مقاله
میتیلین بلو د DNA او RNA د رنګولو لپاره: په جېلونو او غشاګانو کې کارونې
یو زدهکوونکی په اګاروز جېل کې الکتروفورېز کوي، په میتیلین بلو یې رنګوي، او هلته چې یې د یوې روښانه پټې تمه لرله، هېڅ نه ویني. په څنګ کاري ځای کې، د دوکتورا وروسته یو څېړونکی د هماغه آبي بوتل په رنګ یوه Northern غشا رنګوي او په درې دقیقو کې څرګندې رایبوزومي پټې ترلاسه کوي. زدهکوونکی دې پایلې ته رسېږي چې جېل ناکام شوی دی. جېل ناکام شوی نه و. دواړه دندې توپیر درلود، او هماغه رنګ یې په بېلابېل حساسیت، بېلابېل شالید او د ورپسې پړاوونو په بېلابېلو اصولو ځوابوي.
د میتیلین بلو په وسیله د DNA او RNA رنګول ګډه کیمیا لري، خو موخه یې یوه نه ده. په جېل کې رنګ ښيي چې په یوه سوری لرونکي ماتریکس کې څومره نوکلېیک اسید شته. پر غشا بیا ښيي چې لېږد بریالی شوی که نه، او ایا په مسیرونو کې یو شان اندازه نمونه اچول شوې ده. کله چې دا توپیر روښانه شي، کړنلارې، د کشف حدونه او د سازګارۍ محدودیتونه هم روښانه کېږي.
لنډ ځواب
میتیلین بلو یو هوار کاتیوني رنګ دی چې له نوکلېیک اسیدونو سره په غیرکووالنټ او بېرته ګرځېدونکي ډول نښلي. دا نښلېدل فاسفېټ ته د الکتروستاتیک کشش، د بېس جوړو ترمنځ د ورننوتلو او له کوچني شیار سره د تړاو د ګډې اغېزې له لارې کېږي. همدا بېرته ګرځېدونکی والی مهم دی. پټې رنګېدای شي، په لیدو وړ رڼا کې ثبتېدای شي، او بیا یې رنګ لرې کېدای شي یا د کلون کولو، هایبریډایزېشن یا بیا پروب کولو لپاره پاکېدای شي.
په اګاروز جېل کې د دوهرشتهیي DNA د میتیلین بلو رنګولو معیاري چټکه نسخه په اوبو کې 0.02 سلنه w/v (200 micrograms په هر mL کې) ده؛ شاوخوا 15 دقیقې رنګول او ورپسې شاوخوا 15 دقیقې په اوبو کې د رنګ لرې کول، او بیا د سپینې رڼا پر بکس کتل. د غشاګانو لپاره، د Northern بلاټ دودیزه نسخه د pH 5.2 په شاوخوا کې په سوډیم اسېټېټ کې له 0.02 تر 0.04 سلنې رنګ دی؛ له لېږد او ثابتولو وروسته څو دقیقې رنګول، بیا په اوبو مینځل او تر هایبریډایزېشن مخکې د رنګ بشپړ لرې کول. حساسیت محدود دی: په ښو شرایطو کې د هرې جېل پټې لپاره له لسګونو تر سلګونو nanograms پورې، او محافظهکار لارښودونه له 0.5 تر 1 microgram پورې ښيي. دا د اېتیډیم برومایډ او SYBR رنګونو په پرتله د مقدار له پلوه څو مرتبې لوړ دی. پر غشاګانو د یوه ځانګړي ټرانسکرېپټ لپاره د کشف کوم ګټور واحد حد نشته، ځکه رنګ تر ډېره پرېمانه رایبوزومي RNA او ټول اچول شوي مواد ښيي. په هېڅ یوه نسخه کې د پرچون پلور د غذایي مکمل محلول مه کاروئ. تایید شوې طریقې د تحلیلي درجې رنګ، ټاکلي بفرونه، او چېرې چې RNA کارول کېږي، له RNase څخه پاکه اداره فرضوي.
نښلېدل څنګه کېږي، او چېرې ناسم برداشت رامنځته کوي
ګټور ماډل درې برخې لري. لومړی، د مثبت چارج لرونکی حلقوي سیستم د منفي چارج لرونکي فاسفېټ ملا تیر ته جذبېږي. سپېکټروسکوپي څېړنې ښيي چې په ټیټه مالګینۍ کې دا الکتروستاتیک اغېز غالب وي، خو ماډل جوړونه او مالیکولي ډینامیک د بېس جوړو ترمنځ ورننوتل او له کوچني شیار سره نښلېدل د دوهرشتهیي DNA لپاره ثابتې بڼې ګڼي، لکه څنګه چې له DNA سره د میتیلین بلو د نښلېدو په یوه سپېکټروسکوپي څېړنه کې لنډیز شوي دي. دویم، د GC لپاره یو څه ترجیح شته؛ ماډل جوړونه د CpG او GpC پرلهپسې بېسونه غوره ګڼي، او تجربې د میتیلین بلو د ورننوتلو د ترجیحاتو په څېړنه کې له GC څخه بډایه دوهرشتهیي جوړښتونو سره غوره تړاو راپوروي، خو له AT دوهرشتهیي جوړښتونو سره هم نښلېدل کېږي. معمول رنګول د ځانګړي ترتیب لپاره اختصاصي نه دي. درېیم، یورشتهیي DNA او RNA تر ډېره د الکتروستاتیکو اړیکو او له لاسرسي وړ بېسونو او دوهرشتهیي سیمو سره د طبقو جوړولو له لارې نښلي؛ له همدې امله د رنګولو شدت د اوږدوالي، ترتیب او ثانوي جوړښت له مخې بدلېږي.
له دې څخه دوه پایلې راوتلې دي. ځکه چې نښلېدل غیرکووالنټ دي، رنګ په مینځلو وځي. د پولیاکریلامایډ پټې ژر کمرنګه کېږي، مګر دا چې په قصدي ډول ثابتې شي. د دایمي ثابتولو یوه ځانګړې بڼه په همدې دلیل شته چې عادي رنګول لنډمهالي دي، لکه څنګه چې Soto او Draper د PAGE جېلونو لپاره تشریح کړې ده. ځکه چې دا رنګ رڼا ته حساسیت ورکوونکی دی، د اکسیجن په شتون کې د رنګ شوي DNA اوږده او روښانه رڼا کول کولای شي ګوانین اکسید کړي او بالاخره په رشتو کې پرېکونونه رامنځته کړي؛ دا میکانیزم د میتیلین بلو په حساسولو سره د ګوانین د اکسیدېدو په څېړنه کې په تفصیل بیان شوی دی. په سپینه رڼا کې لنډ کتل د اېتیډیم برومایډ د دودیزو کاري بهیرونو له مشهور UV زیان څخه مخنیوی کوي، او د چمتووالي لپاره د DNA په بېرته ترلاسه کولو کې دا ګټه رښتینې ده. د لیدو وړ رڼا نرم اغېز لري، خو بېزیانه نه ده. که DNA به کلون کېږي، د رڼا وخت لنډ وساتئ. د دې احتیاط تر شا د پراخې فوتوکیمیا لپاره، د میتیلین بلو په فوتوکیمیا کې دوه لارې وګورئ. د هغې رېډوکس جوړې او چارج حالتونو لپاره چې تشریح کوي ولې اکسید شوې بڼه نښلي او احیا شوې بڼه نه نښلي، د میتیلین بلو د جوړښت او ځانګړنو کیمیا وګورئ.
لومړۍ دنده: د جېلونو دننه رنګول
د جېل رنګول یوې پوښتنې ته ځواب وايي: ایا په دې پټه کې دومره نوکلېیک اسید شته چې په سترګو ولیدل شي؟ په اګاروز کې دوهرشتهیي DNA تر ټولو ښه څېړل شوې بېلګه ده. د Flores او همکارانو د میتیلین بلو د جېل اصلي طریقې په 1 سلنه اګاروز کې د 0.02 سلنې چټکه کړنلاره تایید کړه او وروسته یې د DNA بریالی بېرته ترلاسه کول او کلون کول وښودل. همدا د عرضهکوونکي کړنلاره د IBI Scientific د میتیلین بلو د محصول پر پاڼه هم شته، چې د غشا لپاره د 0.04 سلنې نسخه او د جېل چټکه بڼه څنګ په څنګ ښيي.
عملي کاري بهیر:
- د جېل الکتروفورېز د معمول په ډول ترسره کړئ. له الکتروفورېز وروسته یې رنګ کړئ، نه د هغه پر مهال، مګر دا چې د بدلې شوې طریقې لپاره لېږد یا د بېلولو وړتیا تایید شوې وي.
- جېل په مقطرو اوبو کې د 0.02 سلنې w/v میتیلین بلو په محلول کې د شاوخوا 15 دقیقو لپاره ډوب کړئ او په نرمۍ یې وخوځوئ.
- اوبه څو ځله بدلې کړئ او په ټولیز ډول شاوخوا 15 دقیقې رنګ لرې کړئ، تر څو د ماتریکس شالید کم شي او پټې څرګندې شي.
- ژر د سپینې رڼا پر روښانوونکي عکس واخلئ.
اګاروز او پولیاکریلامایډ بېلابېل چلند لري. اګاروز په ماتریکس کې رنګ ساتي، نو د رنګ لرې کول ورو پړاو دی. نري پولیاکریلامایډ جېلونه ژر رنګېږي، خو رنګ هم ژر له لاسه ورکوي؛ دا د چمتووالي لپاره د پټو له پرې کولو سره مرسته کوي، خو د اوږدمهالو ثبتونو لپاره ښه نه دي. په پولیاکریلامایډ کې مصنوعي اولیګونوکلېوټایډونه د هماغې 0.02 سلنې نسخې په وسیله، له پرلهپسې اوبو مینځلو سره، په 20 تر 30 دقیقو کې موندل کېدای شي، د Current Protocols په سبک د منل شویو PAGE طریقو له مخې. د چمتووالي لپاره د اولیګونو د رنګولو ډېرې رقیقې بڼې، په رقیق TBE کې شاوخوا 0.0002 سلنه او د څو ساعتونو لپاره، راپور شوې دي، خو د شواهدو بنسټ یې کمزوری دی.
د DNA او RNA توپیر مهم دی. دوهرشتهیي DNA تر ټولو پیاوړی منظم نښلېدل برابروي. RNA او یورشتهیي DNA رنګېږي، خو کمزوري او لږ د وړاندوینې وړ وي. د فارمالډیهایډ اګاروز RNA جېلونو لپاره، ډېری لابراتوارونه د جېل دننه آبي رنګول پرېږدي او لومړی RNA غشا ته لېږدوي، بیا یې هلته رنګوي. په دې کار سره د جېل کمزوری سیګنال د غشا په څرګند سیګنال او د اچول شوې نمونې په ثبت بدلېږي.
دویمه دنده: پر غشاګانو رنګول
د غشا رنګول بلې پوښتنې ته ځواب وايي: ایا لېږد بریالی شوی، او ایا مسیرونه د پرتلې وړ دي؟ دودیزه کارونه یې د Herrin او Schmidt د Northern بلاټ بېرته لرې کېدونکی رنګ دی؛ په اصل کې 0.04 سلنه رنګ په 50 mM سوډیم اسېټېټ کې، په pH 5.0، د 2 تر 3 دقیقو لپاره، ورپسې په اوبو مینځل، او تر هایبریډایزېشن مخکې په SSPE کې د رقیق SDS په وسیله د رنګ لرې کول.
هغه اوسنۍ بڼه چې پراخه کارول کېږي، داسې ترسره کېږي:
- RNA یا دناتوره شوی DNA نایلون یا نایتروسلولوز ته ولېږدوئ، بیا یې د UV په وسیله په متقابل نښلولو یا تودولو ثابت کړئ، څو نمونه د رنګولو پر مهال له لاسه ولاړه نه شي.
- اختیاري خو عام پړاو: غشا د شاوخوا 15 دقیقو لپاره په 5 سلنه اسېټیک اسید کې لمده کړئ.
- له 5 تر 10 دقیقو پورې یې په 0.02 تر 0.04 سلنه میتیلین بلو کې رنګ کړئ، چې د pH 5.2 په شاوخوا کې په 0.3 تر 0.5 M سوډیم اسېټېټ کې وي.
- له 5 تر 15 دقیقو پورې یې په اوبو ووینځئ او رنګ یې لرې کړئ، ثبت یې کړئ، بیا تر هایبریډایزېشن مخکې پاتې رنګ لرې کړئ.
په Northern کار کې مثبت چارج لرونکی نایلون تر ټولو ډېر کارول کېږي. نایتروسلولوز هم د اسېټیک اسید او اسېټېټ له همدغه کاري بهیر سره کار کوي. انځور د لېږد د تایید، د 28S او 18S پټو د پرتلې (یا د باکتریایي RNA لپاره د 23S او 16S)، د اندازې زینو او معیارونو د نښه کولو، او د ټول RNA د نږدې نورمالسازۍ د ثبت ساتلو لپاره کارول کېږي. خپرې شوې Northern طریقې د نمونې د اچول شوي مقدار د کتنې لپاره د رنګ شویو رایبوزومي پټو مقدار اندازه کوي؛ په دې کې د لبنیاتو د علم هغه څېړنه هم شامله ده چې د نورمالسازۍ لپاره یې د میتیلین بلو رایبوزومي پټې کارولې دي. Southern غشاګانې هم په همدې ډول لیدل کېدای شي، خو دا رنګ د Northern د نمونې مقدار او لېږد د کتنې لپاره ډېر زیات دود شوی دی. سربېره پر دې، Southern DNA تر لېږد مخکې دناتوره کېږي، نو د جېل د حساسیت شمېرې پرې نه شي پلي کېدای.
د کشف حدونه او شالید: چېرې آبي رنګ کمزوری دی
لاندې پرتله په قصدي ډول اټکلي ده. د رنګ فعالیت د جېل په سلنه، د پټې په پلنوالي، نوري وسایلو او د رنګ لرې کولو په منظم ترسره کولو پورې اړه لري. هره شمېره د مقدار د مرتبې په توګه وګڼئ، نه د یوې ټاکلې ځانګړنې په توګه.
| رنګ او بڼه | په هره پټه کې د کشف اټکلي مقدار | تفسیر |
|---|---|---|
| میتیلین بلو، په اګاروز کې dsDNA | په غوره شوو شرایطو کې له 40 تر 250 ng؛ په محافظهکار اټکل کې له 0.5 تر 1 microgram | د چمتووالي لپاره د نمونې مقدارونو او ښوونیزو جېلونو لپاره بسنه کوي. د ډېر کم مقدار پټو لپاره کمزوری دی. |
| میتیلین بلو، په PAGE کې لنډ ssDNA یا RNA یا اولیګوګان | نږدې له 0.1 تر 0.5 microgram | په اوږدوالي او جوړښت پورې تړلی دی. یو ټولیز حد نه لري. |
| اېتیډیم برومایډ، په اګاروز کې dsDNA | شاوخوا له 1 تر 10 ng | د Flores په پرتله کې د غوره شوو شرایطو له آبي رنګ څخه نږدې څلور چنده حساس دی. UV ته اړتیا لري. |
| SYBR Green I، dsDNA | شاوخوا 60 pg | د فلورېسنس انځور اخیستل اړین دي. |
| SYBR Gold، DNA او RNA | شاوخوا 25 pg | په څو بڼو کې له اېتیډیم برومایډ څخه تر لس چنده ډېر حساس دی. |
| د سپینو زرو رنګ، په PAGE کې نوکلېیک اسیدونه | شاوخوا له 0.3 تر 0.9 ng؛ د آبي رنګ او ورپسې د سپینو زرو رنګ په یوه غوره شوې لړۍ کې 100 pg RNA راپور شوی | ډېر حساس دی، خو کیمیاوي بهیر یې پېچلی دی او د بېرته ترلاسه کولو لپاره مناسب نه دی. |
| تولویډین بلو، په PAGE کې RNA او اولیګوګان | کاري مقدارونه یې سلګونه ng دي؛ شاوخوا 250 ng مستند شوی | د میتیلین بلو په څېر په لیدو وړ رڼا کې کتل کېږي، خو د SYBR له مشخصاتو سره د پرتلې وړ معیاري حد نه لري. |
د شالید کنټرول ټاکي چې محدود سیګنال د کارولو وړ دی که نه. ازاد رنګ ډېر ژور رنګ لري، نو د پټو او شالید ترمنځ توپیر د نا تړلي رنګ له لرې کولو څخه رامنځته کېږي، بې له دې چې تړلی رنګ لرې شي. ډېر غلیظ رنګ په ندرت سره حساسیت زیاتوي. تر ډېره د رنګ لرې کولو وخت زیاتوي. په هماغه جېل، غشا او کامره کې د پرلهپسې رقیقولو لړۍ وازمویئ، او یوازې هغه محدوده وکاروئ چې ټولیز کثافت پکې د اچول شوي مقدار په تناسب پاتې کېږي. میتیلین بلو د نمونې د اچول شوي مقدار نیمهکمّي نورمالسازۍ ته زمینه برابروي. دا د پراخې ډینامیکي محدودې کمّي ازموینه نه ده، ځکه د غشا ظرفیت، د لېږد موثریت، اشباع او د رنګ لرې کول له یوه مسیر څخه بل ته توپیر کوي.
د سازګارۍ محدودیتونه: له رنګولو وروسته څه د کار وړ پاتې کېږي
له آبي رنګولو وروسته کلون کول ښودل شوي دي. Flores او همکارانو د اګاروز رنګ شوې پټې پرې کړې، DNA یې بېرته ترلاسه کړ، ونښلاوه او حجرو ته یې ولېږداوه؛ دوی د UV سره د اېتیډیم برومایډ له کارولو وروسته په پرتله ښه کلون کول راپور کړل. احتمالي دلیل یې د رڼا لږ زیان دی، نه خپله د رنګ کومه ګټه. د سپینې رڼا تماس لنډ وساتئ او بېرته ترلاسه شوی DNA د جېل د استخراج له عادي پاکولو څخه تېر کړئ.
د PCR او ترتیب ټاکلو لپاره شواهد لږ دي. پاتې رنګ له نوکلېیک اسیدونو سره نښلي، نو تر انزایمي پړاوونو مخکې رنګ لرې کړئ او نمونه پاکه کړئ. تمه کېږي چې له آبي جېل څخه په سمه توګه پاک شوی DNA کار وکړي، خو دا په ښه ډول نه ده اندازه شوې چې بېلابېل پولیمېرازونه او د ترتیب ټاکلو کیمیاوې په مستقیم ډول د ورسره پاتې رنګ څومره مقدار زغملای شي. دا زغم له مخکې مه فرضوئ.
د بلاټ هایبریډایزېشن هغه وخت سازګار دی چې ترتیب یې په کلکه مراعات شي: لېږد، ثابتول، رنګول، ثبتول، د رنګ لرې کول، هایبریډایزېشن. همدا لړۍ د Herrin او Schmidt طرحه ده. تر لېږد مخکې رنګول، یا د رنګ لرې کولو پرېښودل، بله طریقه ده او خپل تایید ته اړتیا لري. د رنګ له لرې کولو وروسته، د پروب معیاري لرې کول او بیا پروب کول د معمول په ډول ترسره کېږي. د همدې رنګ کورنۍ په وسیله د حجرو په کچه د رنګولو لپاره، او دا چې ولې د ثابت شوي فلم منطق د ژوندیو حجرو طریقو ته نه شي لېږدول کېدای، د مایکروسکوپي رنګولو اطلس وګورئ.
د پټو پرې کول د چمتووالي لپاره په اګاروز او هغو PAGE اولیګوګانو کې کار کوي چې په آبي رنګ موندل شوي وي، په دې شرط چې د دایمي ثابتولو بڼه ونه کارول شي. د رنګ له لرې کولو وروسته په برېښنايي ډول راایستل د یوه بېرته ګرځېدونکي نښلېدونکي لپاره له کیمیاوي پلوه معقول دي، خو په ځانګړي ډول د میتیلین بلو لپاره د ترلاسه شوي مقدار کنټرول شوي معلومات لږ دي. له راایستلو وروسته مالګې لرې کړئ یا نمونه رسوب کړئ.
تکرارېدونکې ناکامۍ
کمرنګه جېل پټې معمولاً دا معنا لري چې د رنګ پر بنسټ د کشف لپاره کتله ډېره کمه ده، په ځانګړي ډول د لنډو یورشتهیي یا RNA موخو لپاره. د نمونې مقدار زیات کړئ، تازه رنګ وکاروئ، د غلظت تر لوړولو مخکې د رنګولو وخت وغځوئ، او د رنګ لرې کول ژر ودروئ. یو بشپړ آبي جېل چې پټې پکې له شالید سره توپیر نه لري، معمولاً د زیات رنګولو یا د اوبو د لږ بدلون معنا لري. د PAGE د پټو کمرنګه کېدل د تمې وړ کیمیا ده، نه ناکام رنګول. ژر عکس واخلئ. د غشا نابرابر شالید د قاتونو، حبابونو، د ګوتو نښو، نابرابر خوځولو یا ټوټهټوټه لېږد نښه ده. د هایبریډایزېشن له کنټرول پرته یې د نمونې د نابرابر اچول شوي مقدار په معنا مه اخلئ. یوه خپره او کمزورې رایبوزومي بڼه د تخریب معنا لرلای شي، خو د نیمګړي لېږد، د ټول RNA د ډېر کم مقدار (معمول مسیرونه له څو تر لسګونو micrograms پورې لري)، یا د رنګ د ډېر لرې کولو له امله هم کېدای شي. رنګ پرېمانه رایبوزومي RNA ښيي. یو ځانګړی ټرانسکرېپټ نه ښيي. دا دنده د پروب ده.
خوندیتوب او سمبالول، بې له مبالغې
د میتیلین بلو سمبالول د اېتیډیم برومایډ په پرتله اسانه دي، خو بېزیانه نه دی. د MilliporeSigma د خوندیتوب د معلوماتو یوه اوسنۍ پاڼه دا رنګ د خولې له لارې د حاد زهریت په Category 4 کې طبقهبندي کوي، چې د تېرولو په صورت کې زیانمن دی، او د Sigma-Aldrich د میتیلین بلو SDS له مخې باید د کثافاتو د یوې منظورې لارې له مخې دفع شي. اېتیډیم برومایډ د جنتیکي موادو د زیان په اړه پیاوړي خبرداري لري، چې په Sigma-Aldrich د اېتیډیم برومایډ SDS کې پر تناسلي حجرو شکمنې اغېزې هم پکې شاملې دي. د هغه جېلونه او محلولونه معمولاً د خطرناکو کیمیاوي کثافاتو په توګه جلا ساتل کېږي، لکه څنګه چې د Thermo Fisher د نوکلېیک اسیدونو د رنګ لارښود یادونه کوي. د دواړو لپاره SDS او د ادارې اصول تعقیب کړئ. وچ رنګ په کلک تړلي لوښي کې او وچ وساتئ، کاري رنګ یوازې د کړنلارې د اجازې له مخې بیا وکاروئ، رنګ شوې غشاګانې د فلټر پاڼو ترمنځ وچې وساتئ، او مخکې له دې چې پټې د خپرېدو له امله ورکې شي، د جېلونو عکسونه واخلئ.
د لابراتوار د کار دا لنډه جمله په یاد وساتئ. جېلونه په سپینه رڼا کې د نمونې په لوړ مقدار کې د لیدلو وړتیا ازمويي. غشاګانې مخکې له دې چې پروب حساس کار ترسره کړي، لېږد او د نمونې اچول شوی مقدار ازمويي. یو رنګ دواړو ته کار ورکوي، خو حساسیت یې محدود، نښلېدل یې بېرته ګرځېدونکي، او د عملیاتو ترتیب یې کلک دی.