابت لاڳاپيل سوال، بيڪٽيريا جي سادي رنگائين جي ڀيٽ ۾ بيان ٿيل آهي.

E. coli جي ميٿيلين بلو رنگائي ڇا ثابت ڪري ٿي، ۽ ڇا نٿي ڪري

E. coli هڪ گرام-منفي لٺ جهڙو بيڪٽيريم آهي، پر هي جملو ڪيترن طريقن مان حاصل ٿيل حقيقتون گڏ ڪري ٿو: بناوتي شڪل خوردبيني مشاهدي مان، گرام ردعمل گرام رنگائي مان، ۽ سڃاڻپ ڪلچر سان گڏ حياتياتي ڪيميائي يا ماليڪيولي آزمائشن مان. ميٿيلين بلو سان رنگيل سنهي تهه رڳو پهريون حصو مهيا ڪري ٿي. اها ثابت ڪري ٿي ته رنگيل نموني ۾ لٺ جي شڪل وارا خليا موجود آهن ۽ اهي ڪيئن ترتيب ڏنل آهن. اها گرام ردعمل ثابت نٿي ڪري، ڇو ته رنگ لاهڻ جي آزمائش ڪئي ئي نه وئي. اها نوع جي سڃاڻپ نٿي ڪري، ڇو ته هن سطح جي تفصيل تي ڪيترين ئي نوعن جا لٺ جهڙا خليا هڪجهڙا نظر اچن ٿا.

هتي رپورٽون هڪ متوقع نموني سان غلط ٿي وڃن ٿيون. ليکڪ اڳواٽ ڄاڻ ("هي ڪلچر E. coli هجڻ گهرجي، ۽ E. coli گرام-منفي آهي") مشاهدي واري سٽ ۾ شامل ڪري ڇڏي ٿو، تنهنڪري سلائيڊ ان ڳالهه جي تصديق ڪندي نظر اچي ٿي جيڪا اصل ۾ فرض ڪئي وئي هئي. وڌيڪ صاف رپورٽ انهن سطحن کي الڳ رکي ٿي: "ميٿيلين بلو سان سادي رنگائي: نيرا بيسلي ڏٺا ويا؛ رڳو بناوتي شڪل، ڪنهن گرام درجي جي آزمائش نه ڪئي وئي." پوءِ، جيڪڏهن ڪنٽرولن سان گرام رنگائي صحيح نموني ڪئي وئي هجي: "گرام رنگائي: گلابي لٺيون، گرام-منفي هجڻ سان موافق." نوع جي سڃاڻپ پوءِ سڃاڻپ واري ڪم جي سلسلي مان اچي ٿي، رڳو رنگ مان نه.

تشريح لاءِ عملي رهنمائي

ليبارٽري ۾ هي فيصلو ڪرڻ وارو اصول استعمال ڪريو. جيڪڏهن سڀ خليا هڪ رنگ جا آهن ۽ طريقيڪار ۾ رنگ لاهيندڙ مادي کان سواءِ رڳو هڪ رنگ استعمال ٿيو آهي، ته توهان سادي رنگائي ڪئي آهي. شڪل، ماپ جو اندازو ۽ ترتيب رپورٽ ڪريو. اتي ئي رڪجو. جيڪڏهن طريقيڪار ۾ معلوم مثبت ۽ منفي ڪنٽرولن سان ڪرسٽل وايوليٽ، آيوڊين، رنگ لاهيندڙ مادو ۽ مقابلي وارو رنگ استعمال ٿيا آهن، ته توهان گرام رنگائي ڪئي آهي. رنگ سان گڏ بناوتي شڪل رپورٽ ڪريو: زنجيرن ۾ واڱڻائي گول بيڪٽيريا، گلابي لٺيون، وغيره.

گهڻو مونجهارو ٽن غلطين سبب ٿيندو آهي. پهرين، نيرين لٺين کي وڌائي E. coli جي تصديق سمجهڻ. ٻي، نوٽ بڪ ۾ ميٿيلين بلو واري سلائيڊ کي "گرام رنگائي" جي عنوان هيٺ درج ڪرڻ، جنهن کي پوءِ پڙهندڙ غلط سمجهندا. ٽين، مقابلي وارا رنگ بنا سوچ ويچار جي مٽائڻ ۽ پوءِ مختلف ليبارٽرين جي رنگن جي ائين ڀيٽ ڪرڻ ڄڻ رنگن جا مجموعا ساڳيا هجن. هر غلطي جو حل ساڳيو آهي: اصل ۾ ڪيل طريقي جو نالو لکو، ۽ رڳو اها دعويٰ ڪريو جنهن جي اهو طريقو آزمائش ڪري ٿو.

سادي رنگائي پنهنجي اهميت ان ڪري ئي رکي ٿي، جو اها ٿوري ڳالهه جي دعويٰ ڪري ٿي. اها تيز آهي، ننڍين عملي غلطين باوجود ڪارائتي رهي ٿي، ۽ جڏهن سوال بناوتي شڪل جو هجي ته ڪافي آهي: ڇا اتي ڪجهه موجود آهي، ۽ ان جي شڪل ڪهڙي آهي. جڏهن سوال درجي بنديءَ جو هجي، ته فرق ڪندڙ آزمائش ڪريو. نيري سلائيڊ ٻڌائي ٿي ته خليا ڪيئن نظر اچن ٿا. واڱڻائي يا گلابي سلائيڊ ٻڌائي ٿي ته سندن ڀتيون ڪيئن ورتاءُ ڪن ٿيون. ڪا به سلائيڊ، اڪيلي سر، نوع جي سڃاڻپ نٿي ٻڌائي.