Метиленовый синий и нейромедиаторы: серотонин, дофамин, ГАМК и ацетилхолин

Распространённое утверждение о метиленовом синем гласит, что он одновременно повышает серотонин, повышает дофамин, успокаивает ГАМК и улучшает ацетилхолиновую передачу. Это утверждение объединяет четыре отдельных лабораторных наблюдения в один эффект внутри организма человека. Исследования, лежащие в его основе, измеряли разные мишени, в разных препаратах и при концентрациях, отличающихся примерно в тысячу раз. Если разделить эти мишени, картина становится одновременно более интересной и более осторожной, чем позволяет предположить одно предложение.

Основная идея проста. Молекула, которая связывается с ферментом в пробирке, сделала только одно: связалась с ферментом в пробирке. Изменит ли это уровень нейромедиатора в живом мозге, зависит от концентрации, достигающей ткани, от того, в какой химической форме находится молекула при попадании туда, и от всего остального, что эта молекула делает при той же концентрации. Каждый раздел ниже связывает эти три вопроса с конкретным результатом, к которому они относятся.

Серотонин: две мишени, две концентрации

Серотонин имеет наиболее сильную доказательную базу из четырёх систем, и она основана на двух отдельных молекулярных мишенях, которые не следует объединять.

Первая мишень — моноаминоксидаза типа A, митохондриальный фермент, расщепляющий серотонин. Очищенная человеческая MAO-A ингибируется метиленовым синим как ингибитором с плотным связыванием с Ki около 27 наномолей, тогда как MAO-B требует значительно более высоких концентраций до проявления эффекта, как показано в кинетическом исследовании, связавшем краситель с токсичностью серотонина. Связанная линия исследований обнаружила ту же селективность в ткани эпифиза крыс, где блокирование MAO-A повышало содержание индолов, производных серотонина, снижало уровень метаболита серотонина 5-HIAA и изменяло связанный с серотонином рефлекс переворачивания у лягушек, что описано в исследовании окислительно-восстановительных красителей и индолов эпифиза. Два разных препарата, одно направление: меньше распада, больше сохранённого серотонина там, где фермент обычно его удалял бы.

Вторая мишень — сам переносчик серотонина. В клетках, экспрессирующих человеческий переносчик, метиленовый синий снижал захват как флуоресцентного субстрата, так и меченого серотонина с IC50 около 1,4 микромоля, а также подавлял вызванные серотонином токи в исследованиях patch-clamp, согласно прямой характеристике действия метиленового синего на SERT. Авторы проверили очевидные альтернативные объяснения и обнаружили, что эффект не зависел от передачи сигнала cGMP, изменений кальция и экспрессии переносчика на поверхности клетки.

Обратите внимание на разрыв между двумя числами. Ингибирование MAO-A происходит в наномолярном диапазоне. Для ингибирования переносчика требуется примерно в пятьдесят раз больше красителя. Низкая экспозиция, которая полностью воздействует на фермент, может почти не затрагивать переносчик. Любое объединение этих данных в одно утверждение о серотонине смешивает два разных диапазона доз в один.

Имеет ли значение любая из этих мишеней у человека, принимающего другие серотонинергические препараты, является вопросом взаимодействия лекарств и относится к руководству по взаимодействиям. Эта статья описывает мишени; клинические рекомендации находятся на той странице.

Дофамин: самый слабый прямой случай

В отношении дофамина наибольшая осторожность необходима именно здесь. Не существует хорошо установленного исследования, показывающего, что метиленовый синий блокирует переносчик дофамина или напрямую связывается с дофаминовыми рецепторами. Часто цитируемое значение IC50 переносчика 1,4 микромоля относится к переносчику серотонина, а не DAT, и его нельзя переименовывать.

Вместо этого существуют косвенные данные. Поскольку ферменты MAO также метаболизируют дофамин, ингибирование MAO сохраняет дофамин наряду с серотонином и норадреналином. В митохондриальных препаратах метиленовый синий блокировал опосредованное MAO-B превращение нейротоксина MPTP в его дофаминергическое токсичное производное с активностью, сравнимой с противопаркинсоническим препаратом депренилом, как описано в исследовании биоактивации MPTP и связанных работах по MAO-B. Исследования на животных добавляют отдельные фрагменты: примерно трёхкратное повышение базового высвобождения дофамина из срезов стриатума крыс при 10 микромолях, изученное в контексте передачи сигналов оксида азота, а не блокирования переносчика, и смешанные региональные результаты после системного введения, где некоторые исследования обнаруживали повышение серотонина и норадреналина, тогда как дофамин почти не изменялся.

Таким образом, история с дофамином реальна, но вторична. Она проходит через фермент, который работает с несколькими моноаминами одновременно, а не через специфическую дофаминовую мишень. Любое утверждение, что метиленовый синий повышает дофамин у людей, пропускает этап, на котором это было бы непосредственно показано.

ГАМК: блокирование тормоза в участке связывания

Результат для ГАМК является точным и идёт вразрез с репутацией красителя. В клетках, экспрессирующих человеческие рецепторы GABA-A, метиленовый синий ингибировал токи, вызванные ГАМК, начиная примерно с 3 микромолей, с IC50 около 31 микромоля для распространённой конфигурации alpha1-beta2-gamma2, в электрофизиологическом исследовании, определившем место действия.

Наиболее ценна здесь локализация участка действия. Мутации в участке пикротоксина не изменили ингибирование, а бензодиазепиновый и цинковый участки были исключены сравнением субъединиц. Вместо этого мутации двух остатков, известных как часть самого участка связывания ГАМК, резко снизили блокирование, что указывает на конкурентный антагонизм в участке агониста, а не на аллостерическую модуляцию в другом месте. Эффект сохранялся для синаптических и внесинаптических комбинаций субъединиц и быстро исчезал после промывки.

Это создаёт реальное противоречие, которое стоит сформулировать прямо. Молекула, исследуемая в контексте поддержки памяти, также подавляет быструю тормозную передачу в лабораторном препарате. Происходит ли такое подавление в живом мозге, зависит от локальной концентрации, а 31 микромоль является высоким значением относительно большинства системных экспозиций, что рассматривается в последнем разделе. Само противоречие является результатом; для его разрешения потребовались бы эксперименты, которые пока не проводились.

Ацетилхолин: две противоположные мишени

Для ацетилхолина существуют два результата, которые тянут в противоположные стороны, поэтому их необходимо рассматривать отдельно.

С одной стороны, метиленовый синий ингибирует ферменты, удаляющие ацетилхолин. Ацетилхолинэстераза эритроцитов коровы ингибировалась конкурентно примерно при 0,57 микромоля, бычий фермент — около 0,42 микромоля, а активность эстеразы человеческой плазмы — около 1,1 микромоля; бутирилхолинэстераза ингибировалась примерно в диапазоне 0,4–5,3 микромоля в зависимости от вида и препарата, что обобщено в обзоре действий метиленового синего в нервной системе. Замедление удаления приводит к сохранению большего количества медиатора в синапсе — та же логика лежит в основе нескольких одобренных препаратов для болезни Альцгеймера.

Но у этой химии есть условие. Окисленная синяя форма ингибирует фермент; восстановленная бесцветная форма этого не делает, и длительная инкубация, позволяющая красителю восстановиться, сама по себе приводит к более слабому ингибированию. Любое значение анализа холинэстеразы содержит скрытую переменную: сколько красителя всё ещё находилось в синей форме во время измерения.

С другой стороны, метиленовый синий блокирует альфа7 никотиновый рецептор, один из рецепторов, на которые действует ацетилхолин. Человеческие альфа7-рецепторы, экспрессированные в ооцитах лягушки, ингибировались с IC50 около 3,4 микромоля посредством неконкурентного, независимого от напряжения антагонизма, который не изменял активность агониста, а 3 микромоля устраняли ответы, вызванные холином, в срезах гиппокампа крыс, как сообщает исследование альфа7-рецептора. Таким образом, при схожих низких микромолярных концентрациях краситель одновременно сохраняет медиатор и ослабляет один из его рецепторов. Итоговый эффект на холинергическую передачу нельзя определить только по одному из этих результатов. Эта неоднозначность связана с более широкой литературой по болезни Альцгеймера и с обсуждением когнитивных исследований и исследований заболеваний, не разрешая вопрос здесь.

Сравнение в одном месте

Три порядка величины разделяют наиболее чувствительную и наименее чувствительную мишени. В этой таблице находится суть всей статьи.

Достигают ли эти концентрации мозга?

Число из пробирки ничего не значит без числа экспозиции рядом с ним. После внутривенного болюсного введения около 1,4 мг на кг сообщались средние уровни метиленового синего в плазме человека около 5 микромолей, тогда как пероральная доза 100 мг приводила к уровням в цельной крови около 0,08 микромоля в той же исследовательской традиции. Исследования распределения у крыс показывают уровни в мозге примерно в десять–двадцать раз выше циркулирующих уровней, хотя это общий краситель в гомогенизированной ткани, а не свободный окисленный краситель в синапсе; связывание с белками плазмы около 94 процентов вместе с распределением в клетках крови дополнительно снижает свободную фракцию.

При сравнении с таблицей картина выглядит постепенной, а не бинарной. Ингибирование MAO-A находится значительно ниже типичных внутривенных экспозиций и фармакологически возможно при таком пути введения красителя. Эффекты холинэстеразы и альфа7-рецептора находятся в диапазоне низких микромолярных концентраций, который пересекается с внутривенными пиками, но может не достигаться при обычных пероральных дозах. IC50 GABA-A в 31 микромоль находится выше большинства вероятных системных экспозиций, что делает именно этот блок наиболее трудно применимым к целому организму. Каждая строка этого сравнения требует одного и того же уточнения: релевантной является концентрация свободного, окисленного, внеклеточного красителя в месте расположения мишени — величина, которую напрямую не измеряет ни один анализ крови.

Чего не следует заключать

Ни одна строка таблицы не устанавливает, что метиленовый синий предсказуемо повышает или снижает какой-либо нейромедиатор у человека