Метиленовый синий в исследованиях инсульта и церебральной гипоперфузии: что на самом деле показывают три модели

Заблокированная артерия, культура клеток с дефицитом питательных веществ и крыса с суженными сонными артериями могут выглядеть как три версии одного эксперимента. Это не так. Каждый из них задает свой вопрос, и метиленовый синий дает в каждом случае разный ответ. Если смешать их, литература кажется противоречивой. Если разделить их, появляется четкая закономерность, в основном определяемая временем.

Именно это разделение является целью данного обзора. Три модели — это острый очаговый инсульт, депривация кислорода и глюкозы с последующей реоксигенацией в культивируемых клетках и хроническая церебральная гипоперфузия, продолжающаяся недели. Предполагаемый механизм, связывающий их, связан с митохондриями, но результаты различаются, потому что различается метаболический контекст.

Три модели отвечают на разные вопросы

Острый очаговый инсульт у крыс обычно создают путем окклюзии средней мозговой артерии, сокращенно MCAO. Похожая на тромб блокировка создает ишемическое ядро, окруженное зоной пенумбры — тканью, которая находится под угрозой, но потенциально может быть сохранена при восстановлении кровотока. Здесь вопрос заключается в том, замедляет ли вмешательство рост инфаркта или сохраняет функцию вокруг реперфузии.

Депривация кислорода и глюкозы, сокращенно OGD, работает в другом масштабе. Культивируемые клетки мозга помещают в условия почти полного отсутствия кислорода без глюкозы, а затем возвращают в нормальную среду. Здесь нет тромба, коллатерального кровообращения, артериального давления и иммунной системы. Вопрос является чисто клеточным: что происходит с дыханием, АТФ и выживанием, когда субстраты исчезают, а затем возвращаются.

Хроническая церебральная гипоперфузия использует постоянную двустороннюю окклюзию сонных артерий у крыс, называемую моделью 2VO. Кровоток к переднему мозгу снижается и остается низким в течение недель. Нет внезапного очагового инфаркта и нет экстренной реперфузии. Вопрос заключается в том, сохраняет ли метаболическая поддержка в течение недель сосуды, митохондрии и память при длительном низком кровотоке.

Следовательно, улучшение памяти после одного месяца лечения в модели 2VO ничего напрямую не говорит о спасении человеческого мозга во время экстренной тромбэктомии. Это различие важно, поскольку большинство оптимистичных обзоров его пропускают.

Острый инсульт: защита при реперфузии, задержка без нее

Наиболее четкий острый результат получен при временной MCAO с реперфузией. Крысам выполняли окклюзию в течение 60 минут, затем вводили низкую дозу метиленового синего внутривенно с начала реперфузии, с дополнительными дозами через 3 часа и на второй день. МРТ показала, что у группы с носителем объем поражения увеличился примерно на 19 процентов ко второму дню, тогда как у группы лечения он уменьшился примерно на 17 процентов, с примерно на 30 процентов меньшими конечными инфарктами и лучшими неврологическими показателями на 2-й и 7-й дни. Выживание как ядра, так и ткани пенумбры по данным визуализации улучшилось. Более широкая литература по нейропротекции рассматривает эту защиту, связанную со временем реперфузии, вместе с результатами при глобальной ишемии и травме.

Картина меняется, когда артерия остается заблокированной. В эксперименте с постоянной MCAO метиленовый синий, введенный во время продолжающейся ишемии, замедлял расширение диффузионного поражения и ненадолго продлевал несоответствие между перфузией и диффузией, с немного лучшим локальным кровотоком, но конечный объем инфаркта через 24 часа существенно не отличался. Он задерживал превращение ткани под угрозой в инфаркт, но не заменял открытие сосуда.

Третье острое исследование добавляет информацию о механизме и нюансах дозировки. Однократная внутрибрюшинная доза сразу после окклюзии показала наибольшее уменьшение инфаркта, около 50 процентов, при промежуточной дозе 5 мг/кг, а не при 1 или 10 мг/кг, вместе с улучшением сенсомоторных показателей. Авторы связали это с сохранением структуры митохондрий и усилением митофагии — избирательного удаления поврежденных митохондрий. Поэтому доза, путь введения и график применения имеют значение, а значения мг/кг у крыс не являются дозами для инсульта у людей.

Клеточные культуры: один и тот же препарат помогает или вредит в зависимости от времени поступления

Эксперимент с астроцитами является наиболее показательным и наиболее часто неправильно цитируемым. Первичные кортикальные астроциты мыши подвергались 6 часам тяжелой депривации при 0,1 процента кислорода в среде без глюкозы, пирувата или сыворотки, после чего следовали 24 часа реоксигенации с восстановлением субстратов. Около половины клеток погибло, что оставляет в анализе возможность показать как положительный, так и отрицательный эффект.

Когда метиленовый синий присутствовал во время фазы депривации, выживаемость ухудшалась, а не улучшалась. Когда его вводили только при реоксигенации, низкие микромолярные концентрации улучшали жизнеспособность и повышали потребление кислорода, поглощение глюкозы и производство АТФ. В нормальных условиях те же концентрации увеличивали поглощение глюкозы примерно на 89 процентов при 0,1 микромоляре и примерно на 200 процентов при 1 микромоляре, с сохранением гликогена и активности гексокиназы после повреждения и без измеренного повышения супероксида.

Механизм проще понять через аналогию с резервным генератором. Метиленовый синий действует как альтернативный переносчик электронов, который принимает восстановительные эквиваленты и передает их к цитохрому c и комплексу IV, поддерживая поток электронов и синтез АТФ, одновременно уменьшая утечку электронов выше по цепи. Во время тяжелой депривации эта стимуляция является недостатком, потому что повышает метаболические потребности, когда кислорода и глюкозы почти нет, что может быстрее исчерпать последние резервы. После возвращения субстратов то же свойство становится преимуществом, потому что помогает поврежденным митохондриям эффективно использовать восстановленные кислород и глюкозу. Поэтому объяснения переноса электронов в митохондриях должны рассматриваться вместе с контекстом депривации.

Осторожность: это правило времени относится к данной модели астроцитов. Дополнительное исследование клеток с другим типом клеток, более мягкой депривацией и меньшей концентрацией обнаружило защиту даже при воздействии во время депривации. Тип клетки, остаточный кислород, концентрация и протокол определяют направление эффекта.

Хронический низкий кровоток: память, цитохромоксидаза и сосуды в течение недель

В хронических экспериментах использовали ежедневное применение низкой дозы в течение недель, а не однократное экстренное введение. В первом исследовании крысы с постоянной окклюзией сонных артерий получали 4 мг/кг ежедневно в течение одного месяца, после каждого ежедневного тренировочного сеанса, чтобы воздействовать на консолидацию, а не на острое выполнение задания. Животные с окклюзией медленнее обучались задачам визуального различения и хуже выполняли сложную проверку памяти, тогда как способность плавать, двигательная активность и распознавание запахов не изменились. Ежедневное лечение уменьшало нарушения обучения и памяти без изменения общего двигательного поведения.

Последующее исследование картировало цитохромоксидазу, являющуюся митохондриальным комплексом IV, в 44 областях мозга после того же месячного режима. Окклюзия снижала активность фермента в зрительной, префронтальной и периринальной коре, а также в гиппокампе и миндалине, и ослабляла согласованную активность между зрительной корой и гиппокампом. Лечение сохраняло региональную активность фермента и усиливало эти межрегиональные метаболические корреляции, а сохранение активности коррелировало с лучшим выполнением задач. Эти корреляции описывают согласованную активность метаболических ферментов, а не прямые измерения функциональной связи человеческого мозга, что обзоры энергетического метаболизма мозга помогают правильно интерпретировать.

Отдельное недельное исследование использовало 2 мг/кг ежедневно и добавило ингибитор пути для проверки механизма. Церебральный кровоток увеличился примерно с 60 до примерно 100 мл на 100 г в минуту при лечении, а плотность сосудов гиппокампа выросла примерно с 15,1 до 23 процентов. Оба эффекта частично исчезали при блокировании пути выживания PI3K/Akt, а фосфорилированный Akt увеличивался при лечении. Данные о кровотоке, плотности сосудов, барьере и нейронах указывают на нейроваскулярную защиту, связанную с сигналингом PI3K/Akt, а не только с метаболическим эффектом.

Почему это не означает экстренное лечение инсульта

Лабораторный контроль является причиной, по которой эти результаты нельзя напрямую переносить. Клеточные культуры не имеют тромба или фармакокинетики. Модель 2VO представляет собой длительное глобальное снижение кровотока, а не внезапную очаговую эмболию с пенумброй возрастом в несколько минут. Даже MCAO у крыс использует молодых здоровых животных, анестезию, одинаковые окклюзии и точно рассчитанное введение, в отличие от пожилых пациентов с различными тромбами, атеросклерозом, гипертонией, диабетом и неизвестным временем начала.

Ни одно опубликованное рандомизированное исследование у людей не установило метиленовый синий как экстренное лечение острого ишемического инсульта. Иногда цитируемое исследование визуализации у людей включало 26 здоровых взрослых, а не пациентов с инсультом, и показало, что однократная пероральная доза изменяла связанные с задачами сигналы мозга с небольшим улучшением извлечения информации. Это демонстрирует центральную активность, а не эффективность при инсульте. Современные экстренные рекомендации вместо этого сосредоточены на быстрой реперфузии с помощью внутривенного тромболизиса у подходящих пациентов и тромбэктомии при соответствующих окклюзиях крупных сосудов, а стандартные пути экстренной помощи при инсульте остаются единственным доказанным маршрутом. При подозрении на инсульт нельзя откладывать обращение за помощью ради введения метиленового синего, а практические ограничения экстраполяции доз из доклинических исследований объясняют, почему схемы для крыс нельзя считать клиническими режимами.

Контекст безопасности также подтверждает эти границы. Внутривенный метиленовый синий имеет предупреждение в виде рамки о серьезном или смертельном серотониновом синдроме при сочетании с серотонинергическими препаратами, включая СИОЗС, СИОЗСН и ингибиторы МАО, которые многие пациенты возраста с инсультом принимают. Он противопоказан при дефиците G6PD из-за риска гемолиза. Он также ингибирует передачу сигналов оксида азота, что в некоторых условиях повышает сосудистое сопротивление и давление, поэтому его нельзя просто описывать как препарат, увеличивающий кровоток в мозге. Одобренная схема 1 мг/кг внутривенно для приобретенной метгемоглобинемии не является схемой лечения инсульта.

Корректное резюме является узким, но реальным. При реперфузии после временной очаговой ишемии низкая доза метиленового синего уменьшала развитие поражения у крыс. При постоянной окклюзии он задерживал, но не предотвращал инфаркт. В астроцитах он вредил при тяжелой депривации и помогал при реоксигенации. При хронической гипоперфузии он сохранял цитохромоксидазу, сосуды и память в течение недель. Один переносчик, три контекста, три ответа.