ميٿيلين بلو ۽ آٽوفيجي: AMPK، mTOR، ۽ نيورونن تي تجربا

تصور ڪريو ته توهان خليات تي هڪ تجربو ڪريو ٿا، ميٿيلين بلو شامل ڪريو ٿا، ۽ پنهنجي بلوٽ تي LC3-II نالي پروٽين جي پٽي وڌيڪ گهاٽي ٿيندي ڏسو ٿا. اهو اعلان ڪرڻ ۽ اڳتي وڌڻ دلڪش لڳي سگهي ٿو ته هي مرڪب ”آٽوفيجي وڌائي ٿو“. پر اهو نتيجو ڪڍڻ وقت کان اڳ آهي. وڌيڪ گهاٽي LC3-II پٽي جو مطلب ٿي سگهي ٿو ته خليه صفائي لاءِ وڌيڪ ننڍيون جھليءَ واريون ٿيلهڙيون ٺاهي رهيو آهي، يا اهو به ٿي سگهي ٿو ته اهي ٿيلهڙيون ان ڪري گڏ ٿي رهيون آهن جو مواد جي نيڪالي وارو مرحلو رڪجي ويو آهي. اهي ٻئي تشريحون ابتڙ رخن ڏانهن اشارو ڪن ٿيون، ۽ ميٿيلين بلو بابت نيورونن واري تحقيقي ادب ۾ ٻنهي قسمن جي شاهديءَ جا مثال موجود آهن. هي مضمون هر جاچ طريقي کي الڳ ڏسي بيان ڪري ٿو ته اصل ۾ ڇا ماپيو ويو هو.

ميڪروآٽوفيجي، جنهن صورت جو هتي اڀياس ڪيو ويو آهي، خليه اندر مواد کي وڏي پيماني تي ٻيهر استعمال لائق بڻائڻ جو عمل آهي. فيگوفور نالي هڪ جھليءَ واري ٿيلهي پراڻن ۽ خراب ٿيل پروٽينن ۽ خلوي عضيات جي چوڌاري وڌي ٿي، بند ٿي آٽوفيگوسوم بڻجي ٿي، لائيسوسوم سان ملي ٿي، ۽ ان جو اندروني مواد ٽٽي ٻيهر استعمال لاءِ آزاد ٿئي ٿو. نيورون هن معمول تي ڀاڙين ٿا، ڇاڪاڻ ته اهي ورهائجن نٿا ۽ ورهائجڻ وسيلي خراب ٿيل حصن جو تناسب گهٽائي نٿا سگهن. جڏهن ٻيهر استعمال وارو عمل رڪجي ٿو، تڏهن فضلو گڏ ٿئي ٿو. جڏهن اهو هلي ٿو، تڏهن خليه دٻاءَ واري حالت ۾ تعمير لاءِ بنيادي جزا واپس حاصل ڪري ٿو.

هپوڪيمپس جي هڪ تجربي ڇا ڏيکاريو

آٽوفيجي شروع ٿيڻ بابت بنيادي اڀياس ۾ ڪوئي جي هپوڪيمپس جا HT22 خليات استعمال ڪيا ويا، جن کي 24 ڪلاڪن تائين سيرم کان محروم رکي دٻاءَ ۾ آندو ويو. هيءَ حالت واڌ جا عامل ۽ پرورش ڏيندڙ سگنل هٽائي ٿي ۽ اپوپٽوسس توڙي آٽوفيجي ٻنهي کي شروع ڪري ٿي. محققن ٻڌايو ته ميٿيلين بلو مقدار تي دارومدار رکندڙ نموني خلوي موت گهٽايو، ۽ هن تحفظ سان گڏ ميڪروآٽوفيجي جا نشان به ظاهر ٿيا.

نشانن جو سلسلو مخصوص هو. لڳ ڀڳ 20 nM ميٿيلين بلو کان شروع ٿي، پکڙيل LC3B رنگجڻ ٻيهر ترتيب وٺي مرڪزي جسم جي چوڌاري نقطن ۾ گڏ ٿيو، جڏهن ته LC3-I ۽ LC3-II جو سڀ کان مضبوط ردعمل لڳ ڀڳ 1 μM تي هو. LC3B-I ۽ LC3B-II ٻئي مقدار ۽ وقت تي دارومدار رکندڙ نموني وڌيا. اهم ڳالهه اها آهي ته ٽيم هڪ جامد LC3 بلوٽ کان هڪ قدم اڳتي وئي. هنن 10 μM ڪلوروڪوئين شامل ڪيو، جيڪو لائيسوسوم وسيلي صفائي روڪي ٿو، ۽ ميٿيلين بلو ڏنل خليات ۾ وڌيڪ LC3-II سان گڏ مستحڪم ٿيل p62 مليو. هي نمونو رڳو گڏ ٿيڻ بدران لائيسوسوم تي دارومدار رکندڙ ٽرن اوور، يعني مواد جي ٽٽڻ ۽ نئين مواد سان مٽجڻ، جي حمايت ڪري ٿو. هنن اهو به ڏيکاريو ته ڪلوروڪوئين اپوپٽوسس خلاف اثر کي جزوي طور واپس موٽايو، جيڪو هن ماڊل ۾ تحفظ کي آٽوفيجي ۽ لائيسوسوم واري رستي سان ڳنڍي ٿو.

سگنلنگ وارو نتيجو اهو حصو آهي، جيڪو سڀ کان وڌيڪ غلط نموني نقل ڪيو وڃي ٿو. AMPK سگنلنگ، جنهن کي فاسفوريليٽ ٿيل AMPK ۽ ان جي اڳتي واري هدف، فاسفوريليٽ ٿيل ACC، وسيلي ماپيو ويو، 12 ۽ 24 ڪلاڪن تي مقدار تي دارومدار رکندڙ نموني وڌي. AMPK روڪيندڙ Compound C، جيڪو آخري 4 ڪلاڪن دوران 20 μM تي ڏنو ويو، ACC جي فاسفوريليشن ۽ LC3 جي چالو ٿيڻ ٻنهي کي گهٽايو. ان جي ابتڙ، فاسفوريليٽ ٿيل mTOR ۾ ڪو ماپجڻ جوڳو دٻاءُ نظر نه آيو. تنهنڪري دٻاءَ هيٺ هپوڪيمپس جي خليات ۾ نتيجو AMPK سان ڳنڍيل انڊڪشن هو، جيڪو ظاهري طور mTOR کان آزاد رستي وسيلي ٿيو. ساڳيو نمونو جيئري ڪوئن ۾ به ظاهر ٿيو، جتي ميٿيلين بلو ڏيڻ سان ڪورٽيڪس ۽ هپوڪيمپس ۾ ميڪروآٽوفيجي جا نشان پيدا ٿيا.

انڊڪشن مڪمل ٿيل فلڪس نه آهي

هتي تصوراتي فرق سڀ کان وڌيڪ اهم آهي. انڊڪشن جو مطلب آهي ته عمل جي شروعاتي مشينري وڌيڪ آٽوفيگوسوم ٺاهي ٿي. فلڪس جو مطلب آهي ته اندر ورتل مواد سڄو رستو طئي ڪري ٿو: الڳ بند ٿيڻ، پختو ٿيڻ، لائيسوسوم سان ملڻ، ٽٽڻ، ۽ ٻيهر استعمال ٿيڻ. LC3-II ۾ هر واڌ رڳو انڊڪشن جي دعويٰ آهي، جيستائين فلڪس جي جاچ سفر جي باقي حصي جي تصديق نه ڪري.

فلڪس جي معياري جاچ LC3-II کي لائيسوسوم جي مختصر روڪ، جهڙوڪ بيفيلومائيسن A1 يا ڪلوروڪوئين، سان ۽ ان کان سواءِ ماپي ٿي. جيڪڏهن ڏنل مادو واقعي پيداوار تيز ڪري ٿو، ته ٽٽڻ کي روڪڻ سان LC3-II اڃا وڌيڪ وڌڻ گهرجي. گڏيل mCherry-GFP-LC3 رپورٽر هڪ ٻيو رخ ڏيکاري ٿو: بناوتون لائيسوسوم سان ملڻ کان اڳ پيليون چمڪن ٿيون، ۽ تيزاب GFP سگنل وسائڻ کان پوءِ رڳو ڳاڙهيون چمڪن ٿيون؛ تنهنڪري رڳو ڳاڙهن نقطن جو وڌڻ تيزابي آٽولائيسوسومن ڏانهن اڳتي وڌڻ جي حمايت ڪري ٿو. p62 پروٽين جو گهٽجڻ اندر ورتل مواد جي ٽرن اوور جي تصديق ۾ مدد ڏئي سگهي ٿو، پر اها احتياط ضروري آهي ته p62 جي ٽرانسڪرپشن پاڻ به دٻاءَ تي ردعمل ڏيکاري ٿي ۽ ان کي mRNA جي سطح تي جاچڻ گهرجي.

هيٺ ڏنل جاچ فهرست هن تحقيقي ادب ۾ استعمال ٿيل هر جاچ طريقي کي ان شيءِ سان ڳنڍي ٿي، جيڪا اهو ماپي ٿو، ۽ ان سان به، جيڪا اهو اڪيلو ثابت نٿو ڪري سگهي. پڙهندڙ ان کي ميڪروآٽوفيجي بابت ڪنهن به ايندڙ دعويٰ تي ٻيهر استعمال ڪري سگهن ٿا، جن ۾ روزي ۽ ڊگهي عمر بابت دليل به شامل آهن، جيڪي انهن نشانن کي استعمال ڪن ٿا.

لفظن جي هڪ اهڙي ڦندي تي ڌيان ڏيو، جنهن کان هيءَ جدول بچائي ٿي. فاسفوريليٽ ٿيل ACC اها صورت آهي، جنهن جي اينزائيمي سرگرمي روڪيل آهي. ان جي واڌ AMPK جو اڳتي وارو اثر ڏيکاري ٿي، ACC جي چالو ٿيڻ نه.

جملي ”ميڪروآٽوفيجي کي روڪڻ نيورونن جو تحفظ ختم ڪري ڇڏيو“ لاءِ به ساڳي درستگي ضروري آهي. HT22 ماڊل ۾ ان جو مطلب آهي ته آٽوفيجي ۽ لائيسوسوم واري رستي ۾ مداخلت ڪرڻ سان سيرم جي محروميءَ هيٺ ميٿيلين بلو جو زنده رهڻ وارو فائدو ختم ٿيو. اهو ان تجربي واري ٿانوَ ۾ آٽوفيجي جي ضروري يا مددگار هجڻ جي حمايت ڪري ٿو. اهو ثابت نٿو ڪري ته آٽوفيجي هن مرڪب جو واحد حفاظتي طريقو آهي، نه ئي اهو ثابت ڪري ٿو ته ڪلوروڪوئين رڳو آٽوفيجي وسيلي ڪم ڪري ٿو؛ سبب ۽ نتيجي واري دعويٰ وڌيڪ مضبوط ڪرڻ لاءِ ATG5، ATG7، يا ULK1 ۾ جينياتي مداخلت گهربل هوندي.

ساڳي مشينري ڏانهن ٻه رستا

هڪ سادو نقشو مدد ڪري ٿو. توانائيءَ جو دٻاءُ AMPK وڌائي ٿو، AMPK، ULK1 ڪمپليڪس کي چالو ڪري ٿو، ۽ آٽوفيجي شروع ٿئي ٿي. واڌ جا عامل ۽ غذائي جزا mTORC1 وڌائين ٿا، mTORC1، ULK1 کي روڪي ٿو، ۽ آٽوفيجي بند رهي ٿي. ULK1 کان اڳتي، Beclin-1 ۽ VPS34 ڪمپليڪس فيگوفور جي ٺهڻ جي شروعات ڪري ٿو، LC3-I لپڊيشن وسيلي LC3-II بڻجي ٿو، آٽوفيگوسوم بند ٿئي ٿو، لائيسوسوم سان ملي ٿو، ۽ اندر ورتل مواد ٽٽي ٿو، جڏهن ته p62 جو ٽرن اوور ٿيندو رهي ٿو.

خاڪو هن نقشي تي ميٿيلين بلو جو هر نتيجو پنهنجي جاءِ تي رکي ٿو: هپوڪيمپس وارو نتيجو AMPK شاخ جي ڀرسان، ۽ اڳواڻ خليات وارو نتيجو mTOR شاخ جي ڀرسان.

هيءَ ترتيب Xie جي ٻئي اڀياس سان ظاهري اختلاف کي واضح ڪري ٿي. ورهائجي وڌندڙ چوهي جي عصبي اڳواڻ خليات ۾، هڪ الڳ تجربي ڏٺو ته 5 μM ميٿيلين بلو وڌڻ کي روڪيو ۽ غير فعال حالت کي هٿي ڏني؛ Ki67 مثبت خليات 1 ۽ 3 ڏينهن تي گهٽيا، جڏهن ته نيورونن ڏانهن اڳواٽ طئي ٿيل تخصيص برقرار رهي. اتي عمل جو طريقو دٻيل mTOR سگنلنگ وسيلي هليو: ڪل mTOR ۽ فاسفوريليٽ ٿيل mTOR گهٽيا، ساڻس گڏ p70S6K ۽ 4EBP1 جي اظهار ۾ گهٽتائي ٿي، ۽ سائيڪلن E1، B1، D1، ۽ D2 جو اظهار به گهٽيو. غالب ظاهري حالت اڳواڻ خليات جو غير فعال ٿيڻ هئي، جنهن کي مصنفن خلوي پيرائپ ۾ دير سان ڳنڍيو، نه ڪي دٻاءَ هيٺ هپوڪيمپس جي خليات کي بچائڻ سان.

ٻنهي مقالن ۾ ڪو تضاد ناهي. AMPK ۽ mTOR حالتن موجب سگنلن کي گڏ ڪندڙ نظام آهن، مستقل سوئچ نه. دٻاءَ هيٺ نيورون جهڙو خليه، mTOR جي ماپجڻ جوڳي روڪ کان سواءِ AMPK کي فعال ڪري سگهي ٿو، جڏهن ته خلوي ورهاست جي سگنلن سان هلندڙ اڳواڻ خليه ساڳئي مرڪب تي mTOR تي دارومدار رکندڙ واڌ واري مشينري کي سست ڪري ردعمل ڏيکاري سگهي ٿو. خليه جو قسم، دٻاءَ جون حالتون، ڪنسنٽريشن، ۽ ماپ جو وقت طئي ڪن ٿا ته ڪهڙي شاخ غالب رهندي. اهو ئي سبب آهي جو ميٿيلين بلو جا مائٽوڪانڊريائي توانائي ۽ ريڊاڪس اثر به ساڳئي تصوير جو حصو آهن: جيئن نيورونن جي تحفظ جي عملن بابت هڪ جائزو بيان ڪري ٿو، هي مرڪب متبادل اليڪٽران کڻندڙ طور ڪم ڪري ٿو، اينٽي آڪسيڊنٽ ۽ اپوپٽوسس خلاف سگنلنگ کي فعال ڪري ٿو، MAO ۽ NOS کي روڪي ٿو، ۽ نئين ٺهڻ ۽ آٽوفيجي وسيلي مائٽوڪانڊريا جي تجديد سان ڳنڍجي ٿو. آٽوفيجي گهڻن اثرن واري عمل جي هڪ شاخ آهي، سڄي ڪهاڻي نه.

تجربا ڇا نٿا ڏيکارين

سيرم جي محرومي هڪ تجربي واري ٿانوَ ۾ پرورش ۽ ميٽابولزم سان لاڳاپيل دٻاءَ جو ماڊل ٺاهي ٿي. اها سڄي جاندار جي روزي جو ماڊل نٿي ٺاهي: گلوڪوز، امينو ايسڊ، ۽ لوڻ بنيادي ڪلچر ميڊيم ۾ موجود رهن ٿا، ۽ کاڌو کائڻ جو ڪو رويو موجود ناهي. ڪلچر ۾ 20 nM کان 5 μM تائين ڪنسنٽريشنن کي حساب وسيلي انساني مقدارن ۾ بدلائي نٿو سگهجي، ڇاڪاڻ ته جذب، پروٽين سان ڳنڍجڻ، ريڊاڪس حالت، ميٽابولزم، بافتن ۾ گڏ ٿيڻ، ۽ واسطي جو وقت سڀ مختلف آهن.

ڪو به انساني آزمائشي اڀياس مريضن ۾ ميٿيلين بلو سان پيدا ٿيل آٽوفيجي فلڪس ڏيکارڻ لاءِ ترتيب نه ڏنو ويو آهي. عمل جي طريقن بابت شاهدي اڃا خلوي، جسم کان ٻاهر ڪڍيل بافتن تي، ۽ جانورن تي ٿيل ڪم تائين محدود آهي، ۽ جائزا اڃا انهن نتيجن کي عملي انساني استعمال تائين آڻڻ واري شاهديءَ کي ابتدائي قرار ڏين ٿا. تنهنڪري اهي اڀياس نٿا ڏيکارين ته ميٿيلين بلو روزي جا اثر ورجائي ٿو، آٽوفيجي وسيلي انساني عمر وڌائي ٿو، يا انساني دماغ ۾ آٽوفيجي فلڪس مڪمل ڪري ٿو. روزي جهڙا اثر ۽ ڊگهي عمر بابت دعوائن کي پنهنجي ڪلينڪل شاهدي گهرجي، ۽ ٻين مقصدن لاءِ ميٿيلين بلو جون انساني آزمائشون رڳو لاڳاپي سبب آٽوفيجي جون آزمائشون نٿيون بڻجن. غذائي دٻاءَ ۽ ڊگهي عمر جي ماڊلن بابت تحقيق هن حد کي ذهن ۾ رکي پڙهڻ گهرجي.

توهان جيڪو اڳيون مقالو پڙهو، ان تي هيءَ جاچ فهرست ترتيب سان لاڳو ڪريو. پهرين پڇو ته ڪهڙي شاخ بدلي: AMPK، mTOR، يا ڪا به نه. پوءِ پڇو ته LC3 واري نتيجي سان گڏ فلڪس جي جاچ به هئي يا اهو اڪيلو بيٺل آهي. ان کان پوءِ ڏسو ته رستو روڪڻ سان فائدو ختم ٿيو يا نه، ۽ ڪهڙي طريقي سان. جيڪو اڀياس انهن ٽنهي سوالن جا جواب ڏئي ٿو، تنهن عمل جي طريقي بابت هڪ مضبوط دعويٰ جو بنياد حاصل ڪيو آهي. جيڪو رڳو پهرئين جو جواب ڏئي ٿو، تنهن رڳو اجازت وارو سگنل ڏيکاريو آهي، ۽ سفر جو باقي حصو اڃا اڻ چٽيل آهي.