EMB-агар и агар MacConkey: выбор и интерпретация сред

Студент делает штриховой посев одного и того же образца воды на две чашки. На одной появляются темные колонии с зеленым металлическим блеском. На другой — ярко-розовые колонии с мутным ореолом. Обе чашки были засеяны из одной пробирки, инкубировались рядом и оценивались в одно и то же время. Студент спрашивает, какая чашка показывает правильный результат.

Правильны обе. Они отвечают на разные вопросы. Путаница возникает, когда эти две среды считают взаимозаменяемыми средствами скрининга кишечных бактерий. Их общая задача — отбирать грамотрицательные кишечные микроорганизмы и разделять ферментирующие лактозу микроорганизмы и неферментеры, однако эта задача реализуется за счет разной химии и разной визуальной логики. Если понять две лежащие в основе концепции, выбор чашки и оценка колоний становятся рутинными.

Краткий ответ

В EMB-агаре используются два красителя, эозин Y и метиленовый синий, которые выполняют сразу две функции: подавляют рост грамположительных микроорганизмов и осаждаются вокруг интенсивных продуцентов кислоты, образуя темные колонии, а в классическом случае Escherichia coli — с металлическим зеленым блеском. В агаре MacConkey эти функции разделены: соли желчных кислот и кристаллический фиолетовый подавляют грамположительные микроорганизмы, лактоза служит субстратом для ферментации, а нейтральный красный показывает образование кислоты в виде розовых или красных колоний. Если задача состоит в наглядной предположительной демонстрации E. coli, EMB хорошо для этого подходит. Если требуется четко разделить ферментирующие лактозу микроорганизмы и неферментеры на розовые и бесцветные колонии, особенно при работе с образцами кала или мочи, MacConkey обычно проще интерпретировать. Ни одна из этих сред не позволяет идентифицировать микроорганизм только по цвету.

EMB: красители одновременно обеспечивают селекцию и индикацию

Концепция EMB объединяет селекцию и индикацию в одних и тех же молекулах. В протоколе ASM по агаровым чашкам с эозином и метиленовым синим EMB описывается как одновременно селективная и дифференциальная среда: пара красителей подавляет многие грамположительные микроорганизмы, а ферментация лактозы вызывает поглощение и осаждение красителей. Стандартная рецептура Levine содержит пептон, лактозу, фосфат, эозин Y, метиленовый синий и агар, как указано в методе FDA BAM для EMB-агара Levine. Обратите внимание: в некоторые более старые рецептуры EMB наряду с лактозой добавляли сахарозу, тогда как EMB Levine содержит лактозу без сахарозы, поэтому следует фиксировать, какая именно рецептура используется в вашей лаборатории.

Интерпретация EMB означает оценку поведения красителей. Интенсивная ферментация лактозы дает достаточно кислоты для выраженного осаждения красителей, поэтому у E. coli образуются темно-сине-черные центры колоний, а в классическом случае — зеленый металлический блеск в отраженном свете. Менее интенсивные ферментеры, такие как Enterobacter и Klebsiella, обычно образуют розовые или фиолетовые слизистые колонии без такого блеска. Неферментеры, такие как Salmonella, Shigella и Proteus, обычно образуют бесцветные или полупрозрачные колонии, поскольку не создают резкого повышения кислотности, необходимого для осаждения красителей. Грамположительные микроорганизмы обычно подавляются, хотя степень подавления может различаться в зависимости от штамма и конкретного продукта. Подробная химия приготовления красителей, включая причины катионного поведения метиленового синего как красителя, относится к отдельному обсуждению рецептур красителей, а общий контекст микроскопии представлен в атласе методов окрашивания. В этой статье рассматриваются выбор чашек и интерпретация результатов.

Приведенный выше рисунок носит иллюстративный характер. Он показывает ожидаемую визуальную логику: темные блестящие колонии, розовые слизистые типы и бледные типы на EMB в сравнении с розовыми и бледными типами на MacConkey. Используйте его для изучения общей картины, а затем подтверждайте каждую интерпретацию по фотографиям контрольных культур и инструкции к конкретной среде, используемой в вашей лаборатории.

MacConkey: раздельные функции, более простое визуальное правило

Концепция MacConkey отводит каждой функции отдельный компонент. Протокол ASM для агаровых чашек MacConkey также рассматривает среду как селективную и дифференциальную, а метод FDA BAM для агара MacConkey перечисляет основные рабочие компоненты: пептоны, лактозу, соли желчных кислот, соль, нейтральный красный, кристаллический фиолетовый и агар. Соли желчных кислот вместе с кристаллическим фиолетовым обеспечивают селекцию против грамположительных микроорганизмов. Лактоза служит субстратом для ферментации. Нейтральный красный действует как индикатор pH и окрашивает участки образования кислоты в розовый или красный цвет; у интенсивных ферментеров иногда также наблюдается осаждение желчных солей.

Правило интерпретации намеренно простое: розовый цвет означает ферментацию лактозы, бесцветные или бледные колонии — отсутствие ферментации. E. coli выглядит розовой или красной, часто с ореолом осажденных желчных солей. Klebsiella и Enterobacter образуют розовые и нередко слизистые колонии из-за наличия капсул. Salmonella, Shigella, Proteus и многие другие грамотрицательные палочки выглядят бесцветными. В учебных лабораториях есть и дополнительное преимущество: соли желчных кислот обычно уменьшают роение Proteus, поэтому на MacConkey проще получить изолированные колонии, чем на неселективных средах, хотя подавление не является абсолютным, а приоритетному контролю роения могут служить бессолевые альтернативы.

Молекулярная причина такого поведения красителей связана с зарядом и структурой. Метиленовый синий представляет собой катионный фенотиазиновый краситель, чьи структура и свойства объясняют его сродство к кислым поверхностям бактерий; то же сродство проявляется при его осаждении в кислых зонах на EMB.

Сравнение в одном месте

| Характеристика | EMB-агар | Агар MacConkey |

| --- | --- | --- |

| Селективная система | Эозин Y плюс метиленовый синий | Соли желчных кислот плюс кристаллический фиолетовый |

| Дифференциальный субстрат | Лактоза (Levine не содержит сахарозу) | Лактоза |

| Индикатор | Само осаждение красителей (темные колонии, зеленый блеск) | Нейтральный красный (розовые или красные колонии при образовании кислоты) |

| Выраженный признак E. coli | Темно-сине-черная колония, часто с металлическим зеленым блеском | Розовая или красная колония, часто с осаждением желчных солей |

| Klebsiella и Enterobacter | Розовые или фиолетовые, слизистые, обычно без блеска | Розовые или красные, часто слизистые |

| Salmonella, Shigella, Proteus | Обычно бесцветные или полупрозрачные | Обычно бесцветные или бледные |

| Грамположительные микроорганизмы | Обычно подавляются | Обычно подавляются в рецептурах с кристаллическим фиолетовым |

| Основная учебная ценность | Наглядное различие интенсивной и слабой ферментации | Наиболее простое разделение ферментеров и неферментеров |

Используйте таблицу как алгоритм выбора. Если в упражнении студентам нужно увидеть градацию интенсивности ферментации с одним особенно выраженным конечным вариантом, это показывает EMB. Если требуется быстрое бинарное разделение перед биохимическим подтверждением, это показывает MacConkey.

Какую среду выбирать для разных образцов

Для учебной работы с водой, направленной на предположительное распознавание фекальных колиформ или E. coli, EMB удобен благодаря визуально характерному блеску. MacConkey также подходит для кишечных грамотрицательных микроорганизмов и исторически применялся при исследовании воды, однако ни одна из этих чашек не заменяет регламентированный метод анализа воды, который в зависимости от теста может требовать такие среды, как modified mTEC или MI. Проверяйте метод, который обязана использовать ваша лаборатория.

Для разделения ферментеров и неферментеров в образцах, моделирующих работу с калом, из этих двух сред обычно полезнее MacConkey. При практической работе с калом на Salmonella или Shigella обычно дополнительно применяют более селективные кишечные среды, такие как XLD или Hektoen enteric, а не полагаются только на MacConkey.

Для учебной работы с мочой, имитирующей клинический рабочий процесс, сочетайте MacConkey с кровяным агаром. MacConkey обеспечивает раннее разделение грамотрицательных микроорганизмов, а кровяной агар позволяет расти организмам, которые подавляются на MacConkey. Такое сочетание стандартно описывается при постановке клинического посева мочи.

Для изучения самих концепций используйте обе среды. EMB показывает, что интенсивность ферментации имеет значение и что одна молекула может выполнять две функции. MacConkey демонстрирует модульную конструкцию: селектор, субстрат и индикатор разделены. Студенты, которые параллельно высевают известную E. coli, известную Klebsiella aerogenes и известную Salmonella на обе среды, после этого редко путают две логические схемы.

Ошибки интерпретации, которые повторяются из семестра в семестр

Самая распространенная ошибка — идентификация только по цвету. Розовая колония на MacConkey может быть E. coli, Klebsiella, Enterobacter или другим ферментером. Бесцветная колония может быть Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas или другим неферментером. Цвет — это скрининговый фенотип, который определяет направление последующего подтверждения с помощью окраски по Граму, оксидазного теста, биохимических панелей или инструментальной идентификации, а не название вида.

Вторая ошибка — чрезмерное значение отсутствия блеска. Некоторые настоящие колонии E. coli, особенно изолированные, дают слабый металлический блеск или не дают его вовсе на EMB. Отсутствие блеска не исключает E. coli, а его наличие не доказывает идентичность. Рассматривайте блеск как предположительный признак.

Третья ошибка — сравнение чашек разного возраста. Медленные ферментеры лактозы могут становиться розовыми на MacConkey после длительной инкубации, из-за чего четкое разделение на ферментеры и неферментеры размывается. Оценивайте чашки в установленное лабораторией время и фиксируйте продолжительность инкубации вместе с результатом.

Четвертая ошибка — интерпретация смешанного роста как одного микроорганизма. Розовая колония рядом с бесцветной отражает два фенотипа, а не промежуточный вариант. Отбирайте хорошо изолированные колонии и исследуйте каждый морфотип отдельно. Слизистая текстура создает похожую ловушку: и Klebsiella, и Enterobacter могут выглядеть слизистыми, поэтому одна только капсула не позволяет определить название. Микроорганизм, который раньше преподавали как Enterobacter aerogenes, теперь классифицируется как Klebsiella aerogenes, что объясняет расхождения между старыми таблицами и современными обозначениями.

Контроли и итоговое правило

В каждом сеансе используйте сфотографированные или свежие контроли: E. coli для реакции интенсивного ферментера, Klebsiella aerogenes для слизистой ферментации без классического блеска, штамм Salmonella для бесцветной реакции неферментера и Staphylococcus aureus для подтверждения подавления грамположительных микроорганизмов на конкретном используемом продукте. Сверяйте номера штаммов и критерии приемлемости с инструкцией производителя, поскольку селективность меняется в зависимости от содержания желчных солей, кристаллического фиолетового и красителей.

За рабочим столом достаточно помнить одно правило. В EMB красители одновременно обеспечивают селекцию и индикацию, что дает ярко выраженный признак E. coli ценой более тонкой интерпретации. В MacConkey функции селекции и индикации разделены, что дает простое разделение на розовые и бледные колонии ценой меньшей детализации ферментации. Выбирайте среду, концепция которой соответствует поставленному вопросу, подтверждайте цвет соответствующими тестами, и тогда эти две чашки перестают конкурировать и начинают дополнять друг друга.