Измерение активных форм кислорода в экспериментах с метиленовым синим

Две лаборатории проводят то, что каждая из них называет антиоксидантным экспериментом с метиленовым синим. Одна сообщает, что краситель подавляет активные формы кислорода. Другая сообщает, что он их образует. Обе получают чистые дозозависимые кривые. Обе работают добросовестно. Разница не в мошенничестве и не в некомпетентности. Дело в том, что две группы измеряли разные параметры в разных условиях освещения, с помощью зондов, отвечающих на разные вопросы, а затем описывали оба результата одним словом: ROS.

Метиленовый синий трудно измерять точно, потому что он участвует в химии, которую должен наблюдать. В темноте он переносит электроны между донорами и акцепторами и возвращается в исходную форму, готовый снова участвовать в цикле. Под воздействием света он становится фотосенсибилизатором, переходя в возбужденное триплетное состояние, из которого может передавать энергию кислороду для образования синглетного кислорода или передавать электроны для образования радикалов и перекиси водорода. Любой зонд, помещённый в такую систему, может окисляться, восстанавливаться, обесцвечиваться или оптически маскироваться самим красителем. Поэтому первый вопрос любого измерения ROS — это не то, каким является число. Вопрос в том, что именно обнаруживает анализ и как краситель влияет на этот анализ.

Amplex Red: калиброванный анализ перекиси водорода

Комбинация метиленовый синий Amplex Red является наиболее обоснованным сочетанием в этой литературе, если она правильно настроена. Химия специфична: пероксидаза хрена использует перекись водорода для окисления субстрата Amplex до флуоресцентного продукта резоруфина примерно в стехиометрии один к одному. Перекись из образца превращается в сигнал флуоресценции детектора. Ничто другое из классического семейства ROS напрямую не запускает эту реакцию.

Решающим преимуществом является калибровка. Тщательный исследователь проводит измерения с известными стандартами перекиси в том же буфере, с теми же концентрациями пероксидазы и субстрата, тем же временем инкубации и теми же оптическими настройками, а затем сравнивает образцы с этой кривой. В исследовании изолированных митохондрий мозга, которое служит основой этого метода, авторы сделали именно это: они добавляли известные количества перекиси в конце каждого измерения, а результаты сообщались как скорости в пикомолях в минуту на миллиграмм белка, а не как произвольные единицы флуоресценции. Именно это превращает свечение в измерение.

Три детали этого исследования заслуживают повторения. Во-первых, авторы подтвердили сигнал с помощью каталазы, которая разрушает перекись. Индуцированный метиленовым синим рост флуоресценции прекращался после добавления каталазы, подтверждая, что сигнал связан с перекисью, а не с оптическим артефактом. Во-вторых, они напрямую проверили влияние освещения, закрывая возбуждающий луч так, чтобы образцы получали одну восьмую обычной дозы света, и сигнал снижался только на девять процентов. Более девяноста процентов обнаруженной ими перекиси не зависело от измерительного света. В-третьих, они отдельно измерили удаление перекиси с помощью электрода и обнаружили, что краситель одновременно повышал образование и замедлял удаление. Зонд, который сообщает только об общей флуоресценции, смешал бы эти два эффекта.

У анализа всё ещё есть уязвимые места, и метиленовый синий обнаруживает несколько из них. Краситель широко поглощает в том же красном диапазоне, где излучает резоруфин, поэтому при высоких концентрациях красителя образец может маскировать собственный сигнал через эффекты внутреннего фильтра. Поэтому стандарты должны содержать ту же концентрацию красителя, что и образцы. Amplex Red также может самостоятельно фотоокисляться, а его продукт резоруфин может вступать в фоторедоксные циклы, создающие супероксид и перекись, что особенно важно, когда эксперимент одновременно освещает фотосенсибилизатор. Практическое решение — сначала облучать образцы с метиленовым синим, а затем анализировать аликвоты с реагентами Amplex в темноте, а не освещать краситель и зонд одновременно. Наконец, супероксиддисмутаза не просто подавляет сигнал Amplex: превращение супероксида в перекись может его повышать. Контроль с SOD, увеличивающий флуоресценцию, не является ошибкой. Он указывает на супероксид как на промежуточный вид.

DCFDA: неспецифический индикатор окисления

Сочетание метиленовый синий DCFDA является источником большей части путаницы. DCFH-DA — это предшественник для загрузки клеток. Внутриклеточные эстеразы удаляют его ацетатные группы, оставляя нефлуоресцентный DCFH, а окисление DCFH создаёт флуоресцентный DCF. Его могут окислять многие соединения: гидроксильные радикалы, промежуточные соединения пероксидаз и гема, диоксид азота, хлорноватистая кислота и радикалы, производные пероксинитрита. Одна только перекись водорода не окисляет его напрямую с полезной скоростью; зависимая от перекиси флуоресценция обычно требует железа, гемовых белков или химии с участием пероксидазы.

Критика, которую следует учитывать в каждом разделе методов, основана на анализе DCFH как зонда, выполненном Kalyanaraman и коллегами, и изложенном в исследовании митохондрий мозга, где DCFDA был отвергнут по этой причине: было показано, что краситель реагирует медленно, с неохарактеризованной стехиометрией, без корректной калибровки и с соединениями, не являющимися ROS. Зонд также усиливает то, что измеряет: одноэлектронное окисление DCFH создаёт радикал DCF, который реагирует с кислородом с образованием супероксида, превращающегося в дополнительную перекись. Сигнал частично создаёт химию, которую он сообщает.

Это не делает DCFDA бесполезным. Это делает его скрининговым инструментом, а не методом идентификации. Рост флуоресценции DCF означает, что увеличилось зависящее от окислителей окисление зонда. Это не означает, что увеличилась перекись, и тем более не означает, что увеличился общий уровень ROS — величина, которую не измеряет ни один отдельный зонд. Более ранние работы с метиленовым синим, основанные на окислении DCF выше одного микромоля, сообщали о прооксидантных эффектах, тогда как другие системы того же периода сообщали о защите от гибели клеток, вызванной перекисью. Оба наблюдения могут быть верными для одного и того же красителя в разных редокс-контекстах, а один результат DCF не может сказать, какой окислитель создавал сигнал. Важность более ранней работы с митохондриями мозга заключается в том, что она заменила этот скрининг калиброванным измерением перекиси и напрямую определила нагрузку: даже сто наномолярного красителя повышали высвобождение перекиси в несколько раз при всех протестированных субстратах и состояниях дыхания.

У DCFDA есть ещё одна специфичная для метиленового синего проблема. Краситель интенсивно окрашен и активен в редокс-реакциях, поэтому он может обесцвечивать флуоресценцию, гасить излучение или окислять химию зонда независимо от клеточных ROS. Контроль без клеток с красителем и зондом не является необязательным дополнением. Это эксперимент, показывающий, взаимодействует ли краситель с зондом.

Спиновые ловушки и поглощение кислорода: идентичность и поток

Если флуоресцентные зонды показывают, что появилось что-то окисляемое, то электронный спиновый резонанс со спиновыми ловушками сообщает информацию ближе к тому, чем это было. Классическое исследование фотохимии метиленового синего использовало ESR для обнаружения аскорбатного радикала в системе краситель, аскорбат и свет, затем показало образование перекиси в экспериментах по поглощению кислорода и образование гидроксильных радикалов, катализируемое железом, в экспериментах со спиновыми ловушками. Каждый метод отвечал на вопрос, на который другие не могли ответить: ESR давал идентичность радикала, поглощение кислорода давало поток реакции независимо от любого флуоресцентного зонда, а вместе эти методы показывали одновременную работу путей синглетного кислорода и радикалов в одной освещённой системе.

Результат 1984 года всё ещё читается как предупреждение. При наличии освещения и восстановителя краситель образовывал перекись, а при наличии железа система производила гидроксильный радикал — наиболее реакционноспособный вид в этом наборе. Авторы связали это с аскорбатом в глазу и поставили под вопрос неосторожное офтальмологическое применение. Современным читателям следует учитывать условия: свет плюс восстановитель плюс железо. Удаление любого одного из этих факторов ослабляет или устраняет путь.

Кислородные электроды занимают своё место по другой причине. Электрод типа Кларка измеряет суммарное потребление кислорода, что подтверждает, что управляемая красителем редокс-химия расходует молекулярный кислород, и даёт кинетику, которую невозможно подделать флуоресцентным артефактом. Он не определяет продукт. Перекись, супероксид, вода и распад синглетного кислорода всё расходуют кислород. Поток без идентичности так же неполон, как идентичность без потока, поэтому сильные исследования сочетают электрод с калиброванным анализом перекиси или ловушкой.

Почему результаты об антиоксидантных свойствах противоречат друг другу

Если расположить три метода рядом, кажущиеся противоречия в литературе о метиленовом синем объясняются различиями методов и тремя биологическими фактами.

Во-первых, краситель одновременно является переносчиком электронов и источником перекиси. Перенаправляя электроны от участков дыхания, где кислород в противном случае превращался бы в супероксид, он может снижать один вид ROS, тогда как его восстановленная форма напрямую восстанавливает кислород до перекиси, повышая другой. Лаборатория, изучающая митохондриальную редокс-химию и её роль обходного пути, поэтому должна ожидать зависимые от зонда ответы: сигнал, чувствительный к супероксиду, снижается, а сигнал перекиси повышается в одной и той же кювете.

Во-вторых, перекись в низких количествах является сигналом, а не только повреждающим фактором. Исследование митохондрий мозга мышей, продолжившее ранние работы, обнаружило образование перекиси всего от пятидесяти наномолярного красителя без повреждения митохондриальной ДНК при терапевтических уровнях, а также защиту от повреждений, вызванных ротеноном, после предварительной обработки. Только при ста микромолях, значительно выше терапевтического диапазона, краситель повреждал отдельные фрагменты ДНК, а красный свет плюс двадцать микромолей красителя создавали синглетный кислород, повреждавший все протестированные фрагменты. Предложенный механизм является гормезисом: слабое образование перекиси запускает антиоксидантные защиты, связанные с Nrf2, и митохондриальный биогенез, поэтому кратковременный прооксидантный сигнал предшествует более длительному антиоксидантному результату. Анализ через один час и анализ через один день могут не совпадать, потому что биология между ними изменилась.

В-третьих, свет определяет, какая молекула вообще присутствует. Освещение деметилирует краситель с образованием Azure B и родственных продуктов, а лампы микроскопа над чашкой достаточно, чтобы сделать его фотосенсибилизатором. Эксперименты в темноте и при освещении — это разные эксперименты, и раздел контроля освещения и обращения с красителем любого протокола должен рассматривать их именно так.

Минимальный набор контролей и как читать любое утверждение

Сравнение ниже является исходным справочным материалом этой статьи. Перед принятием любого результата ROS для метиленового синего проверьте, какие строки авторы заполнили, а какие пропустили.

Из этого следует практическое правило чтения. Amplex с пероксидазой, калибровкой и