Метиленовый синий и Bartonella: лабораторные данные и ограничения клинических доказательств

Культуральная чашка и пациент имеют одно общее слово — инфекция, но не одну и ту же концепцию. В чашке инфекция — это подсчёт колоний на агаре. У пациента это бактерии внутри клеток и сосудов, лекарства, перемещающиеся через кровь и ткани, и иммунная система, которая выполняет часть работы. Если смешать эти два понятия, впечатляющее лабораторное число начинает выглядеть как лечение. Если разделять их, то то же число становится тем, чем оно является: причиной для проведения следующего эксперимента.

Именно это разделение является целью данного обзора метиленового синего и Bartonella. Два лабораторных исследования одной исследовательской группы проверяли метиленовый синий против Bartonella henselae в нерастущих состояниях. Оба сообщили о сильной активности в стеклянных и пластиковых условиях. Ни одно из них не проводилось на людях.

Почему исследователи изучают стационарную фазу

Большинство испытаний антибиотиков используют растущие клетки. Такая модель не учитывает более сложный случай: клетки, которые перестали делиться и переносят препараты, убивающие их растущих собратьев.

Bartonella может сохраняться в организме, в том числе внутри эритроцитов и эндотелиальных клеток. Поэтому группа изучала, какие одобренные препараты способны уничтожать B. henselae после перехода в стационарную фазу. Низкое значение MIC против растущих клеток не предсказывало уничтожение стационарных клеток. Рифампин имел очень низкое значение MIC, но плохо уничтожал стационарные клетки, тогда как соединения с более высокими значениями MIC уничтожали их хорошо. Читатели, которым нужен общий метод анализа подобных статей, найдут его в руководстве по чтению исследований метиленового синего.

Первый скрининг: Li и коллеги, 2019

Скрининг стационарной фазы 2019 года в Antibiotics использовал один штамм, B. henselae JK53, выращенный в среде Schneider с 10 процентами фетальной бычьей сыворотки при 37 C и 5 процентах CO2. Однодневные культуры в основном состояли из распределённых делящихся клеток. Пятидневные культуры, примерно на уровне 10 в 8 степени колониеобразующих единиц на мЛ, были приняты за стационарную фазу и содержали видимые агрегаты.

В анализе использовался SYBR Green I с пропидий йодидом, откалиброванный по смесям живых и убитых изопропанолом клеток. Поскольку метиленовый синий имеет сильную окраску, положительные результаты подтверждали с помощью микроскопии, а затем подсчётом колоний на кровяном агаре — более строгим конечным показателем.

Из 1 581 одобренного препарата при концентрации 50 микромоль метиленовый синий оставлял 16 процентов жизнеспособности по данным считывателя и 25 процентов по микроскопии. Даптомицин показал 21 процент, несколько азолов — 22–27 процентов, гентамицин — 32 процента, эритромицин — 66 процентов, ципрофлоксацин — 74 процента. Пирвиния памоат выглядел сильнее по данным считывателя, но не мог быть оценён с помощью микроскопии из-за собственной флуоресценции.

Против растущей B. henselae MIC метиленового синего составляла 0,08–0,16 микрограмм на мЛ. Против пятидневных стационарных клеток при 5 микрограммах на мЛ количество колоний снизилось до уровня, при котором колонии не обнаруживались после одного дня воздействия, что соответствовало даптомицину и пирвиния памоату при проверенных концентрациях. Отдельный эксперимент с динамикой уничтожения использовал 10 микрограммов на мЛ. Это лабораторные уровни воздействия, а не дозы, и статья указывает их именно так. Упомянутое в статье значение максимальной концентрации в плазме человека около 3,9 микрограмм на мЛ приведено только как фоновый контекст. Обзор фармакокинетики метиленового синего объясняет, почему значение в плазме нельзя рассматривать как значение в тканях.

В статье явно указаны два ограничения. Не было модели биоплёнки и не проводилось тестирование комбинаций метиленового синего. Пятидневные агрегаты были скоплениями в стационарной жидкой культуре, а не подтверждённым экспериментом с биоплёнкой. Авторы призвали к исследованиям на животных, работе с комбинациями, исследованиям биоплёнок и тестированию других видов Bartonella.

Комбинации и клетки, полученные из биоплёнок: Zheng и коллеги, 2020

Последующее исследование 2020 года в BMC Microbiology использовало тот же штамм и среду, но перешло к шестидневным стационарным культурам и добавило два элемента, которых не было в первой статье: двухкомпонентные комбинации и модель клеток, полученных из биоплёнки.

Для отдельных препаратов при одинаковой концентрации 5 микрограмм на мЛ в течение 24 часов метиленовый синий оставлял 3,2 раза 10 в 4 степени колониеобразующих единиц на мЛ против контрольного значения около 2,8 раза 10 в 10 степени. Ципрофлоксацин, гентамицин и нитрофурантоин оставляли меньше колоний в тот же момент. Это отличается от результата 2019 года, где тот же номинальный уровень дал отсутствие обнаруживаемых колоний после одного дня. Возраст культуры, плотность и обработка различались, поэтому направление эффекта было воспроизводимым, но величина не была идентичной. Такие различия между запусками являются одной из причин, по которой стандартные проверки безопасности и взаимодействий рассматривают лабораторную активность отдельно от клинического эффекта.

Скрининг комбинаций является наиболее часто цитируемой частью. Каждый компонент был зафиксирован на уровне 5 микрограмм на мЛ. И азитромицин плюс метиленовый синий, и рифампин плюс метиленовый синий не дали обнаруживаемых стационарных колоний через 24 часа, как и обе комбинации с ципрофлоксацином, и только эти четыре из 25 протестированных пар. Формальный анализ синергии не проводился, поэтому корректный термин — активная комбинация в этих условиях, а не доказанная синергия.

Эксперимент с биоплёнкой проверял клетки, полученные из молодой разрушенной биоплёнки, а не проникновение в неповреждённую зрелую биоплёнку. Культуры выращивали пять дней, разводили в планшеты ещё на пять дней, подтверждали окрашиванием кристаллическим фиолетовым, затем соскребали перед воздействием препаратов. При 5 микрограммах на мЛ метиленовый синий сам по себе снизил показатель до 2,3 раза 10 во 2 степени к 6 дню, среди лучших отдельных препаратов, но не до нуля. Обе комбинации метиленового синего достигли нуля к 6 дню, как и обе комбинации с ципрофлоксацином.

Авторы отметили те же ограничения, которые должен учитывать внимательный читатель: молодая соскобленная биоплёнка вместо старой неповреждённой биоплёнки, одна удобная концентрация для всех препаратов вместо каждого препарата на собственном реалистичном максимальном уровне, только выбранные пары с центром на азитромицине или рифампине, один штамм, отсутствие животных и пациентов. Последующая работа с тремя препаратами была предложена, но не опубликована.

Сравнение дизайна исследований

Таблица — это основная мысль этой статьи в краткой форме. Всё, что находится слева от последнего столбца, является культуральной работой. Ни один из этих двух документов не занимает последний столбец.

Bartonella — это не Borrelia

Обе статьи упоминают Borrelia burgdorferi, спирохету болезни Лайма, поскольку анализ с красителем был основан на более ранних исследованиях стационарной фазы Borrelia в той же лаборатории, где метиленовый синий и даптомицин также показали положительные результаты. Эта история полезна как контекст и является частым источником ошибок.

Ни один эксперимент в обеих статьях по Bartonella не сравнивает Borrelia и Bartonella напрямую. Организмы различаются, среды различаются, концентрации различаются, а предполагаемый мембранный эффект метиленового синего у Bartonella был представлен как гипотеза, требующая дальнейшего изучения. Результаты нельзя переносить между видами, и ни одна из статей не подтверждает широкие утверждения о паразитах. Сравнение персистирующих форм Borrelia и Bartonella сохраняет эти две области исследований отдельно именно по этой причине.

Почему культуры не превращаются в протокол

Интерес к протоколу метиленового синего при Bartonella понятен. Именно эти статьи являются причиной, по которой такую фразу следует рассматривать как предупреждающий сигнал, а не как список покупок.

Во-первых, 5 микрограмм на мЛ в лунке — это не назначение. К этому значению не привязаны всасывание, распределение, связывание с белками, проникновение внутрь клеток или переносимость. Авторы выбрали его как приблизительное среднее значение пиков антибиотиков и указали, что будущая работа должна использовать для каждого препарата собственный реалистичный уровень.

Во-вторых, отсутствие колоний означает отсутствие колоний в условиях данного посева, а не стерильность тканей. Персистирующие формы, внутриклеточные бактерии и ограничения отбора проб находятся за пределами агаровой чашки.

В-третьих, комбинации, которые стерилизуют лунку, могут не сработать или причинить вред в организме. Азитромицин плюс метиленовый синий и рифампин плюс метиленовый синий являются лабораторными комбинациями при лабораторных уровнях воздействия. Без фармакокинетических исследований на животных и контролируемых данных на людях нет дозы, длительности и соотношения пользы и риска. Тем, кто рассматривает такие варианты, следует обсудить их с врачом и изучить, когда применение метиленового синего требует медицинского контроля, прежде чем делать выводы на основе данных из чашки.

Узкий вывод, который действительно подтверждают эти статьи, заключается в следующем: метиленовый синий демонстрирует воспроизводимую активность против нерастущей B. henselae JK53 in vitro, включая двухкомпонентные лабораторные комбинации, при этом наиболее сильные результаты комбинаций и клеток, полученных из биоплёнки, были получены в исследовании 2020 года. Всё остальное, включая то, имеет ли эта активность значение для бартонеллёза у людей, остаётся непроверенным.