Означает ли большее потребление кислорода больше АТФ? Уроки исследований метиленового синего

Изолированная митохондрия находится в камере с топливом, но без АДФ. Она медленно потребляет кислород. Добавьте АДФ — и потребление кислорода возрастает в несколько раз. Подождите, пока АДФ закончится, и потребление кислорода снова снизится. Топливо никогда не менялось. Изменился только спрос на АТФ.

Эта небольшая последовательность содержит всё различие, которому посвящена эта статья. Потребление кислорода измеряет, насколько быстро электроны проходят через дыхательную цепь к кислороду. Производство АТФ измеряет, какая часть этого потока захватывается в форме используемой энергии. Эти два процесса имеют общий промежуточный этап — протонный градиент через внутреннюю мембрану митохондрий, и всё, что изменяет степень связи градиента с синтезом АТФ, может сдвигать два конечных показателя в разных направлениях. Метиленовый синий полезен для понимания этого процесса, потому что в разных условиях он демонстрировал оба варианта: повышение использования кислорода вместе с АТФ в некоторых препаратах и повышение использования кислорода при неизменном или сниженном уровне АТФ в других.

Читатели, которые хотят сначала получить более широкое представление о системе передачи электронов, могут начать с того, как метиленовый синий переносит электроны через дыхательную цепь, а те, кто хочет ознакомиться с терминологией ранних экспериментов по измерению кислорода, могут прочитать о том, что фактически показали первые измерения дыхания.

Дыхание, АТФ и градиент между ними

Электроны от NADH и FADH2 поступают в цепь через комплексы I и II, проходят через комплекс III к цитохрому c, затем через комплекс IV к кислороду. Энергия, высвобождаемая в комплексах I, III и IV, перекачивает протоны из матрикса в межмембранное пространство. Это разделение заряда и кислотности создаёт протонодвижущую силу, а её электрическая часть — мембранный потенциал — обычно является доминирующей.

АТФ-синтаза позволяет протонам возвращаться в матрикс и использует высвобождаемую энергию для соединения АДФ и фосфата в АТФ. Таким образом, цепь выглядит так:

потребление кислорода, затем перекачивание протонов, затем градиент, затем синтез АТФ.

Проблема в том, что протоны могут возвращаться другими путями. Любое возвращение, обходящее АТФ-синтазу, является утечкой протонов. Утечка заставляет дыхательную цепь снова перекачивать те же протоны, чтобы поддерживать мембранный потенциал, что расходует больше кислорода без образования большего количества АТФ. Достаточно сильная утечка является разобщением: использование кислорода возрастает, а уровень АТФ остаётся неизменным или снижается, при этом потерянная энергия выделяется в виде тепла.

Состояния 3, 4 и коэффициент контроля дыхания

Классическая терминология происходит из исследований изолированных митохондрий. Состояние 3 — это дыхание при наличии субстрата и АДФ: АТФ-синтаза снижает градиент, мембранный потенциал падает, цепь ускоряется для его восстановления, а потребление кислорода высокое, поскольку производится АТФ. Состояние 4 — это дыхание после того, как АДФ закончился: АТФ-синтаза бездействует, градиент повышается, высокий мембранный потенциал препятствует дальнейшей перекачке протонов, а потребление кислорода снижается до уровня, необходимого для компенсации утечки.

Коэффициент контроля дыхания, состояние 3, делённое на состояние 4, таким образом показывает, насколько тесно препарат связан с процессом сопряжения. Высокий коэффициент означает, что АДФ сильно контролирует дыхание. Снижающийся коэффициент при повышении состояния 4 означает, что начинает доминировать утечка. Именно через эту призму становятся понятны результаты с метиленовым синим ниже.

Стоит сохранять одну модель в уме. Высокий мембранный потенциал замедляет цепь. Рассеивание потенциала ускоряет её. Цепь реагирует на то, насколько сложно стало перекачивать протоны, а не напрямую на то, производится ли АТФ.

Когда конечные показатели движутся вместе

Самый ясный пример сопряжения получен в исследовании изолированных митохондрий мозга морских свинок с заблокированными дыхательными комплексами. При концентрации метиленового синего от 100 наномоляр до 1 микромоляра скорость потребления кислорода в состоянии покоя возрастала с глутаматом плюс малатом, сукцинатом или глицерофосфатом в качестве топлива, тогда как стимулированное АДФ дыхание не изменялось. В митохондриях с отравленными комплексами I или III краситель умеренно повышал производство АТФ, восстанавливал мембранный потенциал и улучшал захват кальция. Предполагаемый путь — обходной: краситель принимает электроны выше места блокировки и передаёт их цитохрому c, обходя повреждённый комплекс.

Второй случай сопряжения использует совершенно другой источник АТФ. В исследовании изолированных митохондрий мозга с ингибированием АТФ-синтазы метиленовый синий всё ещё стимулировал дыхание на всех протестированных субстратах. Но синтез АТФ увеличивался только при использовании альфа-кетоглутарата и глутамата — двух субстратов, образующих сукцинил-КоА. При блокировании АТФ-синтазы олигомицином дополнительная АТФ происходила из субстратного фосфорилирования с участием сукцинил-КоА-лигазы в цикле лимонной кислоты, а не из окислительного фосфорилирования. Краситель также восстанавливал мембранный потенциал при одновременном ингибировании комплекса I и АТФ-синтазы. Здесь потребление кислорода и АТФ двигались вместе, но только там, где субстрат позволял использовать второй путь образования АТФ. На сукцинате или малате дыхание увеличивалось без дополнительной АТФ. Один и тот же краситель, одна и та же камера, разное топливо — разный результат.

Когда конечные показатели расходятся

Случаи расхождения столь же опубликованы и столь же показательны. В исследовании изолированных митохондрий печени крыс 1997 года метиленовый синий ускорял дыхание состояния 4 в тесно сопряжённых митохондриях, использующих сукцинат, что снижало коэффициент контроля дыхания. Эффект был заметен уже при 0,5 микромоляра и сильным при 5 микромолярах — концентрации, близкой к уровню в плазме после внутривенного болюсного введения 100 миллиграммов. При 5 микромолярах митохондрии также набухали, хотя нарушение сопряжения появлялось при более низких концентрациях раньше, что указывает на то, что утечка возникала до структурного повреждения, а не была его следствием. В разобщённых митохондриях краситель стимулировал дыхание насыщаемым, зависимым от концентрации образом. Использование кислорода возрастало в обоих препаратах. Синтез АТФ на единицу потреблённого кислорода — нет. Это классическое разобщение плюс перенос электронов в одной молекуле.

Самое заметное расхождение происходит в сетчатке. В исследовании мышей с дефицитом AIF и фоторецепторных клеток, обработанных ротеноном, метиленовый синий сохранял толщину сетчатки, маркеры фоторецепторов и структуру митохондрий, а также снижал соотношение NADH к NAD и ослаблял стрессовые пути, включая ответ на неправильно свернутые белки и митофагию. Это происходило без устранения дефицита АТФ. Защита без восстановления энергетического выхода означает, что эффект проходил через баланс окислительно-восстановительных процессов и целостность митохондрий, а не через дополнительное образование АТФ. Любой, кто приравнивает сохранение ткани к восстановлению энергетического производства, полностью неправильно интерпретирует этот эксперимент.

Работа с митохондриями мозга добавляет к этому же балансу пункт о стоимости. Те же низкие концентрации, которые улучшали биоэнергетику, также повышали образование перекиси водорода во всех проверенных условиях и замедляли её устранение, измеренное с помощью калиброванного анализа Amplex, а не неспецифического красителя. Больше АТФ и больше окислителя возникали одновременно.

Практический список для чтения

Четыре вопроса отделяют результат с сопряжением от разобщённого результата.

Во-первых, какой показатель фактически измерялся. Одно только потребление кислорода не может сообщить об АТФ. Синтез АТФ, мембранный потенциал и коэффициент контроля дыхания добавляют каждый отдельную часть информации, которую кислородный электрод не видит. Руководство по анализу утверждений в исследованиях метиленового синего подробно рассматривает этот принцип выбора показателей.

Во-вторых, какой субстрат питал митохондрии. Результат с сукцинил-КоА показывает, что выбор топлива может определить, сможет ли дополнительное дыхание вообще превратиться в дополнительную АТФ.

В-третьих, какая концентрация использовалась. Нанонанемолярные и низкие микромолярные концентрации метиленового синего в митохондриях мозга давали умеренные биоэнергетические улучшения с затратой на окислители; полмикромоляра и выше в митохондриях печени ухудшали сопряжение; 5 микромоляров добавляли набухание. Концентрация является частью механизма, а не второстепенной деталью.

В-четвёртых, какая модель использовалась. Изолированные митохондрии показывают схему работы системы, но интактные клетки и ткани добавляют транспорт, восстановление до бесцветной формы и конкурирующие пути для электронов. Лабораторные исследования дозирования, включая то, как концентрация и протокол формируют эффекты метиленового синего, являются связующим звеном между показателями в камере и любыми утверждениями о человеке.

Потребление кислорода отражает поток электронов. АТФ отражает, какая часть этого потока была захвачена. Метиленовый синий может изменять любой из этих показателей, и приведённые выше эксперименты показывают все четыре возможные комбинации: оба повышаются, дыхание повышается только там, где это позволяет субстрат, дыхание повышается при снижении сопряжения, а ткань сохраняется при неизменном уровне АТФ. Число на кислородном электроде — это начало интерпретации, а не её конец.