Спектр поглощения метиленового синего и молярная поглощаемость: справочник с указанием условий

Спектр метиленового синего выглядит простым, пока не возникает необходимость повторно использовать полученное из него число. Одна лаборатория сообщает молярный коэффициент экстинкции около 82 000. Другая сообщает 67 000. Третья — более 100 000. Все три значения могут быть корректным описанием собственных измерений, и ни одно из них не является универсальной константой для красителя.

Путаница возникает из-за смешения двух различных понятий. Оптическая плотность — это измерение, выполненное для конкретного раствора в конкретной кювете. Молярная поглощаемость, часто обозначаемая как epsilon, — это параметр модели данного раствора. Когда метиленовый синий изменяет состояние ассоциации, модель изменяется, поэтому изменяется и параметр. Полезная привычка — рассматривать каждый коэффициент как значение с метаданными: длина волны, растворитель, pH или буфер, температура, диапазон концентраций и длина оптического пути должны сопровождать число.

Полоса мономера в разбавленной воде

В разбавленном водном растворе доминирующая полоса катиона метиленового синего находится около 664–665 нм, обычно указываемая в диапазоне 664–668 нм для различных приборов и вариантов калибровки. Эта полоса является правильным выбором для количественного определения, когда раствор достаточно разбавлен и большая часть красителя находится в мономерной форме.

Три значения из литературы показывают, почему условия важнее, чем само число. Исследователи глин, которые поддерживали концентрацию водных образцов ниже примерно 7 микромоляр в кюветах 1 см, сообщили epsilon около 82 000 M-1 cm-1 при 665 нм. Это значение хорошо документировано как эмпирический наклон калибровки для очень разбавленных водных образцов. Более поздняя первичная калибровка в деионизированной воде, использовавшая диапазон 2,34–37,52 микромоляр и длину пути 1 см, дала около 67 100 M-1 cm-1 при 665 нм для общего содержания красителя. Более низкий результат является ожидаемым, а не противоречивым, поскольку верхняя половина этого диапазона калибровки уже содержит заметное количество димера. Третье значение, около 73 460 M-1 cm-1 при 664 нм, получено в работе при pH 6,86 и 293 K, где наблюдаемый спектр был разделён на компоненты мономера и димера, как описано в недавнем критическом обзоре фот физики метиленового синего. Это число представляет собой деконволюированную компоненту мономера, а не прямой наклон зависимости оптической плотности от общего содержания красителя.

Практический вывод: выбирайте коэффициент, условия которого соответствуют вашим образцам, или выполняйте собственную калибровку. Не переносите значение 82 000 в анализ 30 микромолярного фосфатного буфера и не предполагайте, что линейность сохраняется.

Плечо на коротких длинах волн представляет собой смесь

При увеличении концентрации плечо около 600–615 нм становится более выраженным относительно пика 664 нм. Современные исследования обычно располагают вклад H-типа димера около 605–610 нм. Глобальный спектральный анализ метиленового синего в воде показывает максимум димера при 607 нм и максимум более высокого агрегата при 600 нм, а также резонансные компоненты мономера при 664 и 650 нм. Полный текст доступен через открытую запись PMID 33251415.

Это плечо не следует обозначать как чистое поглощение димера. Колебательная структура мономера также вносит вклад в этот же диапазон, поэтому измеренная высота представляет собой суперпозицию. Один глобальный анализ показал, что модель мономер + димер не описывает весь диапазон от 1,1 микромоляр до 3,4 миллимоляр, тогда как добавление тетрамера давало наилучшее соответствие, причём сигнал тетрамера уже обнаруживался ниже 34 микромоляр. Рассчитанные значения компонентов были высокими: около 107 800 M-1 cm-1 при 664 нм для основной компоненты мономера, около 101 400 для димера при 607 нм и около 138 500 для тетрамера при 600 нм в нефуференной деионизированной воде с хлоридом натрия от 0 до 0,15 M и температурами от 282 до 333 K. Это части, выделенные моделью, поэтому их нельзя заменять эмпирическим наклоном закона Бера–Ламберта.

Сила димеризации была количественно определена напрямую. При pH 6,86 и 293 K одно исследование получило константу димеризации около 3 900 M-1. Такой порядок величины объясняет, почему рабочий раствор 5 микромоляр ведёт себя почти линейно, а исходный раствор 50 микромоляр — уже нет. Полезная проверка при разработке метода — соотношение оптической плотности около 610 нм к оптической плотности около 665 нм. Когда это соотношение растёт с концентрацией, epsilon при 664 нм больше не описывает один неизменный вид.

В диапазоне концентраций, где доминирует одна пара взаимопревращающихся форм, спектры могут иметь изобестическую точку, экспериментально около 625 нм в водных сериях. Чистая неподвижная точка согласуется с наличием двух доминирующих видов. Когда точка смещается или исчезает при росте концентрации, это следует рассматривать как предупреждение о появлении более высоких агрегатов или изменении равновесий, а не как ошибку прибора.

Растворитель, pH и температура изменяют спектр

Вода способствует ассоциации. Добавление диметилсульфоксида подавляет димеризацию, смещает максимумы поглощения и флуоресценции к более длинным волнам и увеличивает квантовый выход флуоресценции примерно в четыре раза согласно исследованию растворителей для метиленового синего в смесях воды и DMSO, индексированному как PMID 30933781. Эта работа рассматривает водные спектры как равновесие мономер–димер с поглощением мономера около 650–670 нм и поглощением димера около 580–615 нм и выводит константы димеризации из спектров при 293,15 K.

Спирты изменяют положение и кажущуюся интенсивность, но не устраняют агрегацию. В одном первичном сравнении при 31,3 микромоляр и комнатной температуре, опубликованном в исследовании растворителей метиленового синего, максимум в длинноволновой области составлял 665 нм в воде, но 655 нм в метаноле, при этом кажущиеся значения для общего раствора были около 37 100 в воде и 60 800 в метаноле. Отдельная валидация в абсолютном этаноле при 298 K дала максимум 655 нм с epsilon около 68 000.

Обычные изменения pH изменяют спектр меньше, чем предполагают многие протоколы. В указанном выше критическом обзоре сообщается, что примерно от pH 2 до pH 12 максимум оставался около 665 нм с небольшими изменениями интенсивности до pH 11. Тип буфера и ионная сила могут смещать результаты не меньше, чем номинальный pH, поэтому следует фиксировать фактический буфер и соли, а не только показание pH-метра. Сильная кислота или сильная щёлочь представляют отдельный случай, поскольку краситель может подвергаться химическому изменению, а не обратимой ассоциации. Температура и соли также изменяют равновесие, поэтому исследование воды 2020 года специально варьировало оба параметра.

Измерение, при котором значение остаётся действительным

Количественная работа основана на соотношении Бера–Ламберта: оптическая плотность равна epsilon, умноженному на концентрацию и длину оптического пути, а также на подтверждении того, что линейный диапазон действительно сохраняется в ваших условиях.

Используйте кювету 1 см для работы с низкими микромолярными концентрациями. При epsilon около 82 000 концентрация 5 микромоляр даёт оптическую плотность около 0,41, а 10 микромоляр — около 0,82. Для измерения, ориентированного на мономер в чистой воде, безопаснее оставаться около или ниже примерно 5–7 микромоляр, чем калиброваться глубоко в диапазоне десятков микромоляр. Для концентрированных исходных растворов уменьшайте длину оптического пути вместо работы с оптической плотностью значительно выше 1.

Используйте холостой образец с идентичной матрицей: тот же класс воды, ту же долю сорастворителя, тот же буфер и соли, но без красителя. Готовьте калибровочные растворы в той же матрице при той же температуре. На этапе разработки сканируйте полный видимый диапазон, желательно примерно 550–750 нм, вместо измерения одной длины волны. Отслеживайте форму, а не только высоту сигнала. Если последовательное разбавление изменяет нормализованную форму спектра, система зависит от концентрации с химической точки зрения. Стабильный максимум и стабильное соотношение 610 к 665 нм являются более сильным свидетельством приемлемого диапазона, чем только высокий R-квадрат.

Документируйте форму реагента. Коммерческий материал может представлять собой безводный хлорид метилтиониния или гидрат, например тригидрат, поэтому молярная масса, используемая для расчёта исходного раствора, должна соответствовать фактической упаковке. Этот шаг сам по себе объясняет часть расхождений между номинальными молярными концентрациями в разных лабораториях. Такая же дисциплина применяется, когда результаты используются для количественных расчётов анализа, когда спектры поддерживают проверки стабильности состава или когда профили примесей требуют проверки чистоты и спецификаций.

Сводка с указанием условий

Используйте эту таблицу как исходный шаблон для лабораторной записи, а не как источник взаимозаменяемых констант.

Таким образом, длина волны поглощения метиленового синего — это короткий ответ с длинной сноской. Указывайте пик, который вы измерили, в растворе, который вы измерили, при концентрации, которую вы измерили. Эта привычка не позволяет одному разбавленному водному значению около 664 нм превратиться в ложную универсальную константу.