آرٽيڪل
ميٿيلين بلو ۽ نائٽرڪ آڪسائيڊ: NOS، cGMP، ۽ رت جي رڳن ۾ سگنل رسائي
سوال سادو لڳي ٿو: ڇا ميٿيلين بلو نائٽرڪ آڪسائيڊ کي روڪي ٿو؟ ليبارٽري ۾ ان جو جواب چار الڳ سوالن ۾ ورهائجي ٿو، ۽ هر هڪ جي پنهنجي تجرباتي جاچ آهي. انهن کي پاڻ ۾ گڏي ڇڏڻ ئي اهو مکيه سبب آهي، جنهن ڪري ميٿيلين بلو ۽ نائٽرڪ آڪسائيڊ بابت لکڻيون پراعتماد ته لڳن ٿيون، پر اڻچٽيون رهن ٿيون.
نائٽرڪ آڪسائيڊ جي سگنل کي چئن ڪڙين واري زنجير سمجهو. نائٽرڪ آڪسائيڊ سنٿيز ٺاهڻ لاءِ هڪ جين جي ٽرانسڪرپشن ٿئي ٿي. اينزائم ارجينين کي نائٽرڪ آڪسائيڊ ۾ بدلائي ٿو. گئس ڪنهن ٻي شيءِ سان ردعمل ڪرڻ کان اڳ پکڙجي پنهنجي هدف تائين پهچي ٿي. حل پذير گوانائليٽ سائڪليز ان کي سڃاڻي سائڪلڪ GMP ٺاهي ٿو. ميٿيلين بلو جا هر ڪڙيءَ تي اثر شايع ٿيل آهن، پر اهي ثبوت مختلف تجرباتي نظامن، مختلف ڪنسنٽريشنن، ۽ مختلف آئسوفارمن مان آيا آهن. هڪ ڪڙيءَ تي مليل نتيجو ٻي ڪڙيءَ تي عمل جو ثبوت ناهي.
معياري زنجير، سادن لفظن ۾
رت جي رڳ جي ڀت ۾ عام سلسلو هن ريت هلي ٿو. هڪ محرڪ اينڊوٿيليل خليي تي اثر ڪري ٿو. اينڊوٿيليل نائٽرڪ آڪسائيڊ سنٿيز، جنهن کي eNOS يا NOS3 چيو وڃي ٿو، نائٽرڪ آڪسائيڊ جي ٿوري مقدار ٿوري وقت لاءِ ٺاهي ٿو. گئس پکڙجي ڀر واري هموار عضلي جي خليي ۾ وڃي ٿي، حل پذير گوانائليٽ سائڪليز جي ريڊيوس ٿيل لوهه واري هيم سان ڳنڍجي ٿي، ۽ GTP کي سائڪلڪ GMP ۾ بدلائڻ جي رفتار وڌائي ٿي. سائڪلڪ GMP، پروٽين ڪائنيز G کي فعال ڪري ٿو، ڪيلشيم جي سنڀال جو عمل بدلجي ٿو، ۽ عضلو ڍرو ٿي وڃي ٿو.
هڪ ٻي زنجير به آهي، جنهن کي الڳ رکڻ گهرجي. انفيڪشن يا سائٽوڪائن سان واسطي دوران، خليي هڪ مختلف اينزائم جي ٽرانسڪرپشن ڪن ٿا: تحريڪ سان ٺهندڙ نائٽرڪ آڪسائيڊ سنٿيز يا iNOS، جنهن کي NOS2 به چيو وڃي ٿو. اهو eNOS جي ڀيٽ ۾ نائٽرڪ آڪسائيڊ جو وڌيڪ ۽ گهڻي دير تائين جاري رهندڙ وهڪرو پيدا ڪري ٿو. ٽيون آئسوفارم، نيورونل NOS يا nNOS، وري هڪ ٻئي پسمنظر سان واسطو رکي ٿو. جڏهن ڪو مقالو آئسوفارم ڄاڻائڻ کان سواءِ نائٽرڪ آڪسائيڊ سنٿيز چوي، ته رڪجي ڏسو ته ڪهڙو آئسوفارم ماپيو ويو هو. ميٿيلين بلو اليڪٽران ڪيئن منتقل ڪري ٿو، ان بابت جائزو به عام طور ريڊاڪس هدفن لاءِ ساڳي ڳالهه ٻڌائي ٿو: منتقليءَ جو واسطو پاڻمرادو ڪجهه نٿو ڪري، ۽ هر ڇيڙي تي موجود ساٿي نتيجو طئي ڪري ٿو.
ماپيل سائڪلڪ GMP به گڏيل نتيجي جو اشارو آهي، سڌي اينزائم جاچ نه. ان جي سطح سائڪليز ذريعي ٺهڻ مان فاسفوڊائي ايسٽريزن ذريعي ٽٽڻ کي ڪٽڻ کان پوءِ واري توازن کي ظاهر ڪري ٿي؛ رت جي رڳن جي هموار عضلي ۾ خاص ڪري PDE5 اهم آهي. تنهن ڪري سائڪلڪ GMP ۾ گهٽتائيءَ جو مطلب آهي ته سڃاڻيندڙ تائين گهٽ سگنل پهتو. اها پاڻمرادو نٿي ٻڌائي ته ڪهڙي ڪڙي ناڪام ٿي.
ڪڙي 1: گهٽ iNOS اينزائم ٺهي ٿو
بيڪٽيريل لائپوپولي سيڪرائيڊ، انٽرفيرون گاما، يا ٻنهي سان متحرڪ ڪيل ڪوئن جي ميڪروفاجن ۾، ميٿيلين بلو iNOS پروٽين ۾ متوقع واڌ کي روڪيو ۽ ميڪروفاج ٽرانسڪرپشن جي تجربن ۾ iNOS ميسينجر RNA کي تمام گهڻو گهٽايو. وڌيڪ ڄاڻ ڏيندڙ حصو اهو آهي، جيڪو نه بدليو. روڪيندڙ I kappa B alpha جو ٽٽڻ، NF kappa B ۽ STAT1 جي فاسفوريليشن، ۽ انهن عنصرن جي نيوڪليئس ۾ منتقلي گهڻي ڀاڱي برقرار رهي. جيڪا شيءِ گهٽجي، سا انهن جو DNA سان ڳنڍجڻ هو؛ ڪروميٽن اميونوپريسيپيٽيشن ذريعي iNOS پروموٽر تي انهن جي گهٽ موجودگيءَ جي تصديق ٿي.
اهو اينزائم جي مقدار مقرر ٿيڻ کان اڳ واري مرحلي ۾ جين جي ضابطي تي اثر آهي، نه ته اڳ ۾ موجود اينزائم جي تڪڙي روڪ. ان جو واسطو سوزشي سگنل رسائيءَ سان آهي، جتي پروٽين ٺهڻ کان اڳ ٽرانسڪرپشن عنصرن کي پروموٽر سان ڳنڍجڻو پوي ٿو. اهو آرام واري رڳ ۾ مسلسل موجود eNOS بابت ڪا سڌي ڳالهه نٿو ٻڌائي، ۽ ان کي انهن ئي حدن ۾ بيان ڪرڻ گهرجي.
ڪڙي 2: موجود NOS اينزائم سست ڪم ڪري ٿو
چوهن تي هڪ مطالعي مختلف سطح جي جاچ ڪئي. هوش ۾ موجود نر چوهن کي رڳ ذريعي لائپوپولي سيڪرائيڊ ڏنو ويو، پوءِ ٽن ڪلاڪن بعد رڳ ذريعي يا ته لوڻ وارو محلول يا 3 mg في kg ميٿيلين بلو ڏنو ويو. هائپوٿيليمس ۾ NOS جي سرگرميءَ واري مطالعي ۾ هائپوٿيليمس جي وچئين بنيادي حصي ۾ نائٽرڪ آڪسائيڊ سنٿيز جي سرگرمي، نشان لڳل ارجينين جي سٽرولين ۾ تبديليءَ ذريعي ماپي وئي. رڳو دٻاءَ سان گڏ لوڻ واري محلول ڪجهه ڪيلشيم کان آزاد سرگرمي پيدا ڪئي، ۽ لائپوپولي سيڪرائيڊ ان کي ڪنٽرول سطح کان اٽڪل ڏهه ڀيرا وڌايو. ميٿيلين بلو ٻنهي تحريڪ سان پيدا ٿيل جزن کي ختم ڪيو. ان بافتي ۾، ان مقدار ۽ ان وقت تي، ڪيلشيم تي دارومدار رکندڙ مسلسل موجود سرگرمي نه بدلي.
ان نتيجي کي بلڪل ائين ئي پڙهو جيئن لکيل آهي: انهن حالتن هيٺ ماپيل iNOS قسم جي سرگرمي گهٽجي وئي. اها جين جي اظهار جي ماپ ناهي، ۽ نه ئي اهو ثبوت آهي ته eNOS يا nNOS جي ڀيٽ ۾ iNOS لاءِ چونڊ هميشه برقرار رهي ٿي. خالص ڪيل اينزائم تي ڪيل ڪم هن احتياط کي وڌيڪ واضح ڪري ٿو. خالص ڪيل نائٽرڪ آڪسائيڊ سنٿيز جي سڌين جاچن ۾، ميٿيلين بلو 30 مائڪرومولر تي سٽرولين ٺهڻ کي مڪمل طور روڪيو. اڌ سرگرمي روڪيندڙ ڪنسنٽريشن، سپر آڪسائيڊ ڊسميوٽيز کان سواءِ لڳ ڀڳ 5.3 مائڪرومولر ۽ ان سان گڏ 9.2 مائڪرومولر هئي، جيئن خالص ڪيل NOS ۽ گوانائليٽ سائڪليز جي ڀيٽ ۾ ٻڌايو ويو. خالص ڪيل nNOS جي هڪ الڳ مطالعي اينزائم سان ڳنڍيل هيم جي آڪسائيڊيشن ڏانهن اشارو ڪيو. عملي سبق اهو آهي ته الڳ ڪيل نظامن ۾ NOS جي سڌي روڪ واقعي ٿئي ٿي، پر هائپوٿيليمس جي نتيجي کي وڌائي اهو عام دعوو نٿو ڪري سگهجي ته ميٿيلين بلو هر هنڌ سڀني مسلسل موجود NOS کي اڻمتاثر ڇڏي ٿو.
ڪڙي 3: نائٽرڪ آڪسائيڊ پهچڻ کان اڳ ضايع ٿي وڃي ٿو
اهو سڀ کان چٽو ثبوت ته اينزائم جي روڪ کان سواءِ ڪا ٻي شيءِ به سائڪلڪ GMP جي گهٽتائي سمجهائي سگهي ٿي، ڪلچر ۾ وڌايل خرگوش جي ڦڦڙن واري شريان جي هموار عضلي جي خلين مان ملي ٿو. تجربي جي جوڙجڪ ۾ نائٽرڪ آڪسائيڊ ڏيندڙ مرڪب سڌي طرح شامل ڪري، جسم اندر موجود NOS واري مرحلي کي مڪمل طور پاسيرو ڪيو ويو. پوءِ رت جي رڳن جي هموار عضلي ۽ سپر آڪسائيڊ واري مطالعي ۾ ڏٺو ويو ته ڇا ميٿيلين بلو اڃا به سائڪلڪ GMP جي ردعمل کي گهٽائي ٿو.
ٽن ڏيندڙ مرڪبن کي 1 کان 100 مائڪرومولر تائين آزمايو ويو: S نائٽروسو L سسٽين، سوڊيم نائٽروپروسائيڊ، ۽ MPANO نالي هڪ مستحڪم، ڊي ايمي نيشن ٿيل مشابه مرڪب. سڀني سائڪلڪ GMP کي لڳ ڀڳ 1.5 ڀيرا کان 12 ڀيرا تائين وڌايو. 10 مائڪرومولر ميٿيلين بلو پهرين ٻن جي ردعمل کي 51 کان 100 سيڪڙو تائين روڪيو، جڏهن ته MPANO جو ردعمل اڻبدليل رهيو. جيڪڏهن ميٿيلين بلو رڳو سائڪليز جي ڪيٽاليٽڪ جاءِ کي روڪي رهيو هجي ها، ته ڏيندڙ مرڪبن بابت اها چونڊ سمجهائڻ ڏکي هجي ها، ڇو ته ٽيئي اڳتي هلي ساڳئي اينزائم تي اثر ڪن ٿا.
پوءِ ٽن ڪنٽرولن ان عمل کي سپر آڪسائيڊ سان ڳنڍي پڪو ڪيو. پهريون، زينٿين ۽ زينٿين آڪسائيڊيز سان خليي کان ٻاهر سپر آڪسائيڊ ٺاهڻ ساڳيو نمونو ورجايو: CYSNO ۽ نائٽروپروسائيڊ جو اثر رڪجي ويو، جڏهن ته MPANO جو برقرار رهيو. ٻيو، ميٿيلين بلو هموار عضلي جي خلين مان مقدار ۽ وقت تي دارومدار رکندڙ سپر آڪسائيڊ جي پيداوار ڪرائي، جيڪا سائٽوڪروم c جي ريڊڪشن ذريعي ماپي وئي. ٽيون، سپر آڪسائيڊ ڊسميوٽيز روڪ کي مڪمل طور ٿيڻ نه ڏنو، جڏهن ته ڪيٽاليز ائين نه ڪيو. اهو ان تجرباتي نظام ۾ هائيڊروجن پيرو آڪسائيڊ بدران سپر آڪسائيڊ کي سڌو ذميوار ڪيميائي جزو قرار ڏيڻ ڏانهن اشارو ڪري ٿو.
تجربي جي گڏيل ڪلچر واري صورت بيان ڪرڻ جهڙي آهي، ڇو ته اها ڏيکاري ٿي ته اثر ڪهڙي جاءِ تي ٿئي ٿو. ڪور سلپن تي موجود اينڊوٿيليل خلين کي ٿوري وقت لاءِ هموار عضلي جي خلين سان گڏ ڪلچر ڪيو ويو، تنهن ڪري بنيادي حالت ۾ آزاد ٿيل اينڊوٿيليل عنصر هموار عضلي جي سائڪلڪ GMP کي ٽي کان اٺ ڀيرا وڌايو. ٻنهي مان ڪنهن به حصي کي اڳواٽ ميٿيلين بلو سان عمل هيٺ آڻڻ ان سگنل کي گهٽايو، ۽ سپر آڪسائيڊ ڊسميوٽيز اينڊوٿيليل حصي تي اڳواٽ ڪيل عمل جي اثر کي جزوي طور واپس موٽايو. ٻين لفظن ۾، ميٿيلين بلو کي لازمي طور هموار عضلي جي سگنل سڃاڻيندڙ خليي اندر عمل ڪرڻ جي ضرورت ناهي. اهو رستي ۾ پيغام کڻي ويندڙ ماليڪيول کي ختم ڪري سگنل گهٽائي سگهي ٿو. ميٿيلين بلو جي تحقيق پڙهڻ واري رهنمائي هن کي هڪ عام اصول سمجهي ٿي: ماليڪيولي هدف جو نالو ڏيڻ کان اڳ اهو حصو ڄاڻايو، جتي مداخلت ڪئي وئي هئي.
هن کي NOS جي روڪ چوڻ غلط ٿيندو. ڏيندڙ مرڪبن جي ڪم ڪرڻ لاءِ سنٿيز جي ڪنهن مرحلي جي ضرورت نه هئي، تڏهن به سگنل گهٽجي ويو.
ڪڙي 4: سڃاڻيندڙ پاڻ گهٽ ردعمل ڏيکاري ٿو
حل پذير گوانائليٽ سائڪليز تي سڌا اثر موجود آهن، پر ڪنسنٽريشن اهم آهي. مٿي ڄاڻايل خالص ڪيل اينزائمن جي ڀيٽ ۾، نائٽرڪ آڪسائيڊ سان متحرڪ ڪيل سائڪليز جي اڌ سرگرمي روڪڻ لاءِ اٽڪل 60 مائڪرومولر ميٿيلين بلو گهربل هو، جڏهن ته NOS جي اڌ سرگرمي لڳ ڀڳ 5 کان 9 مائڪرومولر تي رڪجي ٿي. 1 ملي مولر به مڪمل روڪ پيدا نه ڪئي؛ وڌ ۾ وڌ روڪ جزوي ئي رهي. اها لڳ ڀڳ ڇهه کان يارهن ڀيرا فرق آهي. تنهن ڪري گهٽ مائڪرومولر ڪنسنٽريشن تي ڪيل خليي جي تجربي ۾ سائڪلڪ GMP جي گهٽتائيءَ کي، رڳو سائڪلڪ GMP جي انگ جي بنياد تي، سائڪليز جي چونڊيل روڪ نٿو چئي سگهجي.
هڪ پوءِ واري ريڊاڪس مطالعي ٻي احتياط به شامل ڪئي: ميٿيلين بلو نائٽرڪ آڪسائيڊ سان فعال ڪيل سائڪليز کي اهڙي طريقي سان غيرفعال ڪيو، جيڪو هيم جي لوهه جي هوا سان ٿيندڙ سادي آڪسائيڊيشن کان مختلف هو. تنهن ڪري سڃاڻيندڙ متاثر ٿي سگهي ٿو، پر ان جي ڪيميائي وضاحت اڃا طئي ٿيل ناهي. ڪنسنٽريشنن جو فرق ٻڌائي ٿو ته گهٽ مائڪرومولر واسطي تي پهرين سپر آڪسائيڊ ۽ NOS جي اثرن کي جاچي رد ڪرڻ گهرجي. فاسفوڊائي ايسٽريز جو ڪنٽرول به هتي لاڳو ٿئي ٿو. جيستائين ٽٽڻ جي عمل کي ماپيو يا روڪيو نه ويو هجي، سائڪلڪ GMP جي گهٽ گڏ ٿيڻ سان گهٽ ٺهڻ، وڌيڪ تيز ٽٽڻ، يا ٻئي امڪان ٺهڪن ٿا.
هي ڳالهه رت جي دٻاءَ بابت هڪ ئي دعويٰ ۾ ڇو نٿي سميٽي سگهجي
هر ڪڙيءَ کي هڪ مختلف نظام ۾ ثابت ڪيو ويو. ميڪروفاج جي ٽرانسڪرپشن، هائپوٿيليمس جي اينزائم سرگرمي ناهي. لائپوپولي سيڪرائيڊ کان پوءِ هائپوٿيليمس جي سرگرمي، آرام واري اينڊوٿيليل ٽون ناهي. گڏيل ڪلچر ۾ بنيادي حالت دوران آزاد ٿيل اينڊوٿيليل عنصر، ايگونسٽ سان متحرڪ ڪيل رڳن جي ڦهلاءَ جهڙو ناهي. 10 مائڪرومولر ميٿيلين بلو سان ڪلچر ۾ موجود ڦڦڙن واري شريان جا خليي، انسان جي رت جي گردش نه آهن. انهن سڀني کي گڏ ڪري اهڙو بيان ڏيڻ ته ميٿيلين بلو نائٽرڪ آڪسائيڊ کي روڪي رت جو دٻاءُ وڌائي ٿو، بلڪل اهي فرق ختم ڪري ڇڏي ٿو، جن کي برقرار رکڻ لاءِ ڪنٽرول جوڙيا ويا هئا.
ٽي جاچون ڳالهه کي درست حدن ۾ رکن ٿيون. پهريون، آئسوفارم ڄاڻايو: آرام واري رڳن جي ٽون لاءِ eNOS، تحريڪ سان پيدا ٿيل سوزشي وهڪري لاءِ iNOS، ۽ نيورونل توڙي خالص ڪيل اينزائم جي ڪجهه حالتن لاءِ nNOS. ٻيو، نائٽرڪ آڪسائيڊ جي سگنل پهچڻ جو طريقو ڄاڻايو: جسم اندر ٺهڻ، بنيادي اينڊوٿيليل آزاد ٿيڻ، يا CYSNO، نائٽروپروسائيڊ يا MPANO جهڙو ڪو مخصوص ڏيندڙ مرڪب؛ ڇو ته مستحڪم ڏيندڙ مرڪب ميٿيلين بلو جي اثر جي مزاحمت ڪئي، جڏهن ته آسانيءَ سان بدلجندڙ مرڪبن نه ڪئي. ٽيون، ڪنسنٽريشن ۽ بحاليءَ وارو ڪنٽرول ڄاڻايو: سپر آڪسائيڊ ڊسميوٽيز سان بحالي سپر آڪسائيڊ جي ڪردار ڏانهن اشارو ڪري ٿي؛ ڪيٽاليز جي ناڪامي ان تجرباتي نظام ۾ هائيڊروجن پيرو آڪسائيڊ جي ڪردار جي خلاف دليل آهي؛ زينٿين آڪسائيڊيز سان ساڳيو اثر پيدا ٿيڻ ڏيکاري ٿو ته اهو عمل اثر لاءِ ڪافي آهي؛ ۽ خالص ڪيل اينزائم جون جاچون سڌن ڪيٽاليسس اثرن کي رستي ۾ ٿيندڙ نقصانن کان الڳ ڪن ٿيون.
مختصر گڏيل نتيجو هي آهي. ميٿيلين بلو کي چونڊيل سائڪليز روڪيندڙ بدران، نائٽرڪ آڪسائيڊ کان سائڪلڪ GMP تائين سگنل رسائيءَ ۾ ڪيترن هنڌن تي خلل وجهندڙ مادو سمجهڻ وڌيڪ مناسب آهي. تجرباتي نظام ۽ ڪنسنٽريشن موجب، اهو iNOS جي ٽرانسڪرپشن عنصرن جي ڳنڍجڻ کي گهٽائي سگهي ٿو، NOS اينزائمن کي سڌو روڪي سگهي ٿو، سپر آڪسائيڊ جي پيداوار وسيلي نائٽرڪ آڪسائيڊ جي دستيابي گهٽائي سگهي ٿو، ۽ نائٽرڪ آڪسائيڊ سان فعال ڪيل سائڪليز جي ڪم ۾ خرابي پيدا ڪري سگهي ٿو. رت جي رڳن جي مطالعي ۾ سائڪلڪ GMP سگنل رسائيءَ جو ڪردار ۽ خلين جي جاچن ۾ استعمال ٿيندڙ نائٽرڪ آڪسائيڊ ڏيندڙ مرڪبن جي ڀيٽ هر هڪ انهن مان هڪ شاخ کي وڌيڪ تفصيل سان بيان ڪري ٿو، ۽ ريڊاڪس اثرن کي اينزائم جي اثرن کان الڳ ڪرڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ طريقا سمجهائين ٿا ته هن علمي ادب ۾ سپر آڪسائيڊ ڊسميوٽيز، ڪيٽاليز ۽ هڪ مستحڪم ڏيندڙ مرڪب وارو ڪنٽرول ايترو گهڻو ڇو نظر اچي ٿو.
ميٿيلين بلو کان پوءِ سائڪلڪ GMP جي گهٽ مقدار هڪ ٽٽل زنجير جي نشاندهي ڪري ٿي. رڳو ڪنٽرول ٻڌائين ٿا ته ڪهڙي ڪڙي ٽٽي.