Анализы дрожжей с метиленовым синим: подсчёт живых клеток против измерения дыхания

На лабораторном столе стоят две пробирки. Обе синие. В одной синие клетки под микроскопом означают мёртвые дрожжи. В другой пробирка, переходящая из синего цвета в бесцветный, означает, что дрожжи живы и осуществляют дыхание. Один и тот же краситель, противоположные результаты. Если перепутать два анализа, все выводы меняются на противоположные.

В этом и заключается основная тема статьи. Метиленовый синий — это окислительно-восстановительный краситель: в окисленной форме он синий, а в восстановленной — бесцветный лейкометиленовый синий. Подсчёт жизнеспособности использует эту химию в виде краткого микроскопического снимка. Эксперимент с дыханием использует её в объёмной реакции, измеряемой во времени. Каждый метод требует собственного протокола, собственных контрольных образцов и собственного критического подхода.

Подсчёт жизнеспособности: короткое окрашивание с немедленным анализом

Протокол в стиле пивоварения является наиболее стандартизированной версией метода. Приготовьте 0,01% мас./об. метиленового синего в 2% цитрате натрия, смешайте его 1:1 с суспензией дрожжей и исследуйте смесь после короткого фиксированного интервала. Опубликованные интервалы варьируются от 1 до 2 минут в руководстве Brewing Science Institute до примерно 5 минут в исследовательских протоколах, а методе микробиологии вина OIV требуется исследование в течение 10 минут. Концентрация красителя в счётной смеси составляет около 0,005%. Загрузите камеру улучшенного Нойбауэра и примерно при 400-кратном увеличении классифицируйте тёмно-синие клетки как нежизнеспособные, а неокрашенные клетки — как жизнеспособные. Светло-синие клетки считаются живыми в методе OIV, что уже указывает на проблему субъективности, рассмотренную ниже.

Концентрация клеток определяется геометрией камеры. При подсчёте полного центрального квадрата размером 1 мм количество клеток на мл равно N, умноженному на коэффициент разведения и на 10^4, где N — число клеток в этой области, как указано в методах ASBC для дрожжей. Жизнеспособность рассчитывается проще: количество неокрашенных клеток делится на общее количество клеток и умножается на 100. Подсчитайте около 400 клеток для оценки жизнеспособности, следуя исследованию сравнения дрожжей FEMS и практике OIV. Используйте одно правило для границ постоянно, например учитывайте клетки на нижних и левых линиях сетки и исключайте клетки на верхних и правых.

Перед началом подсчёта необходимо определить правило для почкующихся клеток. Распространённое соглашение считает почку отдельной клеткой, когда она достигает примерно половины размера материнской клетки, при этом материнская клетка находится ниже неё. Какое бы правило ни было выбрано, применяйте его к каждому квадрату и записывайте его в рабочий лист, чтобы следующий человек повторил процедуру.

Лист подсчёта (распечатать)

Этот лист является оригинальным материалом для данной статьи. Скопируйте его в блокнот или распечатайте по одному экземпляру на каждый образец.

Жизнеспособность (%) = 100 x неокрашенные / (неокрашенные + тёмно-синие). Общее количество клеток на мл = N x коэффициент разведения x 10^4, где N получено из определённой области камеры. Записывайте интервал окрашивания рядом с результатом, поскольку число жизнеспособности без указания времени не является воспроизводимым.

Почему показатели жизнеспособности изменяются

Время является первым фактором помех, и оно действует в обоих направлениях. Метаболически активные клетки восстанавливают краситель, поэтому слишком раннее считывание может обнаружить живые клетки до завершения восстановления и ошибочно классифицировать их как мёртвые. Но длительное воздействие само по себе токсично и создаёт действительно повреждённые синие клетки, вызывая ложное окрашивание смерти. Поэтому учебный лабораторный протокол устанавливает подсчёт в течение 5 минут, как описано в учебном протоколе по дрожжам Wisconsin. Корректная формулировка состоит в том, что оценка метиленовым синим зависит от времени, поэтому необходимо выбрать один короткий интервал и сохранять его постоянным для каждого образца серии.

Образцы с низкой жизнеспособностью имеют второй источник смещения. Стандартизированный метод предупреждает, что метиленовый синий может завышать истинную жизнеспособность ниже примерно 80%, поскольку клетки, которые всё ещё восстанавливают краситель, не обязательно сохраняют способность к размножению. Пивоваренная литература описывает такую же ненадёжность при существенном снижении жизнеспособности. Рассматривайте метиленовый синий как быстрое приблизительное измерение и подтверждайте критические решения при низкой жизнеспособности, например повторное внесение культуры, подсчётом на чашках или дополнительным окрашиванием.

На третьем месте находятся эффекты матрицы. Метод OIV работает примерно при pH 4,6 и предупреждает, что сильно буферизованные образцы с низким pH препятствуют корректному поведению красителя, а также не рекомендует использовать анализ выше 100 г/л сахара, где клетки могут выглядеть ошибочно светло-синими. Экспериментальное сравнение pH окрашивания выявило существенно изменённую чувствительность в исследованном диапазоне, что согласуется с исследованием метода метиленового синего, зависящего от pH. Загрязнения являются отдельной проблемой: окрашенные частицы в грязных суспензиях имитируют мёртвые клетки и увеличивают различия между операторами.

Такая вариативность измерена количественно, а не является просто наблюдением. В шестимесячном испытании на пивоваренном производстве, описанном в сравнении дрожжей FEMS, дублированные измерения метиленовым синим имели среднее стандартное отклонение 6,1% против 0,2% для проточной цитометрии с оксонолом, а два оператора отличались до 13 процентных пунктов при работе с одним и тем же образцом. Количественное сравнение методов оценки жизнеспособности 2023 года показало, что флуоресцентная микроскопия и проточная цитометрия значительно точнее, при этом эффективность зависит от вида и матрицы. Классическое описание метода Painting и Kirsop (PMID 24430080) остаётся отправной точкой, а более широкий обзор анализов жизнеспособности и активности дрожжей (PMID 25154541) относит метиленовый синий к дополнительным, а не окончательным тестам. Трипановый синий не является автоматическим улучшением: он показывает потерю целостности мембраны, тогда как метиленовый синий отражает поглощение красителя плюс восстановительную активность, поэтому стрессированные клетки могут классифицироваться по-разному при использовании двух красителей.

Эксперимент с дыханием: измерение исчезновения синего цвета во времени

Второй анализ никогда не включает просмотр через микроскоп. Дрожжи плюс глюкоза плюс разбавленный метиленовый синий помещаются в закрытую пробирку, а секундомер измеряет, сколько времени требуется для исчезновения синего цвета. При метаболизме клетки создают восстановительные эквиваленты, которые переводят синий краситель в бесцветную форму, тогда как растворённый кислород повторно окисляет его. После снижения содержания кислорода клетками преобладает суммарное восстановление, и пробирка обесцвечивается. Поэтому конечная точка отражает баланс дыхания, концентрации красителя и доступности кислорода и должна описываться как время восстановления или обесцвечивания метиленового синего, а не как прямое значение потребления молекулярного кислорода.

Используйте значительно более разбавленный краситель, чем в работе с жизнеспособностью, чтобы время попадало в удобный диапазон. Руководство обязательных практических работ AQA A level хорошо стандартизирует этот процесс: 1 г глюкозы на 100 мл воды, нагретой примерно до 30 C, 5 г сухих дрожжей, добавленных непосредственно перед использованием, и рабочий краситель около 0,001%, приготовленный разведением 0,1 мл 1% исходного раствора до 100 мл. Смешайте 2 мл суспензии дрожжей с глюкозой с 2 мл рабочего красителя, уравновесьте температуру, встряхните один раз в течение 10 секунд, запустите таймер и больше не встряхивайте. Встряхивание повторно вводит кислород и возвращает синий цвет в пробирку, что является крупнейшим процедурным артефактом. AQA отмечает, что подготовка обычно должна обесцвечиваться примерно за 5 минут при 35 C, с опытными средними значениями 275 с при 20 C, 128 с при 35 C и 145 с при 45 C. Это примеры одной установки, а не универсальные нормы. Количественная связь между скоростью восстановления и метаболически активными дрожжами при контролируемых условиях подтверждается специальными исследованиями восстановления, включая работу с индексом PMID 25773544 и механистическое исследование в Yeast (2014).

Демонстрация временного ряда (оригинальный материал)

Таблица ниже является оригинальной демонстрацией, подготовленной для этой статьи с использованием установки в стиле AQA, описанной выше: 2 мл смеси дрожжей с глюкозой плюс 2 мл рабочего красителя около 0,001%, одно встряхивание в течение 10 секунд, затем неподвижная инкубация. Значения являются примерными показаниями в формате, который должна записывать учебная группа, а индекс скорости определяется как 1, делённое на время обесцвечивания в секундах. Используйте те же пробирки и замените эти значения измеренными.

Постройте график индекса скорости относительно температуры для пробирок A, B и C. Кривая возрастает, затем выравнивается или снижается, что соответствует ожидаемому ферментативно обусловленному поведению, а не прямой линии. Пробирки D, E и F не являются точками данных на этой кривой. Это контрольные образцы, которые делают кривую интерпретируемой.

Контрольные образцы, делающие каждый анализ значимым

Каждый эксперимент с дыханием требует трёх дополнительных образцов. Кипячёные или убитые дрожжи плюс глюкоза плюс краситель должны оставаться синими, показывая, что быстрое восстановление зависит от живого метаболизма. Живые дрожжи плюс краситель без добавленной глюкозы являются контролем субстрата, но всё равно ожидайте медленного обесцвечивания, поскольку дрожжи используют внутренние запасы. Глюкоза плюс краситель без дрожжей является химическим холостым контролем, необходимым потому, что щелочная глюкоза может восстанавливать метиленовый синий без клеток.

Подсчёт жизнеспособности требует другого типа контроля: постоянства процедуры. Один и тот же исходный раствор красителя, одно и то же соотношение смешивания, один и тот же интервал окрашивания, одна и та же область камеры, одни и те же правила для почек и границ, подсчёт вслепую, когда возможно